PLoS ONE: Tab af PTEN Letter Rosiglitazon-medieret Forbedring af Platinum (IV) Complex LA-12-induceret apoptose i tyktarmskræft Cells

Abstrakt

Vi viste for første gang en enestående evne til rosiglitazon at mægle en dyb forøgelse af LA-12-induceret apoptose i forbindelse med aktivering af mitochondrial vej hos humane coloncancer-celler. Denne virkning blev fortrinsvis observeret i G1 cellecyklusfase, uafhængig af p53 og PPARy-proteiner, og ledsaget med betydelige ændringer af udvalgte Bcl-2-familien proteinniveauer. Yderligere stimulering af samarbejde synergiske cytotoksiske virkning af rosiglitazon og LA-12 blev påvist i de celler, der mangler for PTEN, hvor mitokondrie apoptosecyklus var mere stimuleret og G1-fasen-associerede døende blev forstærket. Vores resultater tyder på, at kombineret behandling med rosiglitazon og LA-12 kan være lovende anticancer strategi i kolon-afledte tumorer uanset deres p53 status, og også gunstige i de defekte i PTEN funktion

Henvisning:. Lauková J, Kozubík A, Hofmanová J, Nekvindová J, Sova P, Moyer MP, et al. (2015) Tab af PTEN Letter Rosiglitazon-medieret Forbedring af Platinum (IV) Complex LA-12-induceret apoptose i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 10 (10): e0141020. doi: 10,1371 /journal.pone.0141020

Redaktør: Yoshiaki Tsuji, North Carolina State University, USA

Modtaget: Maj 4, 2015; Accepteret: 2 oktober 2015; Udgivet: 22 okt 2015

Copyright: © 2015 Lauková et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den tjekkiske Science Foundation (15-06650S) (https://www.gacr.cz, AHV) og IGA i ministeriet Sundhedsstyrelsen den Tjekkiske Republik (NT 11.201-5 /2010) (https://iga.mzcr.cz, AK). Platin Pharmaceuticals, a.s. (Dr. Petr Sova) og Incell Corporation LLC (Dr. Mary Pat Moyer) ydet støtte i form af forskningsmateriale, og deres særlige rolle er også angivet i afsnittet Forfatter Bidrag af online indsendelse formularen.

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser. Petr Sova er en medarbejder i virksomheden, der ejer immaterielle rettigheder vedrørende LA-12 og medforfatter af patenter inden for LA-12. Mary Pat Moyer er en medarbejder i virksomheden, der ejer intellektuelle ejendomsrettigheder vedrørende NCM460 cellelinje. Disse kommercielle tilhørsforhold ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

peroxisomproliferatoraktiveret receptor γ (PPARy) er medlem af den nukleare hormon receptor superfamilien af ​​ligand-aktiverede transkriptionsfaktorer som er involveret i regulering af energistofskiftet, cancerudvikling og anti-inflammatorisk respons [1]. Selv om en hovedrolle PPARy er blevet vist i adipocytdifferentiering og insulinsensibilisering [2], PPARy er også velkendt at påvirke vækst og cellecyklus [3, 4], differentiering [5] og apoptose [6] af forskellige typer af cancerceller, herunder kolon. Tilsvarende som i adipocytter, er PPARy udtryk også fastholdt på relativt høje niveauer i mange humane coloncancer-cellelinjer og primære kolon tumorer [7]. De mutationer af PPARy genet er blevet rapporteret som sjælden begivenhed i humane maligniteter, herunder kolon [8]. Det er blevet foreslået, at PPARy-induceret genregulering kan bidrage til tumorigenese, men betydningen af ​​denne receptor pathway i coloncancer udvikling og behandling stadig kontroversiel.

Rosiglitazon, en syntetisk ligand af PPARy er et meget anvendt anti -diabetic middel fra familien af ​​lægemidler kaldet thiazolidindioner. På grund af sin evne til at inhibere proliferation og /eller inducere celledød, er rosiglitazon også blevet undersøgt i talrige undersøgelser fokuserede på kræftbehandling. Selv om en utilstrækkelig antitumoreffektivitet af rosiglitazon er blevet vist i mange tilfælde, når de anvendes i monoterapi, har sin lovende potentiale som adjuvans kombineret med stråling [9] eller forskellige typer af antineoplastiske midler er rapporteret. Rosiglitazon forbedret coloncancercelle følsomhed over for de cytotoksiske virkninger af 5-FU [10], cytokin TRAIL [11] eller all-trans-retinsyre [12]. Interessant nok har additive /synergicanticancer effekter af rosiglitazon og konventionelt anvendt platin-baserede lægemidler cisplatin eller carboplatin blevet demonstreret i colon, lunge eller æggestokkene cancer cellelinjer

