PLoS ONE: Grape Proanthocyanidin Inhibit kræft i bugspytkirtlen Cell Growth In vitro og in vivo gennem induktion af apoptose og ved at målrette PI3K /Akt Pathway

Abstrakt

Kræft i bugspytkirtlen er en aggressiv malignitet, der ofte diagnosticeret på et fremskredent stadium med dårlig prognose. Her rapporterer vi de kemoterapeutiske virkninger af bioaktive proanthocyanidiner fra vindruekerner (annoncer i Gmail) som opgøres ud

In vitro

In vivo

modeller. Behandling af humane pancreatiske cancerceller (MiaPaCa-2, Panc-1 og aspC-1) med annoncer i Gmail

In Vitro

reduceret cellelevedygtighed og øget G2 /M-fase standsning af cellecyklussen fører til induktion af apoptose i en dosis- og tidsafhængig måde. Den annoncer i Gmail-induceret apoptose af bugspytkirtelkræftceller var forbundet med et fald i niveauerne af Bcl-2 og Bcl-xl og en stigning i niveauerne af Bax og aktiveret caspase-3. Behandling af MiaPaCa-2 og PANC-1-celler med annoncer i Gmail også faldet niveauerne af phosphotidylinositol-3-kinase (PI3K) og phosphorylering af Akt ved Ser

473. siRNA knockdown af PI3K fra bugspytkirtelkræftceller reducerede også phosphorylering af Akt. Endvidere kosten administration af annoncer i Gmail (0,5%, vægt /vægt) som en kompletteret AIN76A kontrol kost inhiberede signifikant væksten af ​​MiaPaCa-2 pancreas tumorxenotransplantater dyrket subkutant i athymiske nøgne mus, som blev forbundet med: (

i

) inhibering af celleproliferation, (

ii

) induktion af apoptose af tumorceller, (

iii

) forøget ekspression af Bax, reduceret ekspression af anti-apoptotiske proteiner og aktivering af caspase-3 -positive celler og (

iv

) faldt udtryk for PI3K og p-Akt i tumor xenograft væv. Sammen disse resultater tyder på, at annoncer i Gmail kan have en potentiel kemoterapeutiske effekt på bugspytkirtlen vækst kræftcellen

Henvisning:. Prasad R, Vaid M, Katiyar SK (2012) Grape Proanthocyanidin Inhibit kræft i bugspytkirtlen Cell Growth

In Vitro

In Vivo

gennem induktion af apoptose og ved at målrette PI3K /Akt Pathway. PLoS ONE 7 (8): e43064. doi: 10,1371 /journal.pone.0043064

Redaktør: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: 17. maj 2012; Accepteret: 16. juli 2012; Udgivet: 8. august, 2012 |

Copyright: © Prasad et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra Veterans Administration Merit anmeldelse Award (SKK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen anses for at være den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA. Det er en aggressiv malignitet, der ofte diagnosticeret på et fremskredent stadium med dårlig prognose; den samlede 5-års overlevelse er 5% [1], [2]. Kun 20% af bugspytkirtlen kræftpatienter er berettiget til kirurgisk resektion, som er det eneste potentielle helbredende terapi [3]. Selv om en kombination af kemoterapi og strålebehandling kan forbedre overlevelsen fleste patienter dør af sygdomsprogression, der ofte er forbundet med erhvervet eller indre resistens over for kemoterapi [4], [5]. Derfor er udviklingen af ​​mere effektive terapeutiske strategier, der kan målrette molekylerne er forbundet med bugspytkirtlen tumorvækst og omgå eller overvinde modstand mod apoptose kan føre til bedre resultater hos patienter, der lider af kræft i bugspytkirtlen.

Ikke-giftige fytokemikalier tilbyde lovende muligheder for udvikling af effektive kemoterapeutiske strategier af forskellige former for kræft. Nogle case-kontrollerede epidemiologiske undersøgelser understøtter det koncept, at forbruget af bioaktive diætetiske fytokemikalier reducerer risikoen for kræft i bugspytkirtlen [6], [7]. Vindruekerneolie proanthocyanidins (annoncer i Gmail) er bioaktive fytokemikalier, som har vist anti-kræftfremkaldende aktivitet i nogle dyr tumormodeller [8], https://carcin.oxfordjournals.org/cgi/content/full/24/8/1379 – B10 # B10and synes at udvise minimal toksicitet i laboratoriedyr [9], [10]. Annoncer i Gmail let ekstraheres fra drue-frø, og er en blanding af dimerer, trimerer tetramerer, og oligomerer af monomere catechiner og /eller (-) – epicatechiner [9], [10]. Annoncer i Gmail har vist sig at have anti-inflammatorisk, anti-oxidant og anti-metastatiske egenskaber i både

