PLoS ONE: fosfoproteom Analyse af Invasion og metastase-faktorer i kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Mekanismer for unormal protein fosforylering, der regulerer celle invasion og metastase i bugspytkirtelkræft forbliver uklar. I denne undersøgelse, brugte vi high-throughput fosforylering array til at teste to bugspytkirtelkræft cellelinier (PC-1-celler med en lav, og PC-1,0 celler med et stort potentiale for invasion og metastase). Vi bemærkede, at i alt 57 proteiner afslørede en differentieret udtryk (fold ændring ≥ 2,0). Seks kandidat-proteiner blev yderligere valideret af western blot med resultater fundet at være overensstemmelse med arrayet. Af 57 proteiner, 32 opreguleret proteiner (f.eks CaMK1-a og P90RSK) var hovedsageligt involveret i ErbB og neurotrophin signalveje, som bestemt ved hjælp af DAVID software, mens 25 ned-regulerede proteiner (f.eks BID og BRCA1) blev stærkt involveret i apoptose og p53 signalveje. Desuden blev fire proteiner (Akt1-, Chk2, p53 og p70S6k) med forskellige phosphoryleringssteder fundet, ikke kun blandt opreguleres, men også blandt nedreguleret proteiner. Vigtigt er det, kan specifikke phosphoryleringssteder påvirke celle biologiske funktioner. CentiScaPe software beregnet topologiske karakteristika for hver node i protein-protein interaktion (PPI) netværk: Vi fandt, at Akt1 ejer de maksimale node grader og betweenness i opregulering protein PPI netværk (26 noder, gennemsnitlige vejlængde: 1,89, node grader : 6,62 ± 4,18, betweenness: 22,23 ± 35,72), og p53 i nedregulering protein PPI-netværk (17 noder, gennemsnitlige vejlængde: 2,04, node grader: 3,65 ± 2,47, betweenness: 16,59 ± 29,58). Afslutningsvis kan identifikationen af ​​unormal protein fosforylering relateret til invasion og metastase tillade os at identificere nye biomarkører i et forsøg på at udvikle nye terapeutiske lægemiddelkandidater til kræft i bugspytkirtlen behandling

Henvisning:. Tan X, Liu P, Huang Y, Zhou L, Yang Y, Wang H et al. (2016) fosfoproteom Analyse af Invasion og metastase-relaterede faktorer i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 11 (3): e0152280. doi: 10,1371 /journal.pone.0152280

Redaktør: Dong Wang, Harbin Medical University, KINA

Modtaget: November 14, 2015; Accepteret: 12 mar 2016; Udgivet: 25 Mar 2016

Copyright: © 2016 Tan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Liaoning Natural Science Foundation of China (nr 2014021006)

Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en yderst ondartet sygdom med en meget dårlig prognose. Trods betydelige fremskridt inden for radiologiske og endoskopiske ultralyd teknikker, er det ofte præsenterer som et lokalt fremskreden eller metastatisk sygdom hos de fleste patienter, og kun omkring 10-20% af patienterne betragtes kandidater til kirurgi [1, 2]. Bortset fra kirurgi, behøver andre effektive behandlingsmetoder ikke eksistere, og overlevelsesraten for resektion patienter er også meget lav. Den største årsag til en dårlig prognose er lokale gentagelser og /eller fjernmetastaser efter operationen. Dette antyder, at forstå de cellulære og molekylære mekanismer involveret i invasion og metastase af kræft i bugspytkirtlen er vigtig og kræver yderligere udforskning.