in vitro

[13, 14]. Kombination af carboplatin og rosiglitazon reducerede forekomsten af ​​polypdannelse i mus model af azoxymethan-induceret colon carcinogenese [13], tumorstørrelsen i nøgne mus med subkutant injiceret A549 lungekræft celleafledte xenotransplantater [13] eller inducerede en regression af K- Ras-drevet murine lunge adenokarcinomer [14]. Forbehandling med rosiglitazon også synergieffekt anticancer aktivitet af cisplatin i DMBA-inducerede mammatumorer i rotter [15]. Selv om nogle molekylære mekanismer bag disse virkninger er blevet foreslået, mange af dem stadig at blive afklaret. Desuden er en fuldstændig mangel på oplysninger foreligger om de potentielle kooperative anticancer effekter af rosiglitazon med nye platin-baserede kemoterapeutiske lægemidler.

LA-12, (OC-6-43) -bis (acetato) (1- adamantylamin) amminedichloroplatinum (IV), betegner en nylig indført platin (IV) -kompleks indeholdende en voluminøs hydrofob ligand 1-adamantylamin, så dens højere hydrofobicitet sammenlignet med andre platin-baserede lægemidler såsom cisplatin [16]. Virkningen af ​​LA-12 er blevet intensivt undersøgt af os og andre både

in vitro

in vivo

, og resultaterne fremhævede sin gunstige anticancer potentiale over flere traditionelt anvendte platin-baserede kemoterapeutiske lægemidler [17]. LA-12 udøvede en stærk cytotoksisk virkning i forskellige cisplatin-resistente kræftceller af forskellig oprindelse, herunder kolon [18-20]. Desuden kunne LA-12 overvinde sammenløb-afhængig modstand coloncancerceller, der blev beskrevet i platin (II) forbindelser cisplatin og oxaliplatin [21]. Vi yderligere vist, at en højere effektivitet af LA-12 i colon cancerceller var forbundet med dens evne til at overvinde blokeret M-fase-entry udløst af oxaliplatin for at reparere den cellulære skader [22]. For nylig har vi rapporteret på et højere /unik evne LA-12 sammenlignet med cisplatin at fremkalde opregulering af flere vigtige proteiner involveret i apoptose regulering som Noxa, Bim, c-myc eller DR5 [23, 24]. Endvidere har den cellulære optagelse af LA-12 blevet vist hurtigere og mere effektiv sammenlignet med cisplatin i human ikke-småcellet lungekræft [25]. Lovende anticancer egenskaber af LA-12 blev også demonstreret

in vivo

i nøgne mus, der bærer humane carcinoma-xenotransplantater af colon, prostata og oprindelse æggestokkene, hvor LA-12 var mere effektivt i tumor elimination sammenlignet med satraplatin [26]. Men hverken de detaljerede molekylære mekanismer involveret i den cytotoksiske og cytostatiske virkning af LA-12 i kolon kræftceller stadig fuldt forstået, er heller ikke dets potentielle anvendelser i kombinationsbehandling.

I nærværende undersøgelse, vi var de første at demonstrere evnen af ​​rosiglitazon til at stimulere antiproliferativ og apoptotisk reaktion udløst af LA-12 i HCT116 menneskelige kolon adenocarcinomceller. Vi undersøgte de molekylære mekanismer ansvarlige for den kooperative virkning af narkotika, med særlig fokus på graduering af cellecyklus progression, PTEN involvering og aktivering af mitokondrie apoptotiske vej. Den cytotoksiske respons fremkaldt ved kombinationen af ​​rosiglitazon og LA-12 blev også undersøgt i andre coloncancer cellelinier og cellerne afledt fra normal colon epitel.

