PLoS ONE: HMGA1 inducerer Intestinal polypose i transgene mus og styringer Tumor Progression og Stem Cell Properties i Colon Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Selvom metastatisk tyktarmskræft er en førende årsag til kræft død verdensplan, de molekylære mekanismer, som sætter coloncancerceller til at metastasere fortsat uklare. Nye beviser tyder på, at metastatiske celler udvikler ved tilrane transkriptionelle netværk fra embryonale stamceller (ES) celler til at fremme en epitelial-mesenkymale overgang (EMT), invasion, og metastatisk progression. Tidligere undersøgelser identificeret HMGA1 som en central transskription faktor beriget med ES-celler, tyktarmskræft og andre aggressive tumorer, selv om dens rolle i disse indstillinger er dårligt forstået.

Metoder /vigtigste resultater

For at bestemme hvordan HMGA1 funktioner i metastatisk tyktarmskræft, vi manipuleret

HMGA1

udtryk i transgene mus og kolon kræftceller. Vi opdagede, at HMGA1 driver proliferative ændringer, afvigende krypt-dannelse og intestinal polyposis i transgene mus. I kolon kræft cellelinjer fra dårligt differentierede, metastatiske tumorer, knock-down af HMGA1 blokke forankringsuafhængig cellevækst, migration, invasion, xenograft tumorigenese og tre-dimensionelle colonosphere formation. Hæmme

HMGA1

udtryk blokke tumorigenese ved begrænsende fortyndinger, i overensstemmelse med udtynding af tumor-initiator celler i knock-down celler. Knock-down af HMGA1 hæmmer også metastatisk progression til leveren

in vivo

. I metastatiske kolon kræftceller, HMGA1 inducerer ekspressionen af ​​

Twist1

, et gen involveret i embryogenese, EMT, og tumor progression, mens HMGA1 undertrykker

E-cadherin

, et gen, der nedreguleres under EMT og metastatisk progression. Desuden

HMGA1

er blandt de mest berigede gener i tyktarmskræft sammenlignet med normal slimhinde.

Konklusioner

Vores resultater viser for første gang, at HMGA1 driver proliferative ændringer og polyp dannelse i tarmene af transgene mus og inducerer metastatisk progression og stamceller-lignende egenskaber i kolon kræftceller. Disse fund indikerer, at HMGA1 er et centralt regulator, både i metastatisk progression og i opretholdelsen af ​​en stilk-lignende tilstand. Vores resultater tyder også på, at HMGA1 eller nedstrøms veje kunne være rationelle terapeutiske mål i metastatisk, dårligt differentieret tyktarmskræft

Henvisning:. Belton A, Gabrovsky A, Bae YK, Reeves R, Iacobuzio-Donahue C, Huso DL, et al. (2012) HMGA1 inducerer Intestinal polypose i transgene mus og styringer Tumor Progression og Stem Cell Properties i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 7 (1): e30034. doi: 10,1371 /journal.pone.0030034

Redaktør: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, USA

Modtaget: Juli 29, 2011; Accepteret: 12. december, 2011; Udgivet: januar 20, 2012 |

Copyright: © 2012 Belton et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding kom fra National Institutes of Health (NIH) RO1CA092339 og R21CA2149550 til L. Resar, NIH T32HL007525 til A. Belton, og Maryland Stem Cell Research Fund til L. Resar og A. Belton. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af de seneste fremskridt i kolorektal screening og behandling af kræft, metastatisk kolorektal cancer er fortsat en førende årsag til kræft død på verdensplan [1] – [2]. De molekylære mekanismer, som sætter kræftceller til at metastaserer er dårligt forstået, selv om ny dokumentation viser, at transkriptionelle netværk, der kræves for stamcelle egenskaber under embryogenese er koopterede under metastaserende progression [3] – [4]. Nylige undersøgelser identificerede HMGA1 som en central transkriptionsfaktor beriget i humane embryonale stamceller (ES-celler) [3], hæmatopoietiske stamceller [5] – [8], refraktær leukæmi [6] – [7], [9] og høj kvalitet /ringe differentierede kræftformer fra brystet, hjernen, og blære [3]. Desuden tumorer overekspression

HMGA1

og otte andre ES transskription faktor gener havde nedsat overlevelse, hvilket understreger vigtigheden af ​​disse gener i tumor progression [3]. For nylig fandt vi, at HMGA1 proteinniveauer korrelerer med dårlig differentiering status og nedsat overlevelse i pancreascancer, yderligere implicerer HMGA1 i en udifferentieret, stængel-lignende tilstand og tumorprogression [10].