in vitro

in vivo

modeller [8] – [12]. De hæmmer ultraviolet strålings- og kemisk kræftfremkaldende induceret hudkræft i musemodeller [9], [13]. Vi har for nylig vist, at kosten administration af annoncer i Gmail med AIN76A kontrol kost resulterede i en dosisafhængig inhibering af væksten af ​​ikke-småcellet lungekræft tumorxenoplantater [14]. Annoncer i Gmail hæmme invasive potentiale melanom og hoved og hals pladecellekræft celler som vurderet ved hjælp

in vitro

modeller [11], [12]. Men den anti-kræftfremkaldende potentiale annoncer i Gmail mod kræft i bugspytkirtlen er stort set uudforsket.

phosphatidylinositol 3′-kinase (PI3K) /Akt vej er en fundamental signalvej der medierer adskillige cellulære processer, herunder celledeling, vækst , celle overlevelse og motilitet [15]. Øget aktivering og deregulering af komponenterne i PI3K /Akt pathway har været impliceret i mange maligniteter og giver resistens over for kemoterapi [16]. Akt er en velkarakteriseret serin /threonin-kinase. Øget Akt aktivitet har været impliceret i flere typer af cancere, nemlig til fordel celleoverlevelse gennem virkninger på talrige downstream mål, herunder inaktiveringen af ​​pro-apoptotiske proteiner, aktivering af anti-apoptotiske gener og progressionen af ​​cellecyklussen [17]. Aktivering af Akt er en hyppig begivenhed i bugspytkirtelkræft og er forbundet med dårlige prognostiske variable og resultater [18] – [20]. En undersøgelse viste, at 59% af pancreas adenocarcinomer viste hyperaktivering af Akt [18]. Nogle undersøgelser tyder på, at hæmning af PI3K /Akt pathway sensibiliserer bugspytkirtelkræftceller til apoptotiske effekt af kemoterapi både

in vitro

in vivo

[21] – [23].

i den foreliggende undersøgelse, vurderede vi den kemoterapeutiske effekt af annoncer i Gmail på kræft i bugspytkirtlen ved brug af MiaPaCa-2, PANC-1 og AsPC-1 humane bugspytkirtelkræft cellelinier som

in vitro

cellekultur modeller. For at verificere de

in vitro

data, vi gennemførte

in vivo

tumor xenografundersøgelser. Vores resultater viser, at behandling af pankreatiske cancerceller med annoncer i Gmail resulterer i inhibering af celleproliferation, induktion af apoptose og inhibering af PI3K /Akt pathway.

Materialer og metoder

Antistoffer og reagenser

De primære antistoffer blev opnået som følger: antistoffer specifikke for Bax, Bcl-2, Bcl-xl, kløvet caspase-3, PI3K, Akt, p-Akt og β-actin blev købt hos Cell Signaling Technology (Beverly, MA); Cyclin B1, Cdc25B, Cdc25C, Ki-67, og de sekundære antistoffer, som blev horseradishperoxidase-konjugeret, blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Den PI3K siRNA-kit blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Annexin V-konjugeret AlexaFluor488 Apoptose Detection Kit blev indkøbt fra Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Proteinet assaykit var fra Bio-Rad (Hercules, CA). MTT (3- [4,5-dimethyl-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid) og alle andre kemikalier var af analytisk kvalitet og indkøbt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). De annoncer i Gmail blev opnået fra Kikkoman Corporation (Japan). Den kemiske sammensætning og stabilitet annoncer i Gmail er blevet beskrevet tidligere [9], [10].

Celler og dyrkningsbetingelser

Humane bugspytkirtelkræft cellelinjer, ASPC-1, Panc-1 og MiaPaCa -2, blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD) og dyrket som anbefalet som monolag i DMEM suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT), 100 ug /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin fra Invitrogen (Carlsbad, CA) i en fugtig inkubator ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære. De annoncer i Gmail blev opløst i en lille mængde dimethylsulfoxid (DMSO, 100 pi) før tilsætning til mediet. Den maksimale koncentration af DMSO i mediet oversteg ikke 0,1% (v /v). Celler behandlet med DMSO tjente kun som en vehikelkontrol.