Materialer og metoder Salg

Celledyrkning og behandlinger

Menneskelig colon adenocarcinom cellelinjer HCT116 vægt (p53

+ /+, Bax

+/-, Chk2

+ /+, PTEN

+ /+), p53

– /-, Bax

– /-, Chk2

– /- og PTEN

– /- (fås fra Prof. Bert Vogelstein, John Hopkins University, Baltimore, MD, USA, og T. Waldman , Georgetown University School of Medicine, Washington, USA, i 2007) [27] [28] blev opretholdt i McCoy’s 5A medium (Gibco, Invitrogen, Life Technologies, USA), suppleret med penicillin (100 U /ml), streptomycin (0,1 mg /ml) og 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Østrig og Gibco, Invitrogen). Humane colon-adenocarcinomceller DLD-1 (ATCC, CCL-221, opnået i 2009) og RKO (ATCC, CRL-2577, fremstillet i 2007) blev opretholdt i RPMI eller DMEM (begge Gibco, Invitrogen, Life Technologies), henholdsvis suppleret med penicillin (100 U /ml), streptomycin (0,1 mg /ml) og 10% FBS. Den NCM460 voksent menneske normal colon epitel-afledt cellelinje blev modtaget (i 2010) af en Material Transfer aftale med Incell Corporation (San Antonio, Texas, USA) [29], og rutinemæssigt formeret under standardbetingelser i M3: 10TM medium (Incell Virksomhed). Cellerne blev dyrket i TPP (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz) dyrkning retter, kolber eller plader i en fugtig inkubator ved 37 ° C i atmosfære af 5% CO

2, passeret to gange om ugen efter udsættelse for EDTA /PBS og trypsin løsninger. Antallet af celler blev bestemt ved hjælp af en CASY Model TT-Cell Counter og Analyzer (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland).

Fireogtyve timer efter såning blev cellerne forbehandlet (24 timer) med 50 pM rosiglitazon (RGZ ) (5 – [[4- [2- (methyl-2-pyridinylamino) ethoxy] phenyl] methyl] -2,4-thiazolidindion, Cayman Chemical, Michigan, USA) og derefter behandles (48 h) med 0,75 uM LA- 12 ([(OC-6-43) bis (acetato) (1-adamantylamin) aminedichloroplatinum (IV)], Platinum Pharmaceuticals, som, Brno, Tjekkiet). MEK1 /2 Inhibitor U0126 (# 9903, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) og pan-caspaseinhibitor z-VAD-fmk (# 550.377, BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA, USA) blev tilsat til cellerne 1 h før behandling med RGZ. Stamopløsninger blev fortyndet i dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich, Prag, Tjekkiet).

Cell Transfektion og RNA Interference

RNA transfektioner blev udført ved hjælp af X-tremeGENE siRNA Transfektion Reagent (Roche, Basel, Schweiz) eller Lipofectamine ™ 2000 Transfektion Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anbefalinger. Celler blev podet i McCoys medium med 10% FBS, uden antibiotika og inkuberet natten over. Kort før transfektion medium blev ændret til Opti-MEM® Jeg Reduceret Serum Medium (Gibco, Invitrogen). Cellerne blev transficeret med 100 nM siRNA dobbelthuse rettet mod PPARy (# 29455, Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA, USA) eller ikke-target kontrol siRNA (# 37007, Santa Cruz Biotechnology). Efter 4 timer blev mediet skiftet til McCoys medium med 10% FBS (PAA Laboratories GmbH og Gibco, Invitrogen) med antibiotika. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne forbehandlet (24 timer) med RGZ og efterfølgende behandlet (48 h) med LA-12.

Immunoblotting analyse

Cellerne blev lyseret i 1% SDS-lysepuffer indeholdende protease inhibitor cocktail (# P2714, Sigma-Aldrich) eller protease inhibitor cocktail Set i (# 5.391.313, Calbiochem, Merck Millipore, Bedford, MA, USA), for phosphoprotein detektion Navo