HMGA1

genet koder for HMGA1a og HMGA1b kromatin remodeling proteiner, der fungerer til at modulere genekspression ved ændring chromatin struktur og samling transskriptionsfaktor komplekser ved specifikke promotorer [11] – [18]. Tidligere undersøgelser viser, at HMGA1 inducerer onkogene egenskaber i dyrkede celler [19] – [27] og forårsager aggressive tumorer i transgene mus [9], [28] – [32]. De præcise molekylære veje reguleret af HMGA1 i transformation, er imidlertid kun begyndt at dukke op og undersøgelser for at belyse HMGA1 transkriptionelle netværk sandsynligvis afdække grundlæggende involverede veje i tumor progression og udvikling.

Her rapporterer vi for første gang, at HMGA1 driver proliferative ændringer og polyp dannelse i tarmene af transgene mus og dirigerer molekylære veje vigtige i tumor progression og stamceller egenskaber i humane colon cancerceller. Tilsammen tyder disse resultater på, at

HMGA1

fremmer tumor progression i tyktarmskræft ved omprogrammering tyktarmsepitel til en stilk-lignende tilstand.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med en protokol godkendt af Johns Hopkins University Animal Care og brug Udvalg (protokol # MO08M263). Alle mus blev holdt i et sterilt miljø, hvor de havde fri adgang til foder og vand som angivet i vores institutionelle retningslinier.

Kvantitativ revers transskription-PCR (QRT-PCR) analyse.

RNA var fremstillet som vi beskrevet [9], [27]. Primerne for

HMGA1

[28],

Twist

,

Vimentin

,

E-cadherin

,

FOXC2

,

Snail1

,

Slug

,

TCF-3

,

Twist1

,

Twist2

,

SFH1B

) var tidligere beskrevet [4].

GAPDH

primere er kommercielt tilgængelige (Applied Biosystems). QRT-PCR-reaktioner blev udført tre gange og gentages mindst en gang

Western analyse

Western analyser blev udført som vi beskrevet [9], [19] -.. [20], [33 ] ved hjælp af en kommerciel HMGA1 antistof (Abcam, katalog # AB4078) fortyndet 1:1000 og β-actin (Cell Signaling, katalog # 4967) fortyndet 1:1000 som en endogen kontrol.

cellelinjer.

HCT116 (CCL-247; American Type Culture Collection) og SW480 (CCL-228; American Type Culture Collection) blev dyrket som anbefalet. Transficerede celler blev udvalgt i puromycin (3 ug /ml)

vækstkurver

Cellular vækstrater blev bestemt som vi tidligere beskrevet [19] -.. [20], [26] – [ ,,,0],29], [33]

Anchorage-uafhængig cellevækst i bløde agar, migration og invasion analyser

Disse analyser blev udført som vi beskrevet [19] -.. [20], [ ,,,0],26] – [28], bortset fra, at migration assay blev udført med 60.000 celler /brønd og invasion assays blev udført med 20 ul af vækstfaktor reduceres matrigel

Colonosphere assay

Colonosphere assays.. blev udført som tidligere beskrevet [34].

In vivo

metastase assay.

Dette assay blev udført som tidligere beskrevet [35] med celler (10

5 ) injiceret pr mus (NOD /Shi-

scid

/IL-2Ry

null;.. Jackson Laboratory)

xenograft tumorgenicitet

Disse undersøgelser blev udført i nøgen (nu – /-) mus som vi beskrevet [19] -. [20].

Vektorer

Den korte hårnål RNA (shRNA) interferens plasmid for

HMGA1

har blevet beskrevet [36]. Den tomme shRNA vektoren blev anvendt som kontrol.

Immunohistokemisk analyse.