Cell levedygtighed og celledødsassays

Virkningen af ​​annoncer i Gmail på levedygtigheden af ​​pancreas carcinomceller blev bestemt under anvendelse MTT-assay som tidligere beskrevet [24 ]. Kort beskrevet blev celler behandlet med eller uden annoncer i Gmail i 24 og 48 timer. Ved slutningen af ​​fastsatte tid, blev celler behandlet med 50 pi af 5 mg /ml MTT, og de resulterende formazankrystaller blev opløst i 150 pi DMSO. Farven Absorbansen blev registreret ved 540 nm ved anvendelse af et Bio-Rad 3350 mikropladelæser. Effekten af ​​annoncer i Gmail på cellelevedygtighed blev beregnet som procent af kontrol, som vilkårligt blev tildelt en værdi på 100% levedygtighed. Annoncer i Gmail-induceret celledød blev bestemt ved anvendelse af en trypanblå udelukkelse farvestof-assay som tidligere [24] beskrevne. Kort beskrevet blev celler behandlet med eller uden annoncer i Gmail i 24 og 48 timer. Derefter blev cellerne høstet, behandlet med 0,25% trypanblåt og de celler, der havde optaget farvestoffet blev talt under et mikroskop under anvendelse af et hæmocytometer. Den annoncer i Gmail-induceret celledød er udtrykt som middelværdi ± SD procentdel af døde celler i hver behandlingsgruppe fra tre gentagne forsøg.

Cellecyklusanalyse Salg

MiaPaCa-2 og Panc-1-celler var behandlet med forskellige koncentrationer af annoncer i Gmail (0, 20, 40 og 60 ug /ml) i komplet medium i 48 timer. Cellerne blev derefter høstet, og bearbejdet til cellecyklusanalyse, som beskrevet tidligere [24]. Kort fortalt 1 × 10

5-celler blev resuspenderet i 50 pi kold PBS, hvortil 450 pi kold methanol blev tilsat, og cellerne blev derefter inkuberet i 1 time ved 4 ° C. Efter centrifugering blev pelleten inkuberet med RNase A (20 ug /ml) i 30 min. Cellerne blev inkuberet med propidiumiodid (50 ug /ml) på is i mørke. Cellecyklus fordelingen af ​​cellerne blev derefter bestemt ved anvendelse af et FACS Calibur-instrument (BD Biosciences, San Jose, CA) udstyret med Cell Quest 3.3 software i Core Facility af UAB Comprehensive Cancer Center.

apoptotisk celledød analyse ved flowcytometri

annoncer i Gmail-induceret apoptotisk celledød i bugspytkirtelkræftceller blev kvantitativt bestemt ved flowcytometri under anvendelse af Annexin V-konjugeret Alexa fluor 488 Apoptose Detection Kit ifølge producentens protokol, som tidligere beskrevet [24]. Kort beskrevet efter behandling af celler med annoncer i Gmail i 48 timer blev cellerne høstet, vasket med PBS og inkuberet med Annexin V Alexa fluor488 (Alexa488) og propidiumiodid i 10 minutter i mørke. De farvede celler blev derefter analyseret ved fluorescensaktiveret cellesortering under anvendelse af FACSCalibur instrument (BD Biosciences) and Cell Quest 3.3 software.

Western blot-analyse

Efter behandling af pankreatiske cancerceller med eller uden annoncer i Gmail cellerne blev høstet, vasket med koldt PBS og lyseret med iskold lysepuffer suppleret med proteaseinhibitorer som beskrevet tidligere [24]. Til Western blot-analyse blev proteiner resolveret på 10% Tris-glycin geler og overført til en nitrocellulosemembran. Efter blokering af de ikke-specifikke bindingssteder blev membranen inkuberet med det primære antistof ved 4 ° C natten over. Membranen blev derefter inkuberet med den passende peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof og immunreaktive proteinbånd blev visualiseret under anvendelse forøget kemiluminescens reagenser (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Membranen blev derefter strippet og testet igen med anti-β-actin-antistof til at kontrollere lige protein loading på gelen.