Men protein post-translationsmodifikationer i bugspytkirtelkræft cellelinjer, som kan spille væsentlige roller i regulering af cellulære reaktioner, ikke er blevet klart påvist. Det er derfor vigtigt at identificere eventuelle phosphoryleringsbegivenheder og til at bestemme hele proteinphosphoryleringsbegivenheder profiler af tumorceller. For nylig, ved at sammenligne de phosphoproteomes på forskellige udviklingsstadier i hudkræft hos mus, proteiner associeret med tidlige og sene cellulære responser blev identificeret, tilvejebringe nye indsigter i progressionen af ​​sygdommen [3]. Batchu et al. fundet, at MIR-26a behandling kan genoprette vildtype-funktioner af mutant p53 via phosphorylering ved sine Ser9 og Ser392-rester, hvilket resulterer i inhibering af cellevækst [4]. Derfor stedspecifik phosphorylering af proteiner spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​celleprocesser.

Men så vidt vi ved, har undersøgelser ikke analyseret fosfoproteom profiler af de to homogene cellelinier (PC-1 med en lav, og PC-1.0 med et stort potentiale for invasion og metastase) [5, 6] i bugspytkirtelkræft forskning. Vores mål er at sammenligne ændringer på 582 phosphoryleringssteder af 452 proteiner mellem PC-1 og PC-1.0 celler ved at udnytte Phospho Explorer Antibody Array teknologi. Desuden at veje og netværk relateret til phosphoproteiner identificeret i vores undersøgelse viser betydelige forskelle i deres komponenter.

Materialer og metoder

cellelinjer og cellekultur

To hamster pancreas cancer cellelinjer blev anvendt: svagt invasive og metastatiske celler (PC-1), og stærkt invasive og metastatiske celler (PC-1.0). PC-1-cellelinjen blev etableret fra pankreatiske duktale adenocarcinomer induceret af BOP i en syrisk guldhamster. PC-1.0-cellelinie blev etableret fra en subkutan tumor, der er produceret efter podning med en hamster ved PC-1-celler [5,6].

In vitro

, PC-1.0 celler er hovedsageligt enkelte celler, mens PC-1 celler vokse som ø-lignende celle kolonier.

In vivo

, lokal invasion af PC-1.0-celler og lokal udvidelse af PC-1 celler blev observeret [7].

PC-1.0 og PC-1-celler blev inkuberet i RPMI-1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA), suppleret med 10% føtalt bovint serum (Bioserum, Canterbury, Victoria, Australien), 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære 5% CO

2/95,% luft.

Phospho-protein profilering af Phospho Explorer Antibody Array

Cellelysater opnået fra PC-en PC-1.0 celler blev anvendt på en phospho Explorer Antibody Array (Full Moon Biosystems, Sunnyvale, CA, USA). Grupperingen indeholdt 1318-antistoffer. Hver af antistofferne har to replikater som er trykt på coated objektglas, sammen med flere positive og negative kontroller. Kort fortalt blev cellelysater ekstraheret med Antibody Array Assay Kit, der indeholdt en blanding af proteaseinhibitor og phosphatase inhibitor, og blev udført ifølge producentens protokol. 25 ug af cellelysater blev mærket med 3 pi biotin. Antistof microarray objektglas blev først blokeret i en blokeringsopløsning i 30 minutter ved stuetemperatur, skyllet med Milli-Q kvalitet vand og tørret med komprimeret nitrogen. Og derefter inkuberet med biotinmærkede cellelysater i kobling opløsning ved stuetemperatur i 2 timer. Array objektglas blev vasket fire gange med 60 ml 1 x vaskebuffer og skyllet grundigt med Milli-Q kvalitet vand før påvisning af bundne biotinylerede proteiner under anvendelse Cy3-konjugeret streptavidin. Glassene blev scannet på en GenePix 4000 scanner og billederne blev analyseret med GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

En fosforylering forholdet ændring er beregnet på baggrund af følgende ligning, hvor ekspressionen af ​​phosphoryleret proteiner blev normaliseret til tilsvarende ikke-phosphoryleret protein ekspression i både eksperimentelle (PC-1,0) og referencedata (PC-1). Phosphorylerede proteiner blev anset for at være differentielt udtrykt når en stigning (≥ 2,0) eller formindskelse (≤ 0,5) forekom i forholdet ekspressionsniveauer mellem PC-1.0 og PC-1-celler. Proteinphosphorylering data blev bekræftet ved Western blot.

