PLoS ONE: TC-1 Overekspression Fremmer Cell Proliferation i Human Ikke-småcellet lungekræft, som kan hæmmes af PD173074

abstrakt

Kræft i skjoldbruskkirtlen-1 (TC-1), et nativt uordnet protein, udtrykkes bredt i hvirveldyr og overudtrykt i mange former for tumorer. Men dens præcise rolle og regulering mekanisme i humane ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er stadig uklare. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at TC-1 udtrykkes stærkt i NSCLC og at dens afvigende ekspression er stærkt forbundet med NSCLC celleproliferation. Exogen TC-1 overekspression fremmer celleproliferation, accelererer celle G1-til-S-faseovergangen, og reducerer apoptose i NSCLC. Knockdown af TC-1 imidlertid inhiberer NSCLC celleproliferation, cyklus overgang, og apoptose modstand. Endvidere har vi også vist, at PD173074, der fungerer som en inhibitor af TC-1 i NSCLC, formindsker ekspression af TC-1 og inhiberer TC-1 overekspression medieret celleproliferation

in vitro

i vivo

. Ikke desto mindre blev den hæmning funktion PD173074 på NSCLC celledeling elimineret i celler med TC-1 knockdown. Disse resultater antyder, PD173074 spiller en væsentlig rolle i TC-1 overekspression medieret NSCLC celleproliferation og kan være en potentiel indgriben mål for forebyggelse af celleproliferation i NSCLC

Henvisning:. Lei J., Li W, Yang Y , Lu Q, Zhang N, Bai G, et al. (2014) TC-1 Overekspression Fremmer Cell Proliferation i Human Ikke-småcellet lungekræft, som kan hæmmes af PD173074. PLoS ONE 9 (6): e100075. doi: 10,1371 /journal.pone.0100075

Redaktør: Philip C. Trackman, Boston University Goldman School of Dental Medicine, USA

Modtaget: Januar 20, 2014 Accepteret: 21. maj 2014 Udgivet: 18 juni 2014

Copyright: © 2014 Lei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de førende årsager til sygelighed verdensplan. I 2013 er cirka 228.190 nye tilfælde forventes at forekomme i USA, der tegner sig for 13,74% af alle nye kræfttilfælde. Endnu mere ildevarslende, på trods af en multi-modalitet behandling, herunder kirurgisk ledelse, kemoterapi og strålebehandling, lungekræft stadig den hyppigste årsag til kræft dødelighed i både mænd og kvinder; i virkeligheden, ca. 159.480 patienter dør af lungekræft sygdomme i USA [1] Stater. Derfor er nye behandlingsformer, der opstår fra en bedre forståelse af de molekylære regulatorer af tumorvækst presserende behov. I de senere år har mange biomarkører, der er involveret i udviklingen af ​​lungekræft blevet undersøgt, men kun få studier har vurderet funktionerne for TC-1 i udvikling lungekræft.

TC-1 blev oprindeligt klonet fra subtraktiv hybridisering mellem en papillær thyreoideakarcinom og dens omgivende normale thyreoideavæv [2]. Det udtrykkes ubikvitært tværs af en bred vifte af hvirveldyr med den højeste bevaring på tværs af arter fokuseret på den åbne læseramme (ORF). Dets allestedsnærværende ekspression og sekvenskonservering tyder på, at TC-1 kan spille en vigtig rolle i cellebiologi [3]. Den koder for et protein af 106 aminosyrer uden en identificeret funktionelt domæne, som angiver, at TC-1-protein er et medlem af nativt uordnede protein gruppe, der har vist sig at udføre centrale funktioner i cellecykluskontrol, proliferation, metastase, og signaltransduktion [3], [4]. Et stigende antal undersøgelser har vist, at TC-1 udtrykkes stærkt i flere carcinomer, og dens afvigende ekspression blev impliceret i proliferationen af ​​normale celler og cancerceller [5] – [9]. Margaret Sunde et al. bekræftede, at TC-1 er en hidtil ukendt tumorigen protein associeret med cancer i skjoldbruskkirtlen og fandt, at overekspression af TC-1 i normale skjoldbruskkirtelceller øget deres proliferationshastighed, forbedret deres forankringsuafhængig vækst i blød agar og nedsat deres apoptose rate [3] . TC-1, som er beliggende i brystcancer-sensitive genomiske region (8p

11-12), blev fundet at være signifikant opreguleret i human brystcancer cellelinjer og væv og derved implicerer dette protein i udviklingen af ​​brystcancer [8]. I mavekræft, blev TC-1 fundet at være en af ​​de opregulerede gener i begge cellelinier og karcinom væv, og dens udtryk var stærkt korreleret med næsten alle klinisk-patologiske variabler af aggressiv biologisk adfærd kræftformer, herunder størrelse, fremskredent stadium, og dårlig overlevelse [10], [11]. Imidlertid ekspressionsniveauet og den biologiske funktion af TC-1 i NSCLC hidtil ikke blevet belyst.