Dyr og Tumor xenograft model

Kvinde athymiske nøgne mus på 4-5 ugers alder blev købt fra National Cancer Institute (Bethesda, MD) og har til huse i Animal Resource Facility ved University of Alabama i Birmingham i overensstemmelse med de retningslinjer Institutional Animal Care og brug Udvalg. Dyret, der bruges i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra University of Alabama i Birmingham, og dyret protokol nummer er: 101109267. Mus blev forsynet med en steriliseret AIN76A kost og vand

ad libitum

. For at bestemme

in vivo

kemoterapeutisk effekt af kosten annoncer i Gmail mod human pancreas tumor xenograft vækst, eksponentielt voksende MiaPaCa-2-celler (5 x 10

6 i 100 pi PBS) blev injiceret subkutant i den højre flanke af hver mus. En dag efter tumorcelle inokulation blev dyrene inddelt tilfældigt i to grupper med otte mus pr gruppe. En gruppe mus modtog AIN76A kontrol kost, mens den anden gruppe af mus modtog en 0,5% annoncer i Gmail-suppleret AIN76A kontroldiæt i tabletform hele eksperimentet periode. Eksperimentet blev afsluttet ved 11

th uge efter inokulation af tumorceller. Den tumorvækst og legemsvægt pr mus per uge blev registreret. Tumorstørrelse blev målt ved anvendelse målekrumpassere og volumener blev beregnet under anvendelse af hemiellipsoid model formlen: tumorvolumen = ½ (4π /3) (l /2) (w /2) H, hvor L = længde, W = bredde og H = højde . Baseret på IACUC retningslinjer, bør tumorstørrelse ikke stige mere end 1,5 cm

2 eller størrelse med en skilling. På dette trin blev forsøget afsluttet, blev musene aflivet, tumor fra hver mus blev udskåret og den våde vægt af hver tumor i hver gruppe blev registreret. En portion af tumoren blev anvendt til fremstilling tumorlysater Til Western blot-analyse, og den anden del af vævet blev paraffin-indlejret og anvendt til immunohistokemisk analyse.

Immunhistokemisk påvisning af Ki-67-positive, p-Akt -positive og aktiverede caspase-3-positive celler

Paraffin-indlejrede tumor sektioner (5 um tykke) blev afparaffiniseret og rehydreret, som tidligere [25] beskrevet. Efter rehydrering blev antigen-genvinding udføres ved at placere objektglassene i 10 mmol /l natriumcitrat-buffer (pH 6,0) ved 95 ° C i 20 minutter efterfulgt af 20-min afkøling. Snittene blev derefter vasket i PBS og ikke-specifikke bindingssteder blev blokeret med 1% bovint serumalbumin med 2% gedeserum i PBS før inkubation med enten anti-Ki-67, anti-p-Akt eller anti-spaltet caspase-3 antistof. Efter vask blev sektionerne inkuberet med biotinyleret sekundært antistof efterfulgt af peberrodsperoxidasekonjugeret streptavidin. Snittene blev inkuberet yderligere med 2,4-diaminobenzidin-substrat og modfarvet med hæmatoxylin. Ki-67-positive og spaltes caspase 3-positive celler i et afsnit blev talt i mindst 4-5 forskellige områder og fotograferet under anvendelse af et Olympus mikroskop (model BX40F4, Tokyo, Japan) monteret med en Q-farve 5 Olympus kamera.

TUNEL assay for apoptotiske celler

TUNEL-assayet blev udført under anvendelse deadend

TM Kolorimetrisk TUNEL System Kit (Promega Corporation, USA) ved at følge fabrikantens protokol. Kort fortalt, efter antigen-genvinding, tumor sektioner (5 um tykke) blev fikseret ved inkubation med 4% paraformaldehyd ved 4 ° C. De permeabiliserede snit blev inkuberet med terminal deoxynucleotidyltransferase rekombinant (FDU) enzym-katalyseret blanding reaktion og nukleotid i 60 minutter ved 37 ° C i mørke. Efter nedsænkning i stop /vaskebuffer i 15 minutter ved stuetemperatur, blev snittene vasket med PBS for at fjerne ikke-inkorporeret fluorescein-12-dUTP og kernerne modfarvet med hæmatoxylin. TUNEL-positive celler blev undersøgt og talt under mikroskop. Tunel-positive celler udtrykkes som en procentdel af de samlede celler i mikroskopisk område.