Antistoffer og reagenser

Kanin polyklonale antistoffer dannet mod epitoper af human Abl1, pAbl1-Tyr204 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), ITGB4 , ITGB4-Tyr1510 (Abcam, Cambridge, MA, USA), Myc, pMyc Ser62, Fos, PFOS-Thr232, IRS-1, Pirs-1-Ser636, Raf1, pRaf1-Tyr341 og ß-actin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas , TX, USA) blev anvendt som primære antistoffer. Peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer eller FITC-mærkede fluorescerende antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) blev anvendt som sekundære antistoffer til western blotting. FOS og IRS-1 siRNA blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). RAF1 inhibitor (GW5074) blev indkøbt fra Selleck Chemicals (Houston, TX).

Western blot-

Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [7]. Celler blev opsamlet på is under anvendelse af RIPA puffer suppleret med protease inhibitor cocktail og phosphatase inhibitor i 30 minutter. Kort fortalt blev prøver af tilsvarende totalt protein (20 ug) kørt i en 5% polyacrylamid-pladegel og overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Bio-Rad, Anaheim, CA, USA). Membraner blev inkuberet med primært antistof, fortyndet i 0,1% Tween-20 /PBS natten over ved 4 ° C. Blots blev derefter inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (fortyndet 1: 5000) i 0,1% Tween-20 /PBS. Proteiner blev visualiseret ved hjælp af forbedrede kemiluminescensdetektion reagenser (Santa Cruz Biotechnology).

In vitro

invasion og migration analyser

PC-1.0 celler blev forbigående transficeret med forskellige siRNAs hjælp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Grand Island, NY), eller blev undertrykt under anvendelse RAF1 inhibitor. For invasion Transwell assays, de transficerede celler (5 x 10

4 celler /ml) i serumfrit medium blev tilsat til de øvre kamre, som blev købt fra Costar (8 um porestørrelse filtre, New York, NY) og belagt med Matrigel (dilution1: 4). De nedre kamre blev fyldt med RPMI-1640 indeholdende 10% serum. Efter 24 timers inkubation blev cellerne er tilbage i de øverste kamre fjernet, og de invasive celler i de nedre kamre blev fikseret med 4% paraformaldehyd (Sigma-Aldrich), farvet med krystalviolet ved stuetemperatur, og talt under et mikroskop. Til sårheling migration assay blev de transficerede celler podedes på plader med 6 brønde i 24 timer. En 1 mm-dækkende sår skete over monolaget med spidsen af ​​en 200 pi pipette. Derefter blev fotos taget ved 0, 6 og 12 timer under anvendelse af et mikroskop. PC-1.0-celler blev udført som ovenfor beskrevet som en kontrol. Hvert forsøg blev udført in duplo og tre gange. Til bekræftelse af niveauet af tre proteiner i knockdown celle blev cellerne udsat for realtids-PCR og Western blot-analyse under anvendelse af specifikke primere og antistoffer, henholdsvis. Primere, der anvendes til forstærkning af FOS og IRS-1, er opført i S1 tabel.

Gene ontologi og Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer (Kegg) pathway analyser og søgeredskab for hentning interagere Gener /Proteiner

til påvisning af betydeligt beriget Gene ontologi (GO) vilkår, blev Cytoscape plugin BINGO brugt [8,9]; differentielt udtrykte phosphorylerede proteiner blev automatisk samlet til kategorier af biologisk proces, molekylær funktion eller cellulære komponent. GO grupper med en korrigeret

P

-værdi 0,01 blev betegnet for forskellige signifikansniveauer. Pathway analyser af differentielt udtrykte phosphorylerede proteiner blev udført ved hjælp af DAVID (Databasen for anmærkning, Visualisering og Integration Discovery) bioinformatik ressourcer (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [10] bioinformatik og væsentligt ændret signalveje blev udvalgt på grundlag på en

