PLoS ONE: udgår i leverkræft 2 (DLC2) Var undværlige for udvikling og dens mangel Vidste ikke forværre hepatocarcinogenese

Abstrakt

DLC2 (slettet i leverkræft 2), en Rho GTPase-aktiverende protein, er tidligere vist sig at være underexpressed i human hepatocellulært carcinom og har tumor suppressor funktioner i cellekultur modeller. Vi genererede DLC2-deficiente mus til at undersøge tumor suppressor rolle DLC2 i hepatocarcinogenese og funktionen af ​​DLC2 in vivo. I denne undersøgelse fandt vi, at i modsætning homolog DLC1, hvilket er afgørende for fosterudviklingen, DLC2 var undværlig for fosterudviklingen, DLC2-mangel mus kunne overleve til voksenalderen. Vi også observere en højere forekomst af lever tumordannelse eller diethylnitrosamin (DEN) -induceret hepatocarcinogenese i DLC2-mangel mus. observerede imidlertid, at DLC2-deficiente mus var mindre og havde mindre fedtvæv end vildtypemus. Disse fænotyper var ikke på grund af reduktion af cellestørrelse eller defekt i adipogenese, som observeret i 190B RhoGAP-mangel musemodel. Sammen disse resultater tyder på, at mangel på DLC2 alene ikke øge hepatocarcinogenese

Henvisning:. Yau TO, Leung THY, Lam S, Cheung AF, Tung EKK, Khong PL, et al. (2009) Udeladt i leverkræft 2 (DLC2) Var undværlige for udvikling og dens mangel Vidste ikke forværre hepatocarcinogenese. PLoS ONE 4 (8): e6566. doi: 10,1371 /journal.pone.0006566

Redaktør: Alfred Lewin, University of Florida, USA

Modtaget: April 7, 2009; Accepteret: 10. juli 2009; Udgivet: 10 August, 2009

Copyright: © 2009 Yau et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev finansieret af Hongkong Research Grants Rådets Fund General Research (HKU 7436 /04M) og RGC Collaborative Research Fund (HKU 1 /06C). I.O.L. Ng er Loke Yew professor i patologi. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) er en primær malignitet og er en af ​​de mest almindelige kræftformer i Asien og Afrika. Infektion med hepatitis B eller C virus infektion og udsættelse for aflatoksin B1 er blevet godt dokumenteret som de hyppigste årsager. Men de underliggende molekylære mekanismer, der fører til udvikling og progression af HCC fortsat uklare.

Inaktivering af tumorsuppressorgener er kendetegnende for kræftceller. I en søgen efter tumorsuppressorer involveret i hepatocarcinogenese identificerede vi et nyt gen

DLC2

(slettet i leverkræft 2) på kromosomal region 13q12.3, som ofte tabt i HCCs [1]. Svarende til sin homolog DLC1 er DLC2 underexpressed i human HCCs og har tumor suppressor funktioner i dyrkede celler [1], [2].

DLC1 og DLC2 er Rho GTPase-aktiverende proteiner (GAP’er). De har tre funktionelle domæner, en katalytisk RhoGAP domæne [1], [3], en steril alfa motiv (SAM) protein interaktion domæne [4], [5] og en lipid-bindende StAR-relateret lipid-overførsel (START) domæne [6], [7]. Rho familie GTPaser har 18 medlemmer, herunder de tre velundersøgte repræsentanter, Rac1, RhoA, og cdc42. Disse små GTPaser regulerer forskellige cellulære signalveje [8], [9]. Det er blevet foreslået, at Rho proteiner spiller vigtige roller i oncogen transformation medieret af Ras og andre oncoproteiner ved kontrol af actin cytoskeleton organisation, celleproliferation og celleoverlevelse [10], [11]. Også de stimulerer tumorcelleinvasion og metastase [9]. Rho GTPase-aktiverende proteiner (gaps) inaktivere dem ved at omdanne den aktive GTP-bundne tilstand til den inaktive GDP-bundet en gennem aktivering af den iboende GTPase aktivitet af Rho-proteiner. GAP’er er derfor blevet foreslået at være tumorsuppressorer som modvirker den onkogene potentiale Rho proteiner.