Statistisk analyse

Den statistiske signifikans af forskellen mellem værdierne af kontrol- og behandlingsgrupper blev bestemt ved enten Student

t

test eller simpel envejs ANOVA efterfulgt af Tukey s

post hoc

test for multiple sammenligninger bruger GraphPad Prism-version 4.00 til Windows, GraphPad Software, San Diego, Californien, USA, www. graphpad.com. I hvert tilfælde,

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

annoncer i Gmail hæmmer levedygtighed og fremkalde død bugspytkirtelkræftceller

antiproliferative. virkninger af annoncer i Gmail på bugspytkirtelkræft cellelinier, MiaPaCa-2, PANC-1 og AsPC-1, blev bestemt under anvendelse af et MTT-assay. Cellerne blev behandlet med forskellige koncentrationer af annoncer i Gmail (0, 10, 20, 40 og 60 ug /ml) i 24 og 48 timer. En dosisafhængig reduktion i levedygtigheden af ​​de MiaPaCa-2-celler blev iagttaget, at mellem 2 og 35% (

P

0,05) efter 24 timer, og 20 til 60% (

P

0,01) efter 48 timers behandling med annoncer i Gmail, som vist i figur 1A. Under identiske betingelser, blev lignende virkninger af annoncer i Gmail observeret på behandling af Panc-1 og aspC-1-celler (figur 1B og 1C, venstre paneler), bortset fra at annoncer i Gmail-induceret reduktion af levedygtigheden af ​​aspC-1 celler var mindre end observeret for de andre cellelinjer. Vi bestemt også den cytotoksiske effekt af annoncer i Gmail på pancreas cancer cellelinjer i form af celledød ved hjælp af trypanblåt udelukkelse assay. Som vist i figur 1A (højre paneler), sammenlignet med de ikke-annoncer i Gmail-behandlede kontrolceller, behandling af MiaPaCa-2-celler med annoncer i Gmail resulterede i en signifikant og dosisafhængig forøgelse i celledød. Behandling i 24 timer resulterede i en 5-28% (

P

0,05) stigning i celledød, mens behandling i 48 timer resulterede i 9-38% (

P

0,05 -0,001) celledød. Anvendelse af identiske betingelser, blev lignende cytotoksiske virkninger iagttaget på behandling af Panc-1 og aspC-1-celler med annoncer i Gmail (figur 1B og 1C, højre paneler).

(A) MiaPaCa-2-celler, (B) PANC -1-celler og (C) AsPC-1-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af annoncer i Gmail for de angivne tidsperioder. Venstre paneler: Levedygtighed af cellerne blev bestemt ved anvendelse af MTT-assayet som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene er udtrykt som procent af kontrolceller (ikke-annoncer i Gmail behandlet) som middelværdi ± SD af 8 replikater. Højre paneler: Den cytotoksiske virkning af annoncer i Gmail på bugspytkirtelkræftceller blev bestemt under anvendelse af trypan-blå-udelukkelse farvestof-assay som beskrevet i Materialer og metoder. Celledøden data er præsenteret som den gennemsnitlige procent af døde celler fra tre forsøg ± SD

vs.

Kontrolgruppe (ikke-annoncer i Gmail-behandlet). Signifikant forskel

vs

kontrolgruppe,

*

P

. 0,001;

**

P

. 0,05

annoncer i Gmail fremkalde G2-M-fasen cellecyklusstop i bugspytkirtelkræftceller

Forstyrrelse af den normale celle- cyklus progression og division er vigtige begivenheder i udviklingen af ​​kræft. For at bestemme de mulige mekanismer for de anti-proliferative virkninger af annoncer i Gmail blev cellecyklus-analyse foretaget ved hjælp MiaPaCa-2 og PANC-1 cellelinjer behandlet med 20, 40 eller 60 mg /ml annoncer i Gmail. Som vist i figur 2A, efter behandling af MiaPaCa-2-celler med annoncer i Gmail i 48 timer var der betydeligt højere antal celler i G2-M-fasen ved alle koncentrationer anvendes: 20 ug /ml (15,5%,

P

0,05), 40 pg /ml (23,9%,

P

0,01) og 60 mg /ml (29,4%,

P

0,001) i forhold til den ikke-annoncer i Gmail-behandlede kontroller (5,9%). Efter 24 timers Time-punkt, virkningen af ​​annoncer i Gmail på G2 /M-cellecyklusstandsnings var signifikant mindre end den observeret efter behandling i 48 timer. Lignende effekter af annoncer i Gmail på G2 /M fasen blev fundet ved brug af PANC-1 cellelinje (figur 2B). Derefter bestemte vi effekten af ​​annoncer i Gmail på cellecyklusregulerende proteiner involveret i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus progression. Resultaterne af Western-blotting viste, at behandling af MiaPaCa-2 og Panc-1-celler med varierende koncentrationer af annoncer i Gmail i 48 timer resulterede i en dosis-afhængigt fald i cyclin B1 ekspression samt en reduktion i ekspressionsniveauerne af Cdc25B og Cdc25C proteiner, som regulerer G2 /M-fasen af ​​cellecyklussen (figur 2C).