P

-værdi 0.01, og FDR (False Discovery Rate) 10%. Berigelse kunne derfor måles kvantitativt ved anvendelse af en modificeret Fishers eksakte test. Ved hjælp af en Search Tool for Retrieval interagere Gener /Proteiner (STRING) (https://www.string-db.org/) database, opnåede vi et protein-protein interaktion (PPI) netværk [11]. En PPI-netværk blev bygget, da en tillid score på mere end 0,9 viste, at kun interaktioner med en høj grad af tillid blev anset som gyldige links i PPI-netværket.

Topologiske analyse af PPI netværk

for en bedre forståelse af PPI-netværket, blev CentiScaPe software [12] bruges til at analysere topologiske karakteristika af netværket og til at beregne node grad distribution, gennemsnitlige vejlængde, topologisk koefficient og betweenness. Vi kunne direkte analysere molekylære interaktion netværk ved hjælp visualiseret værktøjer, og opnåede interessante vigtige proteiner. Desuden blev en GeneMANIA (https://www.genemania.org/) webserver anvendt til at forudsige netværkene. Et sådant webserver værktøj gjort effektive gen funktion forudsigelser, herunder co-ekspression, fysiske interaktioner, veje og forudsagte netværk, der er baseret på tidligere rapporterede eksperimentelle data [13]. I denne rapport, vi ansat en automatisk valgt vægtning metode, og anvendes menneske som en kilde arter at forudsige netværk.

Statistik Analyse

Statistisk analyse og grafik blev foretaget ved hjælp af GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego CA). Resultater er præsenteret som gennemsnit ± standardfejl på middelværdien (SEM). Sammenligninger af kvantitative data blev analyseret ved Students

t

test eller ANOVA mellem to grupper (to-sidede,

P

-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant).

Resultater

differentielt udtrykte protein fosforylering identificeret ved PEX100 i stærkt (PC-1.0) og svagt (PC-1) invasive og metastatiske bugspytkirtlen celler

For at identificere differentielt udtrykte signalering-associerede phosphorylerede proteiner mellem højt (PC-1.0) og svagt (PC-1) invasive og metastatiske cancerceller, ekspressionsniveauer phospho-antistof specifikke proteiner i de to pancreascancer cellelinier blev sammenlignet. Af de 1318-antistoffer analyseret i microarray eksperimenter viste i alt 57 proteiner differentiel ekspression under anvendelse af en fold forhold ≥ 2 som cutoff kriterium. Af disse 57 proteiner, blev ekspressionsniveauerne for 32 proteiner markant forøget i PC-1,0 sammenlignet med PC-1-celler (tabel 1 viser de ti mest opreguleres proteiner). I modsætning hertil blev ekspressionsniveauerne for 25 proteiner signifikant reduceret i PC-1,0 sammenlignet med PC-1-celler (Tabel 2 viser de ti mest nedreguleret proteiner). De viste nøgletal repræsenterer ekspressionsniveauer i PC-1.0-celler sammenlignet med ekspressionsniveauer i PC-1 celler. CaMK1-α blev overudtrykt på højt niveau i PC-1.0 celler mens Smad1 blev nedreguleret, afslører en lav række intensitet. Desuden blev fire proteiner (Akt1-, Chk2, p53 og p70S6k) med forskellige phosphoryleringssteder fundet, ikke kun blandt opreguleres, men også blandt nedreguleret proteiner. Den faktiske vifte chip billeder blev vist i S2 Bord og ekspression af alle proteiner optaget i S3 tabel.