Der har været flere linjer af in vitro-beviser til støtte for tumor suppressor rolle, som disse to Rho GAP proteiner, DLC1 og DLC2 [ ,,,0],1], [2], [3], [5], [12], [13], [14], [15], [16]. Dyremodeller, som kan udnyttes til at undersøge tumor suppressor funktioner af disse to proteiner er stadig begrænset. Durkin et al. [17] har genereret en DLC1-deficient musemodel til at studere de biologiske funktioner af DLC1. Men DLC1 mangel fører til embryonale dødelighed ved midgestation. Sordella et al [18] viste, at embryoner mangler p190B RhoGAP var omkring 30% mindre i størrelse og leveres tyder på, at denne reduktion i embryo størrelse skyldes reduktion i celle størrelse. De viste også, at murine embryonale fibroblaster afledt fra disse embryoner var defekte i adipogenese sammenlignet med vildtype modstykke [19].

I denne undersøgelse har vi genereret DLC2-deficiente mus til at undersøge de biologiske funktioner af DLC2 og dets rolle i hepatocarcinogenese in vivo. I modsætning til den DLC1 knockout model, DLC2 var undværlig for fosterudviklingen, DLC2-mangel mus kunne overleve til voksenalderen. DLC2-deficiente mus viste ikke højere forekomst af hepatocarcinogenese eller diethylnitrosamin (DEN) -induceret hepatocarcinogenese. Imidlertid DLC2-deficiente mus var signifikant mindre og havde mindre fedtvæv end vildtypemus. Analyse af adipogenese af DLC2-deficiente og vildtype murine embryonale fibroblaster viste ikke signifikant forskel mellem dem. Også, vi ikke observere nogen signifikant forskel i cellestørrelse mellem G1 fasen DLC2-mangelfulde og vildtype udødeliggjort fibroblaster med flowcytometri.

Materialer og metoder

Generering af DLC2-mangel mus

En PAC-klon indeholder musen

Dlc-2

genomisk region blev opnået fra Sanger Centre (Cambridge, Storbritannien). For at konstruere musen

Dlc-2

genmålretningsvektor, en 2,8 kb

Eco

RI /

Bam

-fragmentet, der er 3 ’til exon 5, blev klonet i

Eco

RI /

Bam

HI site af pPNT (figur 1a). Et par primere (fremad, 5′-ttactcgagttgctgatgcacaggtcttc, bagside, 5′-ttactcgagttctcgtgttaggaatgggg) blev anvendt til at amplificere et genomisk region, 2,7 kb og 5 ‘for exon 5 (figur 1a). Fragmentet blev derefter klonet ind i pPNT [20]. Den målrettende vektor blev lineariseret med

Ikke

I og blev elektroporeret ind i AB2.2 embryonale stamceller (ES) cellelinie (129s7 /SvEBrd-HPRT b-m2), og cellerne blev dyrket i ES-celle dyrkningsmedium suppleret med G418 og fialuridine. Resistente kloner blev analyseret ved Southern blotting (se nedenfor) for at identificere

DLC2

-targeted kloner.

(a) Skematisk diagram til at vise gene targeting strategien. Sorte bokse, exoner af muse DLC2 genet (exon numre skrives øverst); grå bokse, DNA-sekvensen af ​​neomycinresistensgenet af targeting-konstruktet; hvid boks, DNA-sekvensen af ​​thymidinkinasegenet af targeting-konstruktet. Restriktionsenzymspaltning sites: B, BamHI; Bg, BgIII; E, EcoRI; N, Ncol; Kun diagnostiske restriktionssteder er vist for enkelthedens skyld. (B) Southern blot-analyse. BglII-fordøjelse blev probet med 5 ‘probe som angivet; størrelser af diagnostiske bånd: vildtypeallel, 4,7 kb; målrettet allel, 5,7 kb. Ncol fordøjelse blev probet med 3’probe som angivet; størrelser af diagnostiske bånd: vildtypeallel, 9,1 kb; målrettet allel, 5,7 kb. (C) PCR genotypebestemmelse; størrelser af bånd: vildtypeallel, 414 bp; målrettet allel, 339 bp. (D) RT-PCR til at opdage DLC2 udtryk i hjerte, lever og skeletmuskulatur.