MiaPaCa-2 og PANC-1-celler blev behandlet med enten vehikel (0,1% DMSO) eller annoncer i Gmail (20, 40 og 60 ug /ml) i komplet medium. Efter 48 timers behandling blev cellerne høstet og spaltet med RNase. Cellulært DNA blev farvet med propidiumiodid og flowcytometrisk analyse blev udført for at analysere fordelingen cellecyklus, som beskrevet detaljeret i Materialer og Metoder. De repræsentative cellecyklus histogrammer fra to uafhængige eksperimenter i MiaPaCa-2 (A) og PANC-1 (B) celler efter behandling med forskellige doser af annoncer i Gmail er vist. (C) Effekt af annoncer i Gmail på G2 /M fase cellecyklus regulerende proteiner i MiaPaCa-2 og PANC-1 celler. Cellerne blev behandlet med enten vehikel eller annoncer i Gmail (20, 40, 60 ug /ml i DMSO) i 48 timer og derefter høstet, cellelysater fremstillet og derefter underkastet SDS-PAGE efterfulgt af western blot-analyser af forskellige proteiner. β-actin blev anvendt til at verificere lige belastning af prøverne. Repræsentative blots fra tre individuelle forsøg er vist.

annoncer i Gmail inducere apoptose af bugspytkirtelkræftceller

For at undersøge, om reduktionen i cellelevedygtigheden og induktion af G2 /M fase anholdelse i menneskets bugspytkirtel cancerceller efter annoncer i Gmail behandling var relateret til induktion af apoptose blev MiaPaCa-2 og PANC-1-celler behandlet med forskellige koncentrationer af annoncer i Gmail og procentdelen af ​​apoptotiske celler blev vurderet ved anvendelse af Alexa488 Apoptotisk Detection Kit. Apoptotisk celledød blev bestemt i form af efterløns- eller sen-fase apoptotiske celler, som er vist henholdsvis i nederste højre (LR) og øverst til højre (UR) kvadranter af FACS histogrammer (figur 3A). Behandling af de MiaPaCa-2 og PANC-1-celler med annoncer i Gmail i 48 timer resulterede i signifikant induktion af apoptose i begge cellelinier. Procentdelen af ​​totale apoptotiske celler (i UR + LR kvadranter) i MiaPaCa-2 celler efter annoncer i Gmail behandlinger var som følger: 5,2% (køretøj-behandlet kontrol), 16,6% (20 mikrogram /ml,

P

0,01), og 35,8% (60 mg /ml,

P

0,001), som opsummeret i panel B blev observeret. Lignende annoncer i Gmail-induktion af apoptose, når PANC-1-celler blev behandlet med annoncer i Gmail i 48 timer, som vist i figur 3A og 3B.

(A) MiaPaCa-2 og Panc-1-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af annoncer i Gmail (0, 20, 40 og 60 ug /ml) i komplet medium i 48 timer, derefter høstet til analyse af apoptotiske celler ved FACS-analyse under anvendelse af Annexin V-Alexa Fluor488 Apoptose Vybrant Assay Kit (Alexa488) efter producentens protokol. Den nederste højre (LR) kvadrant af FACS histogrammer viser procentdelen af ​​tidlige apoptotiske celler (Alexa488-farvede celler) og øverste højre (UR) kvadrant angiver den procentdel af sene apoptotiske celler (Alexa488 + propidiumiodid-farvede celler). (B) Total procentdele af apoptotiske celler i hver behandlingsgruppe efter 48 timer samlet med data præsenteret som middelværdi ± SD af to eksperimenter. Signifikant forskel

vs

kontrolgruppe (ikke-annoncer i Gmail-behandlet), *

P

. 0,001; **

P

0,05. (C) Behandling af MiaPaCa-2 og PANC-1-celler med varierende koncentrationer af annoncer i Gmail i 48 timer resulterer i en dosisafhængig reduktion i ekspressionsniveauerne af de anti-apoptotiske proteiner (Bcl-2 og Bcl-XL) samtidig øge ekspression af pro-apoptotisk protein Bax. Annoncer i Gmail også øge aktiveringen niveau af caspase-3 i celler.