Validering af fosforylering proteiner ved Western blot, og differentielt proteiner spiller en stor rolle i celle migration og invasion af PC-1.0 Metastatisk

for at validere proteinphosphorylering data, ekspressionsniveauerne af seks tilfældigt udvalgte proteiner fra sammenligninger af PC-1.0 og PC-1 celler blev fornyet overvejelse ved western blot (fig 1). Western blot viste, at alle seks proteiner viste øget fosforylering i PC-1.0 celler i overensstemmelse med vores array-data, hvilket bekræfter sidstnævntes pålidelighed. For at forstå funktionelle relationer forskellen ændringer i protein fosforylering i højt metastatiske PC-1.0 celler blev invasion og migration analyser udført. Western blot og real-time PCR-analyser blev udført for at bekræfte effektiviteten af ​​siRNA eller inhibitor nedregulering (Som vist i S3 tabel). blev observeret en stærk hæmning af migration for FOS, IRS-1 og RAF1 hjælp siRNA eller antistof blokering (Fig 2A), og om invasion, FOS, IRS-1 og RAF1 forårsagede også en betydelig reduktion i invasionen evne (Fig 2B).

Som vist den totale ekspression af hvert protein var ens i begge cellelinier, mens den på phosphorylering plan ekspressionen af ​​seks proteiner var stærkere i PC-1.0 celler end PC-1 celler. Molekylære markører er angivet.

(A) Effekt af tre proteiner på migration efter brug siRNA eller antistof, der blokerer i stærkt metastatisk PC-1.0 celler. Cellerne blev inkuberet i 24 timer. Den procentvise migration blev beregnet og afbildet. * Sammenlignet med PC-1.0,

P

-værdi 0,01. (N = 3) (B) Kvantificering af Transwell assay for behandlet gruppe og kontrolgruppe. Celler blev talt i tredobbelte brønde og i tre identiske eksperimenter, * Sammenlignet med PC-1.0,

P

-værdi 0,01. (N = 3)

Funktionel klassifikation, netværk og sti analyse

For at forstå de tilsvarende biologiske processer, der korrelerer med invasion og metastase af bugspytkirtelkræftceller, vi udforskede disse igen ved hjælp af online funktionel annotation værktøj, DAVID, og ​​med Kegg veje analyse. GO term analyse viste, at mål blev beriget i mange processer (tabel 3-5), herunder aminosyre phosphorylering og posttranslationel proteinmodifikation. Pathway analyser afslørede sådanne opreguleret mål blev beriget med 27 Kegg veje (Fig 3A), som var afgørende for stofskiftet (insulin-signalvejen og cellecyklus), immunitet (T-celle receptor signalvejen) og udvikling (ErbB signalvejen). Proteiner danner et PPI-netværk og er impliceret i at ændre og styre cellulær invasion i forskellige biologiske systemer. Dataene er vist i fig 3B og 3C. Fig 4A og 4D viser samspillet netværk bygget i STRING efter forespørge 32 opreguleret og 25 ned-regulerede proteiner fundet i PC-1.0 celler. Hertil kommer, når den tillid score var 0.900, CAMK1-α, PIM-1 og MKK7 /MAP2K7 var ikke længere i en opreguleret netværk, samt MAPKAPK2, cytokeratin 8, GATA1, GRK1, ACC1, PDGFRA og Smad1 i en nedreguleret netværk. Markov (MCL) og K-means cluster algoritmer blev derefter anvendt til yderligere at analysere PPI netværk. Til sammenligning opnåede vi en omtrentlig konsekvens af klynge hvor MCL cutoff var 2 og K-Mean cutoff var 4 i både opreguleret (Fig 4B og 4C) og nedreguleret (Fig 4E og 4F) PPI-netværk. Proteiner med færre eller ingen interaktioner blev fundet mere mod periferien af ​​netværket. Yderligere eksperimentelle undersøgelser er påkrævet af disse beslægtede proteiner for at forstå deres reelle funktion i en PPI-netværk.