4 og NaF blev tilsat til lyseringsopløsningen. DC ™ Protein Assay (# 500-0113, Bio-Rad Laboratories, Prag, Tjekkiet) blev anvendt til protein kvantificering. Proteiner blev derefter separeret på 15% SDS-polyacrylamidgel, og blottet på en PVDF-membran (Merck Millipore, Bedford, MA, USA). Membranerne blev blokeret i 5% fedtfri mælk eller BSA i 1 time ved stuetemperatur, vasket med TBS (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI og 0,1% Tween), og inkuberet natten over i primære antistoffer fortyndet i 5% ikke- fedt mælk ved 4 ° C. Immunodetektion blev udført under anvendelse af følgende primære antistoffer: monoklonalt muse-anti-p53 (1: 000, DO-1, # 126) rejst mod aminosyrerne 11-25 af p53 af human oprindelse, polyklonalt kanin-anti-Akt (1: 500, # 8312) mod aminosyrerne 345-480 af Akt1- af human oprindelse, monoklonalt muse-anti-cyclin B1 (1: 1000, # 245) mod en rekombinant protein svarende til human cyclin B1, monoklonalt muse-anti-cyclin D1 (1: 1000, # 20044) mod rekombinant fuld længde humant protein, monoklonalt muse-anti-PTEN (1: 500, # 7974) mod aminosyrerne 388-400 af PTEN af human oprindelse, polyklonalt kanin-anti-p21 (1: 000, # 397) dannet mod et peptid mapping ved C-terminalen af ​​p21 af human oprindelse, polyklonalt kanin-anti-p27 (1: 1000, # 528) rettet mod et peptid mapping ved C-terminalen af ​​p27 af human oprindelse (alle fra Santa Cruz Biotechnology), polyklonale kanin anti-phospho-Akt (Ser473) (1: 500, # 9271) fremstillet ved immunisering af dyr med et syntetisk phosphopeptid svarende til resterne omgivende Ser473 af muse Akt-oprenset ved protein a, polyklonalt kanin-anti-Bak (1: 1000, # 3792) fremstillet ved immunisering af kaniner med et syntetisk peptid (KLH-koblet) svarende til de aminoterminale rester af humant Bak-oprenset ved protein a, polyklonalt kanin-anti-Bax (1: 1000, # 2772) fremstillet ved immunisering dyr med et syntetisk peptid (KLH-koblet) svarende til de aminoterminale rester af humant Bax-oprenset ved protein a, polyklonalt kanin-anti-Bid (1: 1000, # 2002) fremstillet ved immunisering af dyr med et syntetisk peptid (KLH- koblet) svarende til resterne omgiver spaltningsstedet af humant Bid-oprenset ved protein a, monoklonalt kanin-anti-Bim (1: 1000, # 2933) fremstillet ved immunisering af dyr med et syntetisk peptid svarende til resterne omgivende Pro25 af Bim, monoklonalt muse-anti -Chk2 (1: 000, # 3440) fremstillet ved immunisering af dyr med trunkeret rekombinant GST-Chk2, polyklonalt kanin-anti-spaltet caspase-3 (1: 500, # 9661) fremstillet ved immunisering af dyr med et syntetisk peptid svarende til aminoterminale rester støder op til (Asp175) i human caspase-3, polyklonalt kanin-anti-spaltet caspase-9 (1: 500, # 9505) fremstillet ved immunisering af dyr med et syntetisk peptid svarende til aminoterminus rester omgivende til Asp330 af human caspase-9 – oprenset ved protein a, polyklonalt kanin-anti-ERK (1: 1000, # 9102) fremstillet ved immunisering af dyr med et syntetisk peptid (KLH-koblet) afledt af en sekvens i den C-terminale ende af rotte-p44 MAP-kinase-oprenset ved protein a , polyklonale kanin-anti-phospho-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) (1: 1000, # 9101) fremstillet ved immunisering af dyr med et syntetisk phosphopeptid svarende til resterne omgivende Thr202 /Tyr204 af human p44 MAP-kinase-oprenset ved protein a , polyklonale kanin-anti-spaltet PARP (Asp214) (1: 1000, # 9541) fremstillet ved immunisering af dyr med et syntetisk peptid svarende til carboxy-terminus rester omgivende Asp214 i human PARP-oprenset ved protein a, polyklonalt kanin-anti-peroxisom proliferator- aktiveret receptor γ (PPARy) (1: 500, # 2435) produceret ved immunisering af kaniner med et syntetisk peptid svarende til resterne omgivende Asp69 af human PPARy, polyklonalt kanin-anti-Puma (1: 1000, # 4976) fremstillet ved immunisering af dyr med et syntetisk peptid svarende til den carboxyterminale region af humant Puma-oprenset ved protein a, monoklonalt kanin-anti-survivin (1: 1000, # 2808) fremstillet ved immunisering af dyr med et syntetisk peptid svarende til resterne omgivende cystein 60 af humant survivin ( alle fra Cell Signaling Technology), monoklonalt muse-anti-Noxa (OP180; Calbiochem-MERC, Prag, Tjekkiet) med immunogen af ​​GST-fusion med human rekombinant Noxa, muse-anti-cytochrom c (1: 500, # 556.433, BD Pharmingen ™, San Jose, USA) med syntetiske peptider af due cytochrom c som immunogen, monoklonalt muse-anti-kompleks IV subunit II (anti-cyt oxidase subunit II) (# A-6404, Invitrogen ™, Life Technologies) med human kompleks IV subunit II som immunogen. Membranerne blev derefter vasket og inkuberet med sekundære antistoffer-anti-muse-IgG (1: 3000, # NA931) og anti-kanin IgG antistof (1: 3000, # NA934) (begge fra Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) i 1 time ved stuetemperatur. Påvisning af antistof-komplekser blev udført med peberrod peroxidasesubstrater Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (# WBKLS0500, Merck Millipore, Bedford, MA, USA). Anti-β-actin-antistof (1: 5000, A5441; Sigma-Aldrich), med let modificeret β-cytoplasmatisk actin N-terminale peptid Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile- Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys, konjugeret til KLH som immunogen, blev anvendt til belastningskontrol.