Virkning af annoncer i Gmail på proteinerne Bcl-2-familien i bugspytkirtelkræftceller

Medlemmer af Bcl-2-familien af proteiner spiller afgørende roller i reguleringen af ​​apoptose ved at fungere som promotorer eller inhibitorer af celledød [26] – [28]. Western blot-analyse viste, at behandling af MiaPaCa-2-celler med annoncer i Gmail (20, 40, 60 ug /ml) i 48 timer resulterede i en dosisafhængig reduktion i Bcl-2 og Bcl-xl proteinekspression (figur 3C) ved udtrykket af Bax var markant opreguleret med stigende koncentrationer af annoncer i Gmail (figur 3C). blev også fundet lignende virkning af annoncer i Gmail på proteinerne Bcl-2-familien, når PANC-1-celler blev behandlet med annoncer i Gmail i 48 timer. Som spaltet caspase 3 anses for at være kendetegnende for apoptose, vi også bestemt effekten af ​​annoncer i Gmail på det spaltede caspase-3 i disse prøver, og bekræftede, at annoncer i Gmail øget aktivering eller spaltning af caspase-3 i både MiaPaCa-2 og PANC -1 celler (figur 3C).

annoncer i Gmail hæmmer PI3K /Akt udtryk i cancerceller

Som PI3K /Akt signalvejen spiller en kritisk rolle i kræftcellen overlevelse og udvikling af kræft, vi undersøgte virkningerne af annoncer i Gmail på denne celleoverlevelse pathway. MiaPaCa-2 og PANC-1-celler blev behandlet med annoncer i Gmail i 48 timer, cellelysater fremstillet og niveauet for PI3K og phosphorylering af Akt ved Ser

473 bestemt ved Western blot-analyse. Resultaterne viste, at behandling af disse cellelinjer med annoncer i Gmail i 48 timer faldt niveauerne af både den regulerende (p85) og katalytiske (p110) underenheder af PI3K og også reduceret phosphorylering af Akt ved Ser

473 i en koncentrationsafhængig måde (figur 4A). Da det er velkendt, at Akt aktivitet normalt er reguleret af PI3K, vi yderligere bekræftet, at Akt er reguleret af PI3K i bugspytkirtelkræftceller. Til dette formål vi bankede-down PI3K i MiaPaCa-2 og PANC-1-celler under anvendelse af PI3K siRNA kit (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) ved at følge fabrikantens protokol. Som vist i figur 4B, western blot-analyse afslørede, at siRNA knockdown af PI3K resulterede i markant reduktion i niveauerne af p-Akt i begge MiaPaCa-2 og PANC-1-celler. Imidlertid var virkningen på total Akt ekspression ikke observeret i disse cellelinier på siRNA knockdown af PI3K. Knockdown af PI3K-proteiner blev også bekræftet under anvendelse af western blotting.

(A) Behandling af MiaPaCa-2 og Panc-1-celler med annoncer i Gmail formindsker ekspressionsniveauet af PI3Kp85 (regulatoriske) og PI3Kp110 (katalytisk), og phosphorylering af Akt på en dosis-afhængig måde. Efter behandling i 48 timer blev cellerne høstet, og cellelysater blev underkastet western blot-analyse for at bestemme ekspressionen af ​​forskellige proteiner. β-actin blev anvendt til at verificere lige belastning af proteinprøver. (B) siRNA knockdown af PI3K i bugspytkirtelkræftceller resulterede i reduktion af p-Akt niveau sammenlignet med siRNA kontrolgruppen.

Dietary annoncer i Gmail hæmmer væksten af ​​pancreas tumorxenografter i athymiske nøgne mus

Da disse

in vitro

undersøgelser viste, at behandling af bugspytkirtelkræftceller med annoncer i Gmail reducerer levedygtighed og inducerer apoptose af disse celler, vi søgte at afgøre, om kosten administration af annoncer i Gmail inhiberer

in vivo

tumorvækst ved anvendelse af et xenotransplantat musemodel. Som den terapeutiske virkning af annoncer i Gmail på MiaPaCa-2 og PANC-1 cellelinier blev identiske valgte vi MiaPaCa-2 cellelinie til disse

in vivo

undersøgelser. I tidligere undersøgelser har vi også fundet, at kosten annoncer i Gmail ved en dosis på 0,5% inducerede signifikante væksthæmmende effekter på tumorer [9], [29], valgte vi denne dosis af annoncer i Gmail for yderligere