Kegg og BioCarta pathway funktionelle anmærkninger af differentielt udtrykt opreguleret (A, C) og nedreguleret (B ) proteiner (

P

-værdier 0,01, Benjamin 0,05). Berigelse scores svarende til hvert sti leveres af DAVID annotation værktøj vises som -log

P

-værdier. Nedreguleret proteiner, der var BioCarta pathway funktionelle anmærkninger kun blev beriget i apoptotisk signalering som respons på DNA beskadigelse.

(A) En PPI-netværk, som vist på interaktive visning, genereret af en STRING database at afsløre funktionelle interaktioner mellem opreguleret proteiner. Hvert knudepunkt repræsenterer et protein, og hver kant betegner en interaktion (

P

-værdier = 6.06E-12); (B) opreguleret proteiner ‘MCL klynge algoritmer afledt hjælp STRING. MCL = 2; (C) opreguleret proteiner ‘K-Midler klynge algoritmer. K-Midler = 4; omtrentlige samme konsekvenser ved to klynger; (D) en PPI netværk afslører funktionelle interaktioner mellem nedregulerede proteiner (

P

værdi = 1.47E-6); (E) nedreguleret proteins’MCL klynge algoritmer. MCL = 2; (F) nedreguleret proteiner ‘K-Midler klynge algoritmer. K-Midler = 4. Vejviser

Desuden CentiScaPe software, som beregner topologiske karakteristika for hver node, blev brugt til at få en dybdegående forståelse af de biologiske egenskaber af PPI-netværket, men ikke ikke-relaterede proteiner. Opreguleringen PPI netværk bestod af 26 knuder med en gennemsnitlig vejlængde på 1,89. Node grad var 6,62 ± 4,18, og betweenness var 22,23 ± 35,72 (tabel 6). Med den samme metode, vores nedregulering PPI netværk vises 17 knudepunkter med en gennemsnitlig vejlængde på 2,04. Node grad var 3,65 ± 2,47, og betweenness var 16,59 ± 29,58 (tabel 7). Proteiner med høj værdi var vigtigere i netværket og denne foreslog en central rolle i at opretholde funktionalitet og sammenhæng signalering mekanismer. I vores opreguleret PPI-netværk, hub proteiner med høj node grad og betweenness ( Midler) var Akt1, CTNNB1, FOS, NFkB-p65, SYK, TP53 og MYC. På den anden side er nedreguleret netværk inkluderet BRCA1, LCK, Akt1, og TP53 (figur 5). Især Akt1 og TP53 viste den højeste score for alle beregnede centralities, tyder central regulerende rolle i opregulerede proteiner og i et nedreguleret netværk.

Alle knudepunkter, der har en centralt værdi større eller lig med den tærskel er fremhævet med en lysegrå farve i netværket visning. (A) opreguleres proteiner; (B) ned-regulerede proteiner. Vejviser

Næste, differentielt udtrykte phosphoproteiner blev uploadet på en GeneMANIA værktøj til at forudsige en co-ekspression netværk. Som følge heraf blev 20 gener føjet til netværket (figur 6, tabel 8). En sådan co-ekspression netværk er med til at forklare forskellige processer findes i bugspytkirtelkræft cellelinjer. Generelt kan sådanne topologiske egenskaber af netværket forbedre vores forståelse af centrale gener forbundet med invasion.

Et netværk af differentierede gener blev genereret ved hjælp GeneMANIA. Den venstre netværk udgør op-regulerede gener og retten netværk betegner ned-regulerede gener. Derudover findes fem gener i både op- og ned-regulerede netværk (TP53, CHEK2, Akt1, RPS6KB1, RAF1). Query gener er angivet med sorte prikker og co-ekspression er angivet med lyserøde linjer. Grå noder angiver forudsagt gener.

(Vægt ≥ 0,04).