Al forskning involverer dyr arbejde blev godkendt af udvalget om brug af levende dyr i undervisning og forskning (Culata) fra University of Hong Kong. Celler fra disse kloner blev injiceret i C57BL /6N blastocyster. Kimærer blev parret med C57BL /6N mus, og afkom indeholder

DLC2

-targeted allel blev identificeret. Mus med blandede genetiske baggrunde blev tilbage-krydset til C57BL /6N i mindst fem generationer.

Southern blot analyse, PCR genotype og RT-PCR

For Southern blot analyse, to sonder, 5 ‘og 3’ ydre, blev anvendt (figur 1a).

Bgl

II fordøjelse blev undersøgt med 5’sonde og størrelserne af diagnostiske bands var 4,7 kb for vildtype allelen og 5,7 kb for den målrettede allel.

Nc

OI fordøjelse blev undersøgt med 3’sonden, og størrelserne af diagnostiske bands var 9,1 kb for vildtype allelen og 5,7 kb for den målrettede allel.

To par primere var anvendt til PCR genotypebestemmelse. Til påvisning af vildtype allelen, fremad (5′-AATGGAAGCACCATGTAGCC) og revers primer 5′- AATGGAAGCACCATGTAGCC) blev anvendt, med den forventede størrelse af PCR-produktet 414 bp. Til påvisning af det målrettede allel, fremad (5′-CTGGGAAGACAGGGAACAAA) og revers primere (5′-GGGGGAACTTCCTGACTAGG) blev anvendt, med forventede størrelse af PCR-produktet væsen, 339 bp.

I semikvantitativ RT- PCR-analyse, blev samlet RNA fremstillet ud fra musevæv vha TRIzol-reagens (Invitrogen). Første-streng cDNA blev syntetiseret fra 1 pg totalt RNA ved anvendelse af vilkårlige hexamerer med GeneAmp RNA PCR-kittet (Applied Biosystems, Foster City, CA). To pi cDNA blev derefter anvendt til påvisning ekspressionsniveauerne af

DLC1, DLC2

og

DLC3

anvendelse af følgende primere: For mus

DLC1

gen, fremad primer (5 ‘- CCCATTCAGTCAGTCCACCTTGA) og vendes primer (5’GAGTCTCCCTCGTCGGAAAAC) blev anvendt; For mus

DLC2

gen, fremad primer (5′-GATGAGAAACACAGCCAGCA) og revers primer (5′-GTTGGGTATCTGGACGCACT) blev anvendt; For

DLC3

, fremadrettet primer (5′-TCCACAGGCAGCCATGCCAG) og omvendt primer (5′-TCTTGCTCAAGATCCTGGGCC) blev anvendt. PCR tilstand var som følger: denaturering ved 95 ° C i 15 min, efterfulgt af 25 cykler (

DLC1

DLC2

) eller 27 cykler (

DLC3

) af denaturering i 30 sekunder, annealing ved 55 ° C i 30 sek med forlængelse ved 72 ° C i 30 sekunder og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min. PCR-produkter blev løst i 1,2% agarose gel.

Metabolic bur eksperiment

Mus blev individuelt anbragt i metaboliske bure i en 12:12 timers mørke-lys cyklus og blev fodret

annonce libitum

. Vand og fødeindtagelse, og urin og fæces output blev målt i 2 dage.

diethylnitrosamin (DEN) behandling af mus

hepatocarcinogenese protokol var som følger. Den 15-dage gammel mand

DLC2

homozygote knockout-mus og vildtypemus blev injiceret intraperitonealt med 25 mg /kg DEN i sterilt PBS. 35 uger gamle, blev mus aflivet, og deres lever blev høstet og undersøgt. De lever blev derefter fikseret i 4% formaldehyd i PBS, indlejret i paraffin og skåret i 4-um sektioner for histologisk undersøgelse.