in vivo

undersøgelse. Musene fik AIN76A kontrol diæt alene eller den samme kost suppleret med annoncer i Gmail (0,5%, vægt /vægt). De gennemsnitlige kropsvægte for annoncer i Gmail-behandlede og ikke-annoncer i Gmail-behandlede mus var sammenlignelige i forsøgsperioden (data ikke vist). Tilsvarende havde musene, der blev givet annoncer i Gmail i deres kost ikke udviser nogen fysisk tegn på toksicitet eller unormal adfærd (data ikke vist). Disse data antyder, at administration af annoncer i Gmail i kosten ved koncentrationen anvendt i disse undersøgelser ikke er forbundet med tilsyneladende grov toksicitet.

Ugentlig måling af tumorvolumen viste, at den gennemsnitlige tumorvækst i forhold til den samlede tumorvolumen /mus var højere i de ikke-annoncer i Gmail-behandlede mus end de annoncer i Gmail-behandlede grupper. Som vist i figur 5A, i mus, som fik annoncer i Gmail ved en dosis på 0,5% i deres kost, tumorvolumenet ved afslutning af forsøget var 64% (

P

0,005) mindre. Eksperimentet blev afsluttet på 11

th uge efter tumorceller implantation. På dette tidspunkt blev musene aflivet, tumorerne høstet, og den våde vægt af tumoren /mus i hver behandlingsgruppe blev registreret. Som vist i figur 5A (højre panel), vådvægt tumorerne var 68% lavere (

P

0,005) hos mus administreret 0,5% annoncer i Gmail i kosten sammenlignet med tumorerne fra ikke-annoncer i Gmail -behandlede mus.

(A) Dietary administration af annoncer i Gmail (0,5%, vægt /vægt) inhiberer væksten af ​​MiaPaCa-2-celler dyrkes som xenotransplantater i athymiske nøgne mus. Gennemsnitlig tumorvolumen ± SD /mus (mm3) i hver behandlingsgruppe blev målt på ugentlig basis. Tumor xenograft væv blev høstet ved afslutningen af ​​forsøget på 11 uger, og den våde vægt af tumoren /mus i hver gruppe er rapporteret i gram som middelværdi ± SD. Statistisk signifikans af forskellen mellem kontrol og annoncer i Gmail-behandlede grupper blev analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni

t

test, n = 8. Statistisk signifikans

vs

tumorer fra ikke-GSPs- behandlede kontrol mus, *

P

0,005. (B) Den immunhistokemisk påvisning af TUNEL-positive celler i tumor xenograft væv fra mus administreret annoncer i Gmail i kosten og mus ikke modtager annoncer i Gmail er vist, og deraf data på TUNEL-positive celler samlet. (C) Immunhistokemisk påvisning af aktiverede caspase-3-positive celler i tumor xenograft væv fra annoncer i Gmail-behandlede og ikke-annoncer i Gmail-behandlede mus. Immunohistokemiske data i form af procentdelen af ​​positive celler er præsenteret som middelværdi ± SD af 5-6 tumorprøver fra hver gruppe. TUNEL-positive eller caspase-3-positive celler blev talt i fire til fem forskellige områder, og data er opsummeret i form af procent positive celler fra 5-6 tumor xenograft prøver. Repræsentative mikrografer er vist. (D) Dietary annoncer i Gmail inhibere ekspressionen af ​​anti-apoptotiske proteiner samtidig øge ekspressionen af ​​pro-apoptotisk protein, Bax, og niveauerne af aktiverede caspase-3 i tumor xenograft væv. Tumorlysater blev fremstillet ud fra tumorxenotransplantater indsamlet ved afslutning af eksperimentet beskrevet i figur 5A og underkastet western blot-analyse, som beskrevet i Materialer og metoder. Repræsentative blots vises fra uafhængige forsøg fra mindst fem tumorer fra fem forskellige mus per gruppe med identiske observationer.

Dietary annoncer i Gmail forbedre apoptotisk celledød af pancreas tumorceller i xenotransplantater

Til bestemme, om inhibering af tumorvækst med kosten annoncer i Gmail er forårsaget af død af tumorceller i xenograft væv, vi evaluerede effekten af ​​annoncer i Gmail på den apoptotiske indeks af tumorceller i xenograft prøver under anvendelse en TUNEL assay.