Fremstilling af cellefraktioner

cellerne blev høstet ved trypsinisering, centrifugeret ved 200 g i 5 minutter, resuspenderet i fraktion puffer (150 mM KCI, 1 mM MgCI2, 0,2 mM EGTA, 5 mM Tris og 0,01% digitonin pH 7,2-7,4) og venstre i stuetemperatur i 20 minutter for at lysere. Lyserede celler blev centrifugeret ved 13 000 rpm blev supernatanter anvendt til cytoplasmatiske fraktioner og pellets blev resuspenderet i den samme mængde fraktion buffer blandet med 4x Laemmlli buffer, kogt i 10 minutter og prøverne efter protein kvantificering blev anvendt i immunblotting analyse.

Analyse af mitochondriemembranpotential (MMP)

Påvisning af MMP blev udført under anvendelse af 0,2 uM tetramethylrhodamin ethylester perchlorat (TMRE Molecular Probes®, Eugene, OR, USA) som tidligere beskrevet [30] og analyseret ved anvendelse af flowcytometri (FACS Calibur

TM, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Dataene blev evalueret af CellQuest software (Becton Dickinson), og resultaterne blev udtrykt som procentdele af cellerne med nedsat MMP.

Annexin V /propidiumiodid apoptose assay

For eksternalisering af phosphatidylserin som en markør af apoptose blev cellerne høstet, vasket med PBS og farvet med annexin V FITC-konjugeret antistof (# ANXV-FT100, Apronex, Prag, Tjekkiet) i 20 min i RT med fremstiller »specifik medfølgende buffer. Lige før analyse, 5 ug /ml propidiumiodid (PI) (# P-4170, Sigma-Aldrich) blev tilsat. Fluorescens blev derefter målt under anvendelse af flowcytometer (FACS Calibur

TM, Becton Dickinson). Brug af Cell Quest-software blev resultaterne udtrykt som procentdelen af ​​cellerne positive for annexin V og negative for propidiumiodid (apoptotiske).

Cellecyklusanalyse

Cellerne blev behandlet som beskrevet tidligere [22] og analyseret med flowcytometri (FACSVerse

TM; Becton Dickinson); mindst 20 000 hændelser blev indsamlet pr prøve. Data blev analyseret ved anvendelse ModFit LT version 3.1 software (Verity Software House, Topsham, ME, USA). Debris og dublet celler blev udelukket, og kun enkelte celler blev taget for cellecyklus analyse. Resultaterne blev udtrykt som procentdelen af ​​cellerne i G1, S og G2 /M-fasen.

caspase-3

Aktiv detektion

Cellerne blev høstet, vasket i PBS, fikseret og farvet ved hjælp af FITC aktiv caspase-3 apoptose kit (# 550.480, BD Pharmingen ™) ifølge den producentgaranti protokol. Procentdelen af ​​celler med aktiv caspase-3 blev påvist ved flowcytometri (FACS Verse

TM, Becton Dickinson) og analyseret ved BD FACSuite softwareversion 1.0.5 (Becton Dickinson).

samtidig påvisning af aktiv caspase-3 og den cellecyklusprogression

cellerne blev høstet, vasket i PBS, fikseret og farvet under anvendelse af FITC aktiv caspase-3 apoptose kit (# 550.480, BD Pharmingen ™) ifølge den producentgaranti protokol. Efterfølgende blev cellerne vasket og farvet med propidiumiodid for cellecyklus-analyse som beskrevet ovenfor. Procentdelen af ​​cellerne i G1, S og G2 /M-fasen med aktiv caspase-3 blev påvist ved flowcytometri (FACS Verse

TM, Becton Dickinson) og analyseret ved BD FACSuite softwareversion 1.0.5 (Becton Dickinson).