Udarbejdelse af murine embryonale fibroblaster (MEF) og etablering af cellelinier

Gravide mus blev aflivet på 13,5 dage tidligere coitus (DPC). De embryoner blev dissekeret fra livmoderen, og ekstra-embryonale membraner og indvolde blev fjernet. Embryonerne blev skåret i små stykker, og gennemvædet i 30 minutter i 4 ml 0,25% trypsin-EDTA ved stuetemperatur. Trypsinisering blev inaktiveret med α-modificeret Eagle-medium (aMEM) suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS, 50 U penicillin pr ml og 50 ug streptomycin pr ml. Cellerne blev suspenderet ved pipettering og ledes gennem en si. Standard procedurer blev anvendt til at etablere immortaliserede fibroblast cellelinjer [21]. Kort fortalt blev cellerne passeret hver 3 dage i DMEM suppleret med 10% kalveserum og antibiotika med en densitet på 10

6 celler pr 10 cm skål. Medier blev ændret på den efterfølgende dag. Stabile udødeliggjort cellelinjer blev etableret efter 30 til 50 passager.

Måling af cellestørrelser

De relative størrelser af

DLC2

+ /+

DLC2

– /- iBooked.dk celler blev bestemt med flowcytometri. Kort fortalt blev cellerne BrdU-mærket ved anvendelse FITC BrdU Flow Kit (BD Pharmingen ™, NJ, USA). G1 population af celler blev gated og fremadrettet lysspredning (FSC) på 5000 G1-celler blev bestemt. FSC blev anvendt til bestemmelse af de relative cellestørrelser.

Induktion af adipocytdifferentiering

Til induktion af adipocytdifferentiering, MEF celler blev anvendt, var inden for to passager. Induktion af adipocytdifferentiering blev udført som tidligere beskrevet [19]. Celler blev dyrket på plader med 6 brønde og opformeret til konfluens. To dage senere blev mediet erstattet med standard differentiering induktion medium (α-MEM indeholdende 0,5 mM isobutylmethylxanthin, 1 pM dexamethason, 5 ug insulin pr, 10% FBS, 50 U penicillin pr ml og 50 ug streptomycin pr ml, og mediet blev fornyet hver anden dag. cellerne blev induceret i 8 dage inden analyse.

cellerne blev fikseret i 10% formalin, skyllet to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) og farvet med olie-Red O-farvning opløsning (0,5% olie-rød O i isopropylalkohol opløsning-destilleret vand [60:40]) i 30 minutter ved 37 ° C og derefter vasket med destilleret vand tre gange. adipogenese i olie-rød-O- farves MEF blev kvantificeret ved måling af absorbansen af ​​lys ved 510 nm efter ekstraktion med isopropylalkohol.

Rhotekin bindingsassay

Celler blev lyseret i 500 pi lysepuffer indeholdende 50 mM Tris (pH 7,4 ), 10 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxycholat, 10 ug /ml aprotinin, 10 ug /ml leupeptin og 1 mM PMSF. Lysaterne blev klaret ved centrifugering ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C, og 500 ug af hvert lysat blev inkuberet med 45 ug GST-RBD (GST-fusionsprotein indeholdende RhoA-bindende domæne af Rhotekin) bundet til glutathion-Sepharose perler (Amersham Pharmacia) i 1 time. Efter binding blev prøverne vasket med lyseringspuffer tre gange. Bundne proteiner blev fraktioneret på 12% SDS /PAGE og immunblottet med polyklonale antistof til RhoA (Santa Cruz Biotechnology). Totalt cellelysat blev også analyseret med anti-RhoA antistof som en loading kontrol. blev bestemt Niveauet af aktiv RhoA efter normalisering med den samlede RhoA stede i cellelysaterne.