Diskussion

I de seneste år, mange forskere har brugt endoskopisk ultralyd-vejledt fint nål aspiration (EUS-FNA) som en præoperativ diagnostisk metode til at reducere unødvendige kirurgiske procedurer i et forsøg på at opnå højere overlevelsesrater [14,15]; dog har resultater været utilfredsstillende. Hvordan man kan reducere invasion og metastase af kræft i bugspytkirtlen er stadig en intens område for forskning og igangværende problem. Phosphorylering er den vigtigste og er involveret i mange cellulære processer (f.eks proliferation, differentiering, signaltransduktion, metabolisme, apoptose, cellulær-signalering, transkriptionel og translationel regulering) [16-23].

Som beskrevet i vores tidligere undersøgelse, har vi etableret to bugspytkirtelkræft cellelinier fra en eksperimentel bugspytkirtelkræft model [5,6]. Ikke-dissocierede celler (PC-1) og dissocierede celler (PC-1.0) viser høje histologiske ligheder, men adskiller sig i deres invasive og metastatiske kapaciteter. Vi rationaliseret at anvendelse af sådanne cellelinier ville mindske virkningen af ​​anvendelse af celler fra forskellige væv oprindelser. Derfor er analysen af ​​forskelligt udtrykte phosphoproteomes i to cellelinjer (PC-1.0 og PC-1) er særlig vigtig for studiet af kræft i bugspytkirtlen invasion og metastase mekanismer.

For yderligere at forstå forskellige biologiske funktioner produceret ved forskellige phosphorylering modifikationer af det samme protein i de to cellelinier (PC-1.0 og PC-1), blev en høj-throughput phosphorylering-array teknik, der anvendes i vores analyser. Grupperingen detekterede phosphoryleringsniveauerne af proteiner på specifikke aminosyrerester (fx Ser, Thr, Tyr), og forudsat præcis og effektiv fosfoproteom profilering af hver pankreatisk cancercellelinie. Efter data mining, har vi observeret, at de 57 signatur forskellen udtryk proteiner, seks gener kodet 12 proteiner, med phosphorylering forekommer på forskellige steder (dvs. NFkB-p65, p70S6k, Smad2, Chk2, p53 og Akt1). Det stedsspecifikke fosforylering af proteiner resulterer normalt i forskellige biologiske funktioner [24]. Men roller multiple phosphoryleringssteder i en enkelt proteinmolekyle ikke er blevet klart belyst. Derfor Guo et al. brugte nanofluidic proteom immunassay (NIA) at analysere og karakterisere proteinphosphorylering af flere forskellige steder [25]. Sammenlignet med Guo et al. undersøgelse, vores resultater viser, at phosphorylering på Thr72 og Ser124 af Akt1- har en vigtigere rolle og kan være tæt forbundet med kræft i bugspytkirtlen invasion og metastase.

Generelt kemokiner er små proteiner, som spiller en vigtig rolle i at kontrollere migrationen af ​​forskellige celler [26]. Vores resultater viser, at 10 proteiner, som vi identificerede kunne klassificeres som kemokiner (dvs. ITGB4, PLCG2, IRS-1, FOS, CTNNB1, PLCG1, CD227, pKD1, P53 og ACTC1), i henhold til https://www.phosphosite.org [27]. Andre invasion-relaterede protein typer var transkriptionsfaktorer (myc Rb, FOS, CTNNB1, NFkB-p65, p53, BRCA1, GATA1, Smad1 og Smad2) og cytoskeletale proteiner (lamin A, cytokeratin 8 og ACTC1).