RNA isolering og real-time RT-PCR

RNA isolation.

Umiddelbart efter indsamling, 1×10

6 celler resuspenderes i 200 pi PBS, homogeniseret i 400 pi kit Lysis /Binding Buffer og frosset ved -80 ° C indtil tidspunktet for RNA-isolering. Total RNA isolation blev udført ved anvendelse High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Schweiz) ifølge producentens instruktioner. RNA mængde og renhed blev vurderet ved UV-spektroskopi og en alikvot af RNA blev omvendt transkriberet til cDNA.

cDNA-syntese.

cDNA blev syntetiseret fra 1 pg totalt RNA ved Transcriptor First Strand cDNA syntesekit (Roche, Schweiz) ifølge producentens instruktioner ved anvendelse billede oligo-dT-primere (1 pi) og tilfældige hexamere primere (2 pi) i et totalt volumen på 20 pi.

Real-Time kvantitativ PCR.

0,5 ul af hver cDNA blev analyseret ved kvantitativ PCR under anvendelse TaqMan Gene Expression Master Mix og TaqMan-genekspression-assays (Life Technologies, USA) CCND1, cyclin D1 (Hs00765553_m1), BIRC5, survivin (Hs04194392_s1), CDKN1A, p21 (Hs00355782_m1), CDKN1B, p27 (Hs01597588_m1), CCNB1, cyclin B1 (Hs01030099_m1), HPRT1 (Hs99999909_m1) ifølge producentens instruktioner i et totalt reaktionsvolumen på 10 ul. Alle PCR-reaktioner blev udført i tre tekniske gentagelser på RotorGene 6000 instrument (Corbett Life Science, Australien). PCR termisk profil var som følger: 50 ° C i 2 min (UDG inkubation), 95 ° C i 10 min (enzymaktivering), efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. NTC og RT kontroller blev inkluderet i hver kørsel. Dataanalyse blev udført under anvendelse af ddCt metoden med HPRT1 anvendt som husholdning genet.

Statistisk dataanalyse

Data er udtrykt som gennemsnit +/- S.E.M. af tre uafhængige forsøg, og statistisk analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af Fishers mindste signifikante forskel (LSD) test med statistisk signifikans p 0,05, under anvendelse af Statistica til Windows software, V 10 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA) .

for nærmere at undersøge interaktivt (synergi eller additivitet) cytotoksiske virkninger mellem stoffer, resultaterne af apoptose analyse (annexin V /propidiumiodid assay, flowcytometri, procentdel af annexin V positiv, propidium iodid negative HCT116-celler) efter behandling med flere forskellige doser af rosiglitazon (op til 75 uM) og LA-12 (op til 1,5 uM) eller deres kombinationer blev undersøgt. Konstruktion af regression kurver og beregning af de ækvieffektive mængder agenter i blandingen blev gjort ved hjælp isobolografiske analyse i GraphPad Prism 6 software. De lægemiddeldoser er tilstrækkelige til synergistisk virkning blev beregnet, og typen af ​​reaktion blev bestemt.

Resultater Salg

RGZ forbedret HCT116 human colon cancer cell følsomhed til LA-12-induceret caspase-afhængig apoptose

Forbehandling af HCT116 vægt- human adenocarcinom-cellelinie med rosiglitazon effektivt stimulerede LA-12-induceret apoptose, hvilket fremgår af signifikant stigning i procentdelen af ​​cellerne med specifik phosphatidylserin eksternalisering (figur 1A; S1 fig), og spaltning af caspase-3 og dets substrat PARP (fig 1B). En isobolografiske analyse af den apoptotiske respons af HCT116 celler til flere forskellige doser af rosiglitazon og LA-12 anvendes i kombination (se Materialer og fremgangsmåder) viste klart en signifikant synergistisk virkning (data ikke vist). Ved hjælp af en pan-caspaseinhibitor z-VAD-fmk, bekræftede vi, at de apoptotiske virkninger af lægemiddelkombinationen fuldt afhang caspaseaktivering (Fig 1A og 1B). Den betydelige stimulering af de apoptotiske virkninger (phosphatidylserin eksternalisering) induceret af LA-12 og rosiglitazon kombination sammenlignet med de individuelle lægemidler blev også vist i human colon adenocarconima DLD-1 og RKO cellelinjer (Fig 1C).