Immunfluorescensfarvning

Celler blev dyrket på dækglas og blev skyllet i PBS, fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur, permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 i PBS i 5 minutter og blokeret med 5% bovint serumalbumin i PBS. Efter vask med PBS blev cellerne derefter inkuberet med paxillin antistof (Sigma), efterfulgt af FITC-konjugeret sekundært antistof ved stuetemperatur. F-aktinerne blev farvet med tetramethylrhodamin B isothiocyanat-mærket phalloidin (Sigma) i 20 minutter ved stuetemperatur, og kernerne blev farvet ved DAPI. Celler blev monteret med Vectashield antifade løsning (Vector Laboratories).

Resultater

Generering af DLC2-mangel mus

For at undersøge funktionen af ​​DLC2

in vivo

og den rolle, DLC2 i hepatocarcinogenese, genereret vi DLC2-deficent mus. Forstyrrelser muse DLC2 genet blev opnået ved homolog rekombination i embryoniske stamceller (ES-celler). I rekombination, exon 5, den største exon i

DLC2

genet, blev erstattet af neomycinresistensgenet af targeting vektoren (figur 1a). To målrettede ES-kloner blev anvendt til at fastlægge de DLC2-deficiente mus (figur 1b og 1c).

DLC2

– /-.

Mus gav ikke udtryk for den

DLC2

mRNA som påvist ved RT-PCR på udvalgte væv, hjerte, lever og skeletmuskulatur (figur 1d)

DLC2-mangel mus var anatomisk normale men mindre og havde mindre fedt fedt

i modsætning til

DLC1

– /- iBooked.dk mus, der døde i fosterstadiet,

DLC2

– /- Restaurant mus kunne overleve til voksenalderen. Dette antyder, at DLC2 er undværlig for embryonisk udvikling. Anatomisk analyse viste, at

DLC2

– /- iBooked.dk mus var normale (ved 30 uger gamle), men

DLC2

– /- iBooked.dk mus var mindre i størrelse og lettere i vægt (p = 0,01) (figur 2a) og havde mindre fedtvæv end vildtypemus (p = 0,02) (figur 2b 2c). Vi ønskede at udelukke, at

DLC2

– /-

mus kan spise mindre mad end

DLC2

+ /+

mus og dette kan bidrage til deres mindre organ størrelse. Vi udførte derfor metaboliske bur eksperiment for at undersøge, om der var nogen forskelle i mad og vand forbrug. Men vi kunne ikke finde nogen signifikante forskelle i mad og vand indtag mellem

DLC2

– /- iBooked.dk mus og

DLC2

+ /+

mus (figur 3)

(a) Kropsvægt. (B) Vægt af epididymis fedtpuder. I (a) og (b), er vist middelværdier ± standardfejl og p-værdier. P-værdier blev beregnet ved uparret Students t-test. (C) Repræsentative prøver af epididymale fedtpuder.

(a) fødeindtagelse, (b) vandindtag, (c) afføring output og (d) urinproduktion i 24 timer. Middelværdier ± standardfejl og p-værdier er vist. P-værdier blev beregnet ved uparret Students t-test.

Udtømning af DLC2 påvirkede ikke cellestørrelse og adipogenese i MEF’er

p190B RhoGAP-mangelfulde museembryoer var mindre end den vilde typen embryoner og fibroblaster afledt fra p190B RhoGAP-deficiente embryoer var mindre end dem, der stammer fra vildtype embryoner [18]. Også, fibroblaster afledt fra p190B RhoGAP-deficiente embryoer var defekte i adipogenese [19]. Vi undersøgte derfor, om fibroblaster afledt af

DLC2

– /-.

Museembryoer var mindre i størrelse og mangelfuld i adipogenese

Som vist med flowcytometri, størrelsen af ​​de celler, der stammer fra

DLC2

– /- Restaurant museembryoer ikke var signifikant forskellig fra den

DLC2

+ /+

musefostre (figur 4a og 4b). Da Sordella et al. [18] viste AKT-vejen var nedstrøms mål for RhoA, og dette i sidste ende førte til nedsat cellestørrelse af fibroblaster afledt af p190B RhoGAP-mangelfulde embryoner, vi undersøgte AKT-vejen i celler afledt af