Vævssnit (4 um tykke) fra tynd- og tyktarm fra transgene mus og kontrolmus blev dannet og afparaffiniseret i xylen og derefter hydreret i en gradueret alkoholserie. Heat epitopgenfinding blev udført i en autoklav i 10 minut i natriumcitratbuffer (pH 6,0). Endogen peroxidaseaktivitet blev inaktiveret ved inkubering af sektionerne i 4% H

2O

2 i 5 minutter. Efter skylning i phosphatbufret saltvand blev sektionerne inkuberet med kanin monoklonalt anti-Ki-67-antistof (klon 30-9, Ventana, Tucson, AZ, katalog # 790-4286) i 1 time ved stuetemperatur. Positiv farvning blev visualiseret med DAKO EnVision Plus-HRP detektion kit (DAKO, Carpinteria, CA) ifølge producentens instruktioner. Ki-67 positive celler blev talt i 5 tilfældigt udvalgte felter fra tilsvarende områder i tynd- og tyktarmen fra transgene mus og kontrolmus ved 20 ganges forstørrelse. I alt 100 krypter for hver mus blev talt fra farvede sektioner fra transgene og kontrol mus (2 mus /gruppe).

Cell morfologi og størrelse bestemmelser.

Cellerne blev belagt og lov til at vokse til 80% konfluens. Fotografier til målinger morfologisk vurdering og diameter blev opnået ved hjælp af Zeiss Inverted M-scope med Olympus DP72 kamera og software (JHMI Confocal Facility). Mindst fem tilfældige felter blev fotograferet for hver cellelinje med eller uden HMGA1 knock-down. Den største diameter (um) blev målt for 700-1000 celler fra hver gruppe. De største diametre var repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelsen; signifikans blev bestemt ved hjælp af t-test.

Resultater

HMGA1a

transgene udvikle polypper og ekspansion i knoglemarven

For at definere den rolle af HMGA1 i tumorigenese, vi manipuleret transgene mus med de murine

hmga1a

transgen drevet af H2K promotoren og immunoglobulin mu enhancer [9], [27] – [29]. Som tidligere rapporteret, alle mus bukke under for aggressiv lymfecancer [9], og hunnerne udvikle uterine sarkomer [28] – [29]. For at bestemme om HMGA1 fremmer neoplastisk transformation i tarmepitelet, undersøgte vi tarmene fra disse mus. Den transgen udtrykkes i de små og store tarme med 4 til 7 gange over, der findes i kontroller (fig. S1). Ved obduktion tarmene er hyperæmiske med en fortykket slimhinde og øget vægt sammenlignet med kontroller (Fig. 1A-D). Histologisk både store og små tarme udviser markeret proliferative forandringer, ektopisk krypt dannelse og polyp dannelse (fig. 1C-D). Der var en signifikant stigning i Ki-67 i både tynd- og tyktarmen, en markør for proliferation (fig. 2A-B). Stigningen i krypt nummer tyder på, at disse mus kan have udvidelse af den intestinale stamceller ved [37].

(A)

HMGA1

transgene tarme er hyperæmiske med øget vægt i forhold til kontroller ( n = 7 i hver gruppe;. p = 0,000000138 ved t-test) (B) Polyp nummer i transgene og kontrol (n = 7 i hver gruppe, p = 0,000426 ved t-test). De intestinale smørepålæg (højre paneler) farves med 1,5% methylenblåt at fremhæve polypper til tælling. (C) hematoxylin og eosin-farvning af tynd- og tyktarmen viser markeret proliferative ændringer i transgene (bar = 50 um). (D) Udvidelse af det proliferative zone resulterer i et diffust hyperplastisk udseende af slimhinden og cystically dilaterede krypter i transgene. Den højere magt udsigt over tyndtarmens slimhinde viser dannelse af ektopisk krypt foci (pile).

(A) Ki-67 farvning af små og store tarmene fra

HMGA1

transgene ( bundpaneler) og kontrol mus (øverste paneler) viser en betydelig stigning i Ki-67 immunoreaktivitet i

HMGA1

transgene (20 × forstørrelse). (B) Ki-67 positive celler i

HMGA1

transgene og kontrol mus blev optalt i krypter af små og tyktarmen på 20 × forstørrelse. Middelværdien ± standardafvigelser ved Ki-67 positive celler pr krypt for 100 krypter for hvert par af mus på hver lokalitet er vist. Meget signifikante forskelle blev påvist mellem transgene og kontroller på både de små og store tarme (p 0,00001, t-test) (C)

HMGA1

udtryk blev vurderet ved QRT-PCR og steg i den primære, høj klasse (klasse 3-4) kolon adenokarcinomer sammenlignet med tilstødende, normal colon væv.