(a) Procentdel af apoptotiske (annexin V positiv /propidiumiodid negativ, flowcytometri) HCT116 wt celler og (b) spaltning af caspase-3 og PARP (Western blotting) efter forbehandling (24 timer) med rosiglitazon (RGZ, 50 uM) og efterfølgende behandling (48 timer) med LA-12 (0,75 uM) i fravær (DMSO) eller nærvær af z-VAD-fmk (10 uM). (C) Procentdel af apoptotiske (annexin V positiv /propidiumiodid negativ, flowcytometri) RKO eller DLD1 celler efter forbehandling (24 timer) med rosiglitazon (RGZ, 50 uM) og efterfølgende behandling (48 h) med LA-12 (0,75 uM ). Resultater er middeltal + ± S.E.M. eller repræsentanter for tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikans: P 0,05, * versus kontrol, ‡ versus RGZ, Ο versus LA-12, og Δ for med /uden z-VAD-fmk.

Mitokondrier spiller en uundværlig rolle i forbedring af HCT116 celle apoptose efter deres kombineret behandling med rosiglitazon og LA-12

apoptotiske respons HCT116 wt celler behandlet med kombinationen af ​​rosiglitazon og LA-12 var forbundet med stimulering af den mitokondriske pathway, som indikeret ved den forøgede frigivelse af cytochrom c til cytoplasmaet (fig 2A), kløvning af caspase-9 (fig 2B) og dråbe MMP (fig 2C). En funktionel rolle mitokondrier blev yderligere bekræftet under anvendelse HCT116 Bax – /- celler, hvor de apoptotiske virkninger af lægemiddelkombinationen blev undertrykt signifikant. Dette blev påvist ved en blokering af caspase-9 og PARP-spaltning (Fig 2B), og slip af MMP (fig 2C) i HCT116 Bax – /- celler behandlet med kombinationen af ​​rosiglitazon og LA-12 sammenlignet med deres vildtype modstykker. blev observeret efter den HCT116 vægt- celle behandling med kombinationen lægemiddel, et forøget niveau af pro-apoptotiske BH3-only proteiner Noxa og Bim (23 og 15 kDa, hvilket svarer til EL og L-formen, henholdsvis), mens niveauet af Puma og Byd forblev stort set upåvirket. En lille stigning i Bax og Bak proteinniveauet var også tydelig i LA-12-behandlede HCT116 wt-celler (Fig 2D).

(a) Frigivelsen af ​​cytochrom c til cytoplasmaet (cytoplasmatisk fraktion) af HCT116 celler forbehandlet (24 timer) med rosiglitazon (RGZ, 50 uM) og efterfølgende behandlet (48 h) med LA-12 (0,75 uM), påvises ved Western blotting efter celle fraktionering. (B) Spaltning af caspase-9, PARP, Bax proteinniveau (Western blotting), og (c) ændringer i mitokondrisk membranpotentiale (MMP, flowcytometri) i HCT116 vægt- og Bax – /- celler behandlet som i A). (D) Omfanget af Noxa, Bim, Puma, Bid, Bax og Bak protein (Western blotting) i HCT116 wt celler behandlet som i a). Resultater er middeltal + ± S.E.M. eller repræsentanter for tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikans: P 0,05, * versus kontrol, ‡ versus RGZ eller Ο versus LA-12, og Δ for vægt versus Bax – /-. Celler

Den rosiglitazone- og LA-12-induceret apoptose sker fortrinsvis i G1 fase af HCT116 cellecyklus

En samtidig flowcytometrianalyse af cellen apoptose (caspase-3-spaltning) og cellecyklus viste, at celler behandlet med lægemiddelkombinationen fortrinsvis dør af G1 (og til lav grad også S ) fase (fig 3A og 3B). Under betingelserne i Bax-mangel, signifikant lavere procentdel af cellerne behandlet med kombinationen lægemiddel undergik apoptose i forhold til deres Bax udtrykkende modparter, og disse apoptotiske celler blev i G1 cellecyklussen fase (Fig 3A).