DLC2

– /- Salg og

DLC2

+ /+

musefostre. Vi har ikke afsløre nogen forskel mellem dem i denne vej (figur 4c). Vi har tidligere vist, at DLC2 var en RhoGAP; overekspression af DLC2 nedreguleres Rho aktivitet i hepatoma cellelinier og resulterede i inhibering af actin stress fiberdannelse [2]. Men opregulering af Rho aktivitet i

DLC2

– /- Restaurant celler blev ikke observeret (fig 4d), og der var nogle mindre, men ikke signifikant forskel i dannelsen af ​​actin stress fibre eller fokale adhæsioner mellem

DLC2

– /-

DLC2

+ /+

celler (Figur 4e). Disse tyder på, at der kan være andre funktionelt lignende proteiner, som kunne kompensere funktionen af ​​DLC2

(a) Sammenligning af størrelser af DLC2 + /+ (n = 6) og DLC2 -. /- (N = 6) celler ved flowcytometri. Frontal lysspredning (FSC) i G1-fase-celler som bestemt ved flowcytometri blev anvendt til måling af de relative cellestørrelser. Middelværdier ± standardfejl og p-værdier er vist. P-værdier blev beregnet ved uparret Students t-test. (B) Repræsentative prøver af flowcytometri resultater. (C) Western blot-analyse af insulin-behandlede DLC2 + /+ og DLC2 – /- celler. (D) RhoA aktivitet af DLC2 + /+ og DLC2 – /- celler som detekteret ved Rhotekin bindingsassay. (E) Actin cytoskeleton og fokale adhæsioner i DLC2 + /+ og DLC2 – /-. MEF celler blev detekteret ved immunfluorescensfarvning af actin stress fibre (rød) og paxillin (grøn), henholdsvis

Vi derefter undersøgt adipogenese i fibroblaster afledt af

DLC2

– /-

DLC2

+ /+

musefostre. Når

DLC2

– /-

DLC2

+ /+

celler blev fremkaldt af standard adipocytdifferentiering induktion medium, både

DLC2

– /

-. og

DLC2

+ /+

celler var kompetent til at differentiere til adipocyter og ikke signifikant forskellig i lipid produktionen kvantitativt (figur 5)

(a) Induktion af adipogenese blev udført på DLC2 – /- (n = 6) og DLC2 + /+ (n = 6) MEF’er. Efter induktion blev MEF’er farvet med Oil Red O-, og pletten blev derefter ekstraheret, og absorbans ved 510 nm blev målt. Middelværdier ± standardfejl og p-værdier er vist. P-værdier blev beregnet ved uparret Students t-test. (B) Repræsentative prøver af Oil-Red O-farvede MEF.

Udtømning af DLC2 ikke prædisponere til dannelsen af ​​levertumorer eller forværre DEN-induceret hepatocarcinogenese

Vi gjorde ikke observere nogen tumor dannelse i lever fra den voksne

DLC2

– /-

mus til en alder på 18 måneder. For at løse rolle DLC2 i kemisk induceret hepatocarcinogenese, vi behandlede den 15-dage gammel mand

DLC2

– /-

DLC2

+ /+

mus med DEN . Når musene nåede 35 uger gamle, blev de dissekeret og deres lever blev undersøgt for tumordannelse. Vi observerede, levertumorer udviklet i alle mus behandlet med DEN. Desuden er antallet af tumorer dannet, og de maksimale tumordiametre var ens i både

DLC2

– /-

DLC2

+ /+

mus (p = 0,79 og 0,51, henholdsvis) (figur 6). Disse resultater tyder på, at DLC2 mangel ikke forværre kemisk hepatocarcinogenese.

(a) Antal tumorer dannet i lever efter DEN behandling. (B) Størrelsen af ​​tumoren som repræsenteret ved maksimal diameter (i mm). I (a) og (b), er vist middelværdier ± standardfejl og p-værdier. P-værdier blev beregnet ved uparret Students t-test. (C) Repræsentative leverprøver behandlet med DEN. Hvide pile angiver tumorer. (D) Repræsentant H . E farvede sektioner af leverprøver behandlet med DEN

DLC1

DLC3

mRNA-ekspression i DLC2-udtømte væv

Semi-kvantitativ PCR blev udført på udvalgte væv, herunder lever, skeletmuskulatur og hjerter af

DLC2

– /-

DLC2

+ /+

mus ved 3 måneder til at observere nogen gen dosering kompensation fra andre DLC medlemmer i vores

DLC2

– /-

mus. Vores data viste ingen signifikant stigning i enten DLC1 eller DLC3 i disse væv af

DLC2

– /-

mus (Supplerende figur S1). Forsøgene blev udført uafhængigt tre gange.