β-actin

blev anvendt til at kontrollere for lastning og det normale væv blev arbritrarily tildelt en værdi på 1,0. (D) Western blot-analyse for HMGA1 og kontrolprotein (GAPDH) blev udført på 3 tumorer med tilstrækkelig prøve og viste stigende HMGA1 protein med faldende differentiering og stigende invasionsevne eller regulær metastase. Karakteren, differentiering status, invasiv, og tilstedeværelse af metastatisk sygdom er angivet.

HMGA1

er beriget i humane coloncarcinomer

Høje niveauer af HMGA1 protein eller mRNA blev rapporteret i colon cancer cellelinjer eller primære tumorer i et lille pilotforsøg [38]. At afgøre, om

HMGA1

er overudtrykt i større studier af primære kolon kræft, vi forespørges genekspression profil analyse af primære tyktarmskræft fra seks uafhængige undersøgelser gennem Oncomine ™ offentlige database (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI). Vi fandt, at

HMGA1

er stærkt beriget i colon adenocarcinom i forhold til normalt væv i 5/5 tidligere undersøgelser. I alle disse undersøgelser, HMGA1 var blandt de 10% af berigede gener, og i 4 forsøg, var blandt de øverste 1-3% af berigede gener. I en pilot i 10 primære, high-grade (grad III-IV) tyktarmskræft (en generøs gave fra Bert Vogelstein), fandt vi, at HMGA1 udtryk blev øget i de fleste tyktarmskræft prøver (8/11) i forhold til tilstødende normale væv fra den samme patient. Desuden blev den gennemsnitlige HMGA1 ekspression fra alle tumorer steg med 3 gange sammenlignet med det tilstødende kontrolvæv (fig. 2C). Vi vurderede også proteinekspression i en delmængde af primære kolon tumorer med tilstrækkelig materiale og fundet de højeste niveauer af HMGA1 protein i høj kvalitet, metastatiske tumorer med ikke-detekterbare niveauer i det tilstødende normale væv (fig. 2D).

HMGA1 er nødvendig for forankringsuafhængig cellevækst, migration, invasion, og tumorigenese i kolon kræftceller

for at undersøge den funktionelle rolle HMGA1 i tyktarmskræft, vi hæmmede

HMGA1

udtryk i to kolon cancer cellelinjer afledt af dårligt differentierede (grad 4), metastatisk tyktarmskræft (HCT116 og SW480) ved hjælp af en shRNA tilgang. Transfektion af celler med en

HMGA1

shRNA vektor resulterede i en signifikant, stabil nedgang i HMGA1 protein (fig. 3A) i shRNA celler sammenlignet med celler transficeret med kontrolvektoren. Vi fandt, at knock-down af HMGA1 blokeret forankringsuafhængig vækst celle eller foci-dannelse i blød agar, migration og invasion i begge HCT116 og SW480-celler (fig. 3B-C). Desuden ingen tumorer dannet i nøgne mus efter injektion af HCT116 celler med HMGA1 knock-down (10

5 eller 10

4 celler), mens tumorer dannet ud fra celler transficeret med kontrol vektorer (Fig. 3D). Der var ingen signifikant forskel i vækstraterne i cellelinier med eller uden HMGA1 knock-down

in vitro

(fig. S2), hvilket indikerer, at

HMGA1

shRNA ikke var giftige for tyktarmen cancerceller. Disse resultater viser, at HMGA1 driver cellulære egenskaber, der kræves for både tumor initiering (forankringsuafhængig cellevækst, tumorigenese) og tumorudvikling (migration, invasion).

(A) Transfektion med et shRNA knockdown vektor til

HMGA1

i meget aggressive, dårligt differentierede kolon kræftceller menneskelige (HCT116 og SW480) resulterer i et betydeligt fald i HMGA1 protein. (B) Migration og invasion blev vurderet i kontrol (mørke søjler) og HMGA1 knock-down (åbne søjler) tyktarmskræft celler (HCT116 og SW480). Grafen viser middelværdien ± standardafvigelsen fra 2 forsøg gennemført in triplo. (P-værdier bestemt ved Students t-tests er vist). (C) forankringsuafhængig cellevækst i blød agar i kontroldyr (mørke søjler) og HMGA1 knock-down (åbne søjler) coloncancer-celler (HCT116 og SW480). Alle foci 50 um blev talt. Søjlediagrammet viser middelværdien ± standardafvigelsen fra to forsøg gennemført in triplo. (P-værdier bestemt ved Students t-tests er vist). (D) Tabellen viser, at knock-down af HMGA1 blokke tumordannelse på begrænsende fortyndinger. Fotografiet viser repræsentative nøgne mus 4 uger efter injektion med kontrol eller HMGA1 knock-down i HCT116 celler (10

5 /injektion). Ingen tumorer dannet i HMGA1 knock-down celler.