For nylig Olivier E. Pardo et al. rapporterede, at den selektive fibroblastvækstfaktorreceptor (FGFR) inhibitor PD173074 blokerer spredning og klonogene vækst af to småcellet lungecancer cellelinier (H69 og H510) i en dosis-afhængig måde og forhindrer FGF-2-induceret kemoresistens. Overraskende, i H510 xenotransplantater blev tumorvækst svækket med PD173074 behandling, hvilket resulterer i en stigning i den gennemsnitlige overlevelse sammenlignet med kontrol sham-behandlede dyr, i lighed med den virkning, observeret med monoterapi administration af cisplatin; i H69 xenotransplantater, PD173074 inducerede et komplet respons, der varede i mindst 6 måneder i 50% af musene. Desuden blev effekten af ​​cisplatin væsentligt forstærket af dens samtidig administration med PD173074. Disse virkninger blev forklaret af det fund, at PD173074 behandling faldt intratumoral proliferation og forøget celle apoptose med en høj forekomst af den apoptotiske celledød markør caspase-3 [12]. Disse opmuntrende resultater fremme en yderligere undersøgelse af effekten af ​​PD173074 på NSCLC celler.

For at undersøge betydningen af ​​TC-1 i celledeling og vurdere effekten af ​​PD173074 på TC-1-medieret celleproliferation, i dette undersøgelse undersøgte vi forholdet mellem TC-1-ekspression og celleproliferation i NSCLC ved immunhistokemi, og virkningen af ​​PD173074 på TC-1-medieret celleproliferation ved anvendelse af en serie

in vitro

i vivo

tab af funktion og få-of-funktion studier.

Materialer og metoder

2.1 Etik Statement

den menneskelige undersøgelse blev godkendt af Tangdu Hospital institutionelle etiske komité, og den forskning, undersøgelse blev udført i overensstemmelse med bestemmelserne i Helsinki-erklæringen af ​​2008. Alle deltagere forudsat skriftligt informeret samtykke før du deltager i undersøgelsen.

Alle dyreforsøg blev gennemført med en protokol godkendt af Tangdu Hospital Animal Care og brug Udvalg.

2.2 Immunhistokemi og evaluering

Umiddelbart efter kirurgisk fjernelse, prøver fra 122 patienter med NSCLC blev dissekeret af patologer og snap-frosset i flydende nitrogen. Kræft blev udtaget fra midten af ​​noduler og de normale prøver blev opnået fra et område 5 cm fjernt fra knuderne. Hver af prøverne blev fikseret med 4% paraformaldehyd og indlejret med paraffin. Vævene blev skåret til opnåelse af 4-um-tykke sektioner, og sektionerne blev afvokset med en serie af xylen og rehydreret gennem en gradueret række af alkohol. Microwave antigen-genvinding blev udført ved 750 W i 10 minutter i citratpuffer (pH 6,0) for at forbedre immunoreaktiviteten. Den endogene peroxidase aktivitet af sektionerne blev blokeret med 3% hydrogen peroxidase i 30 min, og sektionerne blev derefter inkuberet med 5% normalt gedeserum i PBS i 30 minutter ved 25 ° C for at blokere enhver ikke-specifik antistofreaktion. Snittene blev vasket tre gange med PBS i 10 minutter, inkuberet med de primære antistoffer (TC-1, 1:100, Gene Tex, USA; Ki-67, 1:300, NeoMarkers Lab Vision Corp, CA, USA) natten over ved 4 ° C og derefter farvet med en Envision ™ Detection Kit (Dako, Danmark) ifølge producentens instruktioner. Snittene blev derefter behandlet med 0,003% 3, 30-diaminobenzidin og modfarvet med hæmatoxylin.

Evalueringen af ​​TC-1-ekspression blev opnået ved to patologer uden adgang til de kliniske data og var baseret på både graden af TC-1 mærkning og intensiteten af ​​TC-1-farvning. Graden af ​​TC-1 mærkning blev målt ifølge procentdelen af ​​positive celler: 0 = 0-5%, 1 = 6-25%, 2 = 26-50%, 3 = 51-75% og 4 = 76- 100%. Intensiteten af ​​TC-1 farvning blev estimeret visuelt og stratificeret i fire grupper: 0 = negativ; 1 = svag; 2 = moderat; og 3 = intens. TC-1 score blev bestemt som graden af ​​TC-1 mærkning multipliceret med intensiteten af ​​TC-