Diskussion

Det blev rapporteret, at DLC1-mangel embryoner havde neuralrørsdefekter og døde tidligt at midgestation [17]. Som foreslået af Durkin et al. [17], dette kan også skyldes den primære fejl i andre organer, såsom udvikling hjerte. Vores gruppe for nylig viste, at DLC1 negativt reguleret Rho /ROCK [22]. Desuden blev et relativt højt niveau af ROCK udtryk tidligere er observeret i udviklingslandene hjerter embryoner, 7,0-9,0 dpc [23] og fra 9,5 til 11,5 dpc [24]. Dette antyder, at DLC1 mangel kan forstyrre den normale funktion af ROCK proteiner i embryonale hjerte og føre til embryonale dødelighed. Ikke desto mindre er de observerede fænotyper tyder på, at DLC1 har en afgørende rolle i den tidlige murine udvikling.

I denne undersøgelse viste vi, at DLC2 mangel ikke forvoldte nogen observerbare udviklingsmæssige defekter, og DLC2-mangel mus kunne overleve til voksenalderen. Dette antyder, at funktioner DLC2 i fosterudviklingen kan kompenseres ved dets homolog, DLC1, men ikke omvendt. Det er almindeligt, at paraloge gener kompensere funktionerne i de medlemmer af gruppen. For eksempel medlemmerne af muse Hox paraloge gruppe 3, Hoxa3, Hoxb3 og Hoxd3, interagerer synergistisk for at regulere fosterudviklingen i en dosisafhængig måde [25], [26]. Selvom DLC2 mangel ikke førte til embryonale dødelighed, DLC2-mangel mus var mindre og havde mindre fedtvæv. Da det blev påvist, at de fibroblaster afledt af 190B RhoGAP-mangelfulde embryoer var mindre [18] og var mindre effektiv adipogenese [19], vi undersøgte DLC2-mangel mus langs disse linjer. Men vi observeret nogen signifikante forskelle i cellestørrelse og adipogenese mellem fibroblaster afledt af

DLC2

– /- Salg og

DLC2

+ /+

mus. Også, den metaboliske bur eksperimentet ikke registrere nogen signifikant forskel mellem

DLC2

– /-

DLC2

+ /+

mus. I den forbindelse kunne vi ikke udelukke, at den metaboliske bur eksperiment måske ikke følsomme nok til at detektere den lille forskel i mængden af ​​fødeindtagelse, som kan forårsage den iagttagne fænotype i kropsvægt. Også kunne vi ikke udelukke, at

DLC2

– /- iBooked.dk mus kan være mere aktiv og forbruges flere kalorier end

DLC2

+ /+

mus

det blev påvist, at DLC2 lokaliseret i mitochondrierne og kan spille en rolle i lipid transport [7]. Desuden er det blevet foreslået, at START domæne indeholdende protein, stjerne, er et vigtigt element i steroid hormonproduktion i translokation af cholesterol fra den ydre membran til den indre membran af mitokondrier i steroidogene celle [27]. Da DLC2 er en START-domæne indeholdende protein og er i stand til at lokalisere i mitokondrierne, vil det være af interesse at undersøge den fysiologiske funktion af DLC2 i relation med lipidmetabolisme samt steroidhormon biosyntese.