HMGA1-afhængige stamceller egenskaber i kolon kræftceller

Fordi

HMGA1

er beriget i stamceller [ ,,,0],5] – [8] og forårsager ændringer i mus tarmen, der kunne være i overensstemmelse med ekspansion i den intestinale stamceller ved, vi søgte at afgøre, om

HMGA1

er involveret i stamcelle ejendomme i tyktarmen kræftceller. Til dette formål, vurderede vi tre-dimensionelle colonosphere dannelse i tyktarmskræft cellelinjer med eller uden knock-down af HMGA1. Vi opdagede et signifikant fald i antallet af colonospheres i både HCT116 og SW460 celler med HMGA1 knock-down sammenlignet med kontroller (Fig. 4A). Disse fund indikerer, at HMGA1 er nødvendig for denne stamcelle-fænotype (tredimensional vækst) i colon cancerceller. I begrænsende fortynding tumorigenisitetsforsøg eksperimenter, knock-down af HMGA1 blokeret tumordannelse når 104 eller 105 celler blev injiceret, mens tumorer dannet i kontrol celler. Tumorer dannet i både kontrol og knock-down grupper, hvis 106 celler blev injiceret (Fig.3D). Disse resultater indikerer, at knock-down af HMGA1 dræner tumor-initiator-celler.

(A) Tre-dimensionel colonosphere dannelse i kontrol (mørke søjler) og HMGA1 knock-down (åbne søjler) coloncancerceller (HCT116 og SW480). Sfærer blev talt efter 10 dage. Grafen viser middelværdien ± standardafvigelsen fra 3 forsøg gennemført in triplo. (P-værdier bestemt ved Students t-tests er vist). (B) metastatiske foci i leveren blev talt 5 uger efter injektion af kontrol (mørke søjler) eller HMGA1 knock-down (åbne søjler) HCT116-celler (1 x 10

5) i milten fra nøgne mus. Søjlediagrammet viser middelværdien ± standardafvigelsen af ​​metastatiske foci fra to forsøg gennemført in triplo. Musene injiceret med kontrolceller (sort bar) blev sammenlignet med mus injiceret med HMGA1 knock-down celler (åbne søjler; P-værdier bestemt ved Students t-tests er vist). (C) Gross fotografier af metastatiske foci til leveren efter injektion af HCT116 celler i milt fra Jude mus. Den venstre leveren tages fra en repræsentativ mus injiceret med kontrolceller; højre leveren er taget fra en repræsentativ mus injiceret med HMGA1 knock-down celler. Fotografier skildrer repræsentative lever fra mus, der fik kontrol eller

HMGA1

knock-down celler. (D) Histologisk undersøgelse af leverne bekræftet, at de metastatiske foci er steget betydeligt fra milten injiceret med kontrol celler sammenlignet med HMGA1 knock-down celler (Bar = 100 um).

HMGA1 er nødvendig for metastatisk progression i tyktarmskræft

at afgøre, om HMGA1 er nødvendig for tumor progression, vi brugte en præklinisk model for metastatisk progression i tyktarmskræft [35]. HCT116 colon cancerceller blev injiceret direkte i milt fra immunsvækkede mus og levermetastaser blev vurderet efter 5 uger. Påfaldende, fandt vi et markant fald i metastatiske foci i leverne fra mus injiceret med HMGA1 knock-down celler (fig. 4B-C). Disse resultater understreger den kritiske rolle HMGA1 i metastatisk progression i denne model.