( a) caspase-3-aktivering (% af alle celler med aktiv caspase-3) i forbindelse med cellecyklus progression (flowcytometri) i HCT116 vægt og Bax – /- celler efter deres forbehandling (24 timer) med rosiglitazon (RGZ, 50 uM ), og efterfølgende behandling (48 timer) med LA-12 (0,75 uM) (b) Procentdel af apoptotiske celler (med aktiv caspase-3) i G1 cellecyklusfase, kvantificering af data fra en). Resultater er middeltal + ± S.E.M. eller repræsentanter for tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikans: P 0,05, * versus kontrol, ‡ versus RGZ, Ο versus LA-12, og Δ for wt versus Bax – /-. Celler

Som p53 og Chk2 kan fungere som vigtige cellecyklus (herunder G1 eller M-fase post) og apoptose regulatorer, vi undersøgte deres mulige involvering i modulering af rosiglitazon-medieret forstærkning af HCT116 celle følsomhed over for LA-12-induceret apoptose. Vores resultater viste, at både p53 og Chk2 kan undværes for apoptose udløst af lægemiddelkombinationen, som blev observeret lignende respons (caspase-3, caspase-9, PARP-spaltning) i forældre- og passende knock out (p53 – /-, Chk2- /-) cellelinjer (fig 4)

Spaltning af caspase-9, caspase-3, PARP og niveauet af Chk2 og p53 proteiner i HCT116 wt, Chk2 -. /- og p53 – /- celler forbehandlet (24 h) med rosiglitazon (RGZ, 50 uM), og derefter behandles (48 timer) med LA-12 (0,75 uM), detekteret ved Western blotting. Resultaterne er repræsentanter for tre uafhængige forsøg.

PTEN mangel understøttet G1 fasen-relaterede forstærkning af mitokondrier-afhængig apoptose induceret af rosiglitazon og LA-12 i HCT116 celler

Kombineret behandling af HCT116 wt celler med rosiglitazon og LA-12 inducerede et fald i PTEN niveau (fig 5A), som blev ledsaget af en øget aktivering af Akt (phosphorylering ved Ser473), uden ændringer i det totale protein kinase niveau (S2 fig). For at undersøge den funktionelle rolle af PTEN, blev den cytotoksiske reaktion på lægemiddelkombinationen sammenlignet i HCT116 celler, der udtrykker eller mangler proteinet. HCT116 PTEN – /- celler var mere følsomme over for de apoptotiske virkninger af LA-12 alene og endnu mere af sin kombination med rosiglitazon, som det fremgår af en forbedret PARP og caspase-9-spaltning (Fig 5A), og en øget dråbe mitokondriemembranen potentiale (fig 5B) sammenlignet med deres HCT116 wt modstykker. En præferentiel drab fra G1 cellecyklusfase induceret af lægemiddelkombinationen i HCT116 wt celler blev yderligere endnu mere understøttet i fravær af PTEN, hvor procentdelen af ​​apoptotiske celler (med caspase-3-aktivering) steg betydeligt (figur 5C). Stimuleringen af ​​lægemiddelkombination-induceret G1-fase-relateret apoptose var også tydelig i senere tidspunkter af behandlingerne (data ikke vist).

(a) Spaltning af PARP, caspase-9 og PTEN niveau (Western blotting), (b) ændringer i mitochondriemembranpotential (MMP, flowcytometri), og (c) procentdelen af ​​apoptotiske celler (med aktiv caspase-3) i G1 cellecyklusfase i HCT116 wt eller PTEN – /- celler forbehandlet (24 h) med rosiglitazon (RGZ, 50 uM), og efterfølgende behandlet (48 h) med LA-12 (0,75 uM). (D, e) Procentdel af HCT116 wt og PTEN – /- celler i de enkelte cellecyklus faser (flowcytometri) efter de behandlinger, der er specificeret i a-c). Resultater er middeltal + ± S.E.M. eller repræsentanter for tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikans: P 0,05, * versus kontrol, ‡ versus RGZ, Ο versus LA-12, og Δ for wt versus PTEN – /-. Celler

Mens rosiglitazon alene ikke påvirke fordelingen cellecyklus i forhold til kontrol, vi observeret et signifikant fald i procentdelen af ​​HCT116 wt celler i G1 fasen, og samtidig stigning i G2 /M fase efter deres eksponering for LA-12 eller dens kombination med rosiglitazon (fig 5D).