DLC2 var vist at blive underexpressed i HCC [1], [2], [28] og har tumorundertrykkende funktioner, herunder suppression af celleproliferation, Ras-induceret kolonidannelse og forankringsuafhængig vækst [1], [2]. Et af vores primære mål i generering DLC2-deficiente mus var at undersøge tumor suppressor rolle DLC2 in vivo. Vi fandt, at DLC2 mangel ikke prædisponere til dannelsen af ​​HCC eller forværre DEN-induceret hepatocarcinogenese. Igen kan tumorsuppressorfunktion af DLC2 funktion blive opvejet af DLC1. Da DLC1-defekte mus dør på fosterstadiet, ville det være interessant at se, om hepatocyt-specifik mangel på DLC1 kan prædisponere sådanne mus til udvikling af HCC og at afgrænse rolle DLC2 mangel i udviklingen af ​​HCC i disse mus. Det blev påvist, at tab af p53 ville accelerere hepatocarcinogenese i transgene mus, der overudtrykker c-myc [29]. Det ville være informativt at krydse DLC2-deficiente mus med andre knockout mus af tumorsuppressorgener, såsom p53 og /eller transgene mus overudtrykker onkogener såsom c-myc og TGF-alpha [30]. Alternativt kan det nyudviklede system ved Zender et al. kunne udnyttes til at studere tumor suppressor rolle DLC2 i hepatocarcinogenese [31]. I dette system, kunne p53-deficiente liver progenitorceller være inficeret med en kombination af økotropiske retrovira, der bærer c-myc, RAS, AKT og DLC2. Dette vil give os mulighed for yderligere at undersøge, om DLC2 har tumorsuppressorfunktion in vivo.

DLC2 tilhører et medlem af DLC familiens proteiner. Det koder en RhoGAP domæne med høj sekvenshomologi med DLC familiemedlemmer, DLC1 og DLC3. I vores tidligere undersøgelser, demonstrerede vi, at DLC2 eller DLC1 kunne inhibere RhoA aktivitet, som resulterede i nedregulering af actin stress fiberdannelse. Desuden undersøgelse fra Kawai et al viste, at DLC3 også kunne hæmme RhoA aktivitet ved sit RhoGAP domæne. Ektopisk ekspression af DLC3 i HeLa-celler faldt antallet af aktin stress fibre [32]. Resultaterne tyder på, at de funktionelle roller DLC1, DLC2 og DLC3 i cellelinjer og deres nedstrømseffektorer er helt ens. I musemodellen, DLC1 udtømning var embryonale dødelig mens vores DLC2 knockout-mus kunne overleve til voksenalderen. Dette antyder, at funktioner DLC2 i fosterudviklingen kan kompenseres ved DLC1 eller DLC3. Men fra vores semi-kvantitativ RT-PCR resultat, var der ingen signifikant stigning i enten DLC1 eller DLC3 i leverne, hjerte og skeletmuskulatur af DLC2 knockout-mus. Resultatet indebærer, at den fysiologiske niveau af DLC1 eller DLC3 udtryk kan være tilstrækkelig for udligning af DLC2 funktioner. Det vil være interessant at generere DLC3 knockout-mus for at studere dens betydning i fosterudviklingen og undersøge, om dens funktion kan opvejes af andre DLC medlemmer. Desuden knockout-musene data viser, at DLC medlemmer kan spille forskellige fysiologiske roller under udvikling. Bortset fra den fælles nedstrøms effektor (RhoA), kan der være andre forskellige molekylære mål bliver specifikt reguleret af en bestemt DLC medlem.

Udover at studere tumor suppressor rolle DLC2 i HCC, kan de DLC2-mangel mus være nyttige for at studere andre cancertyper, som nedregulering af DLC2 også blev observeret i lunge, ovarie, nyre-, bryst, livmoder, gastrisk, colon og rektal kræft [33].

Støtte Information

Figur S1.

Expression niveau af DLC1 og DLC3 i DLC2 – /- og DLC2 + /+ mus. Semikvantitativ PCR udført på leverne, skeletmuskulatur og hjerter af DLC2 – /- og DLC2 + /+ mus af 3 måneder viste ingen signifikant forskel i mRNA-ekspressionsniveauer af DLC1 og DLC3. β-actin gen er anvendt til normalisering

doi:. 10,1371 /journal.pone.0006566.s001

(0,39 MB TIF)