HMGA1 inducerer ekspression af EMT gener

Twist1

og

Vimentin

Fordi nylige undersøgelser link EMT til epitel stamceller egenskaber [3] – [4], søgte vi at bestemme, om HMGA1 regulerer EMT-gener i tyktarmskræft. Til dette formål har vi vurderet ekspressionsniveauer af 11 gener, der tidligere er vist at spille en vigtig rolle i EMT og kræft initiator-celler [4]. I HCT116 celler, fandt vi, at både

Twist1

og

Vimentin

var signifikant undertrykt i celler med HMGA1 knock-down (fig. 5A), hvilket indikerer, at HMGA1 inducerer deres udtryk. I SW480 celler,

E-cadherin

er opreguleret i knock-down celler, hvilket antyder, at HMGA1 normalt undertrykker sit udtryk (fig. 5B).

Twist1

var også signifikant undertrykt i SW480 knock-down celler, selv om mindre end hvad vi har observeret i HCT116 celler. Tilsammen vore undersøgelser antyder, at HMGA1 fremmer tumor progression gennem transkriptionelle netværk, der letter metastatisk progression og en stilk-lignende tilstand, i det mindste delvis, ved at inducere

Twist1

og

vimentin

, mens undertrykke

E-cadherin

. Af note, var der ingen ændringer i cellemorfologi eller størrelse i knock-down celler (Fig. S3), hvilket antyder, at nedregulering af HMGA1 i disse celler er ikke tilstrækkelig til at inducere morfologiske ændringer i overensstemmelse med en tilbagevenden til en mere epitel tilstand når de dyrkes som et monolag. Som tidligere bemærket, var der signifikante ændringer i vækstkarakteristika ved dyrkning i en forankringsuafhængig måde eller efter implantation i mus. Variationen i EMT-gener moduleret af HMGA1 i disse to forskellige cellelinier sandsynligvis afspejler forskellige miljø og omprogrammering potentiale i kræftcellerne baseret på underliggende genetiske og epigenetiske ændringer.

(A) I HCT116 celler,

Twist1

, og

vimentin

mRNA-ekspression blev undertrykt af QRT-PCR i HMGA1 knock-down celler sammenlignet med kontrol celler.

E-cadherin

andre EMT gener blev ikke påvirket i disse celler. (P-værdier bestemt af den studerendes t-tests er vist). (B) I SW480 celler,

Vimentin

er undertrykt og

E-cadherin

induceres i cellerne med HMGA1 knock-down. (P-værdier bestemt af den studerendes t-tests er vist).

Diskussion

Metastatisk tyktarmskræft er meget dødbringende og forekomsten er stigende, især i yngre individer [1] – [2]. Nuværende terapier er begrænset af fremkomsten af ​​metastatiske cancerceller, som er resistente over for behandling. De seneste oplysninger tyder på, at disse ildfaste celler udvikler, fordi de selvsupplering de trådløse netværk, der er involveret i fosterudviklingen og bliver i stand til metastaserende og unddrage terapi [3] – [4].

HMGA1

onkogen blev for nylig identificeret som en central transskription faktor beriget med ES-celler og høj kvalitet tumorer med dårlige resultater [3], selv om dens funktion i disse indstillinger har været undvigende. Dette gen er medlem af

HMGA

gen familie, der også omfatter

HMGA1

[11] – [18] og

HMGA2

[31], [39] – [40]. Alle HMGA proteiner er små, lav molekylvægt (således høj mobilitet gruppe proteiner) med en AT-hook DNA bindende domæne, der medierer binding til AT-rige regioner i minor groove i kromatin. HMGA1 og andre AT-hook proteiner menes at fungere ved at modulere chromatin struktur og genekspression [15] – [18], [41] – [42]. Her viser vi for første gang, at

HMGA1

inducerer proliferative ændringer og polyp dannelse i tarmene af transgene mus. Desuden

HMGA1

er påkrævet for begrænsende fortynding tumorigenese

in vivo

sammen med 3-dimensionel colonosphere dannelse

in vitro

, som begge er fænotyper karakteristiske for epitelceller stamceller. Endvidere inhibering

HMGA1

udtryk blokke ikke kun transformation egenskaber er involveret i tumor initiering (forankringsuafhængig cellevækst, tumorigenicitet), men også cellulære egenskaber, der fremmer metastatisk progression (invasion og migration). Vi opdagede også, at

HMGA1

er nødvendig for metastatisk progression til leveren

in vivo

. Navnlig er flere nye undersøgelser også vist, at

HMGA1

er beriget i normale stamceller, herunder embryonale og hæmatopoietiske stamceller [3] – [8], foruden ringe differentierede, eller ildfaste stamceller-lignende cancere [ ,,,0],8] – [32], hvilket antyder, at HMGA1 hjælper til at drive en stilk-lignende tilstand, hverken under normal udvikling og cancer.