Gennem Kegg pathway analyser, fandt vi, at der forelå disse differentielle ekspression proteiner på to signalveje (ErbB og neurotrophin signaleringsveje som vist i figur 2A). Blandt de ændrede vej, fandt vi PI3K og MAPK som hovedaktører i processen med celle motilitet. I vores tidligere undersøgelser, fandt vi, at aktivering af EGFR-medieret MEK /ERK signalvej induceret celleinvasion i PC-1-celler, omvendt kunne EGFR-inhibitor AG1478 inhibere ovenfor pathway og reducere celleinvasion i PC-1.0-celler [28] . I denne undersøgelse, vi har registreret hyperphosphorylering af ErbB3, ErbB4, Raf1, P90RSK, MSK1, MYC og FOS i PC-1.0 celler sammenlignet med PC-1 celler, men ændringer i Grb2, MEK, ERK og Elk1 blev ikke observeret. Endvidere har vi ansat Raf1 inhibitor og FOS siRNA at undersøge forholdet mellem protein og invasion. Resultaterne viste, at knockdown af FOS eller Raf1 signifikant inhiberede migration og invasion af PC-1.0-celler. Vores resultater, Grb2 /MEK /ERK-signalering blev ikke observeret, måske skyldes methodologic begrænsninger. Vores data viser, at P90RSK blev hyperphosphoryleret imidlertid Kang et al. rapporterede, at P90RSK2 fremmet invasion og metastase af menneskelige hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) [29]. P90RSK kan være involveret i reguleringen af ​​kræft i bugspytkirtlen celleinvasion og metastase.

Den anden signalvej (PI3K /AKT) normalt indebærer i celledeling og cellecyklus [30]. I vores data, vi testede adskillige opstrøms regulatorer af PI3K /AKT såsom VEGFR1 /2/3, ErbB2 /3/4, PDGFRα, MET, EGFR, FLT3, KIT, og IGF-1R. Blandt disse proteiner, ErbB3 og ErbB4 er meget phosphoryleret i modsætning, PDGFRα og KIT er faldet betydeligt. I mellemtiden observerede vi, at IRS-1 phosphorylering ved Ser 636 blev markant forøget, men IGF-1R blev ikke ændret. Især kan IRS-1 phosphorylering blive negativt reguleret ved aktivering af p70S6k i PI3K /AKT /mTOR signalvej [31]. I denne undersøgelse fandt vi en stigning i p70S6k fosforylering på Ser371 og Thr 421, og et fald på Ser 418 fosforylering. Derfor er vores studier antydet, at PDGFRα og KIT nedregulering i bugspytkirtelkræft fører til nedsat p70S6K fosforylering ved Ser 418, og øget IRS-1 fosforylering ved Ser 636 via øget PI3K /AKT mTOR /p70S6k signalering. Hyperphosphorylering af IRS-1 efterfølgende medieret aktivering af PI3K /AKT pathway. Konstateringen kunne tyde den mekanisme af resistens i bugspytkirtelkræft, som et resultat, bør kombination kliniske forsøg inden for bugspytkirtelkræft overvejes.

Sammenfattende identificere differentielt udtrykte phosphoproteomes, som afsløret i vores undersøgelse, vil pege på mekanismer bag invasionen og metastase af kræft i bugspytkirtlen. I fremtiden har vi brug for mere opmærksomme på at identificere den aktiverede fosfoproteom, især specifikke aminosyrerester. Tilsammen identifikation af abnorme protein fosforylering, som er relateret til invasion og metastase, kan tillade os at identificere nye biomarkører til tidlig påvisning af kræft i bugspytkirtlen.

Støtte Information

S1 Table. Primersekvenser og inhibitor anvendes i assayet.

Real-time PCR blev udført for at analysere niveauet af FOS eller IRS-1 mRNA i knockdown cellelinier. Niveauet af Raf1 knockdown blev bekræftet ved hjælp af Western blot

doi:. 10,1371 /journal.pone.0152280.s001

(DOCX)

S2 Table. Den Phospho Explorer Antibody Array blev scannet på en GenePix 4000 scanner

doi:. 10,1371 /journal.pone.0152280.s002

(DOCX)

S3 Table. Udtrykket af alle proteiner i Phospho Explorer Antibody Array blev præsenteret

Koordinaterne og proteiner blev angivet i tabellen

doi:.. 10,1371 /journal.pone.0152280.s003

(XLSX)