HMGA1

er også stærkt til udtryk under embryogenese, med lav eller målbart udtryk i de fleste differentierede, voksent væv [43].

For at bestemme, hvordan HMGA1 orchestrates tumor progression og stamceller fænotyper, undersøgte vi udtryk af gener, der tidligere har vist sig at være vigtig i EMT, udvikling og tumor initiator celler [4]. I HCT116 celler, fandt vi, at HMGA1 opregulerer ekspressionen af ​​både

Twist1

og

Vimentin

. I SW480 celler, HMGA1 også up-regulerer

Twist1

, mens det undertrykker

E-cadherin

.

E-cadherin

ændrede sig ikke i HCT116 tyktarmskræft celler med knock-down af

HMGA1

, som kunne afspejle stabil lyddæmpning af

E-cadherin

i disse mesenkymale, højt metastatisk tyktarmskræft cellelinjer. De transkriptionelle netværk reguleret af HMGA1 afhænger sandsynligvis af den cellulære miljø og underliggende genetiske og epigenetiske egenskaber.

Sammenfattende vores undersøgelser giver det første beviser, der forbinder HMGA1 til cellulære egenskaber og transkriptionelle netværk vigtige i stamceller, EMT, og metastatisk progression i tyktarmskræft. Selvom der er behov for yderligere arbejde, disse resultater understreger betydningen af ​​HMGA1 som en vigtig regulator i tumor progression og en stilk-lignende tilstand i tyktarmskræft og foreslå, at målrette HMGA1 veje kunne være gavnlig i behandling for tyktarmskræft. Fordi

HMGA1

er beriget i embryonale stamceller, vævsspecifikke stamceller, og stort set alle aggressive tumorer studeret til dato, vores resultater vil sandsynligvis relevant ikke kun for menneskets forskellige kræftformer, men også til normal udvikling.

Støtte Information

Figur S1.

HMGA1

transgen udtryk gennem små og store tarme i transgene (TG) mus i forhold til vildtype (WT) kontroller. QRT-PCR for

HMGA1

og kontrol-genet,

GAPDH

, blev udført fra væv opnået i hele tyndtarmen (duodenum, jejunum, ileum og) og tyktarmen (colon ascendens, betegnet A colon og colon descendens, betegnet D kolon) fra TG og WT mus.

HMGA1

udtryk i TG tarmene øges med 4 til 8 gange over det observerede i WT mus, der vilkårligt blev tildelt en værdi på 1. Alle QRT-PCR-reaktioner blev udført i tre eksemplarer og gentagne mindst engang

doi:. 10,1371 /journal.pone.0030034.s001

(TIF)

Figur S2.

proliferationshastigheder i HCT116 eller SW480 tyktarmskræft celler med HMGA1 knock-down eller kontrol vektor. (A) Vækstrater af HCT116 celler transficeret med

HMGA1

shRNA vektor til knock-down HMGA1 (røde firkanter) eller kontrol vektor (blå cirkler) viser en tilsvarende spredning sats. Standardafvigelser er ≤10% og derfor ikke synlig. (B) Vækstrater af SW480 celler transficeret med kontrol vektor (blå cirkler) eller

HMGA1

shRNA vektor (røde firkanter) viser en tilsvarende spredning sats. Standardafvigelser er ≤10% og derfor ikke synlig

doi:. 10,1371 /journal.pone.0030034.s002

(TIF)

Figur S3.

HMGA1 knock-down resulterer i ændringer i EMT-gener uden ændringer i cellemorfologi. (A) Knock-down af HMGA1 i HCT116 celler ikke medføre ændringer i cellemorfologi eller diameter sammenlignet med kontroller. (B) Knock-down af HMGA1 i SW480 celler ikke medføre ændringer i cellemorfologi eller diameter sammenlignet med kontroller. Fotografier blev taget af levende celler ved hjælp af en 10 × mål; skala bar, 100 um

doi:. 10,1371 /journal.pone.0030034.s003

(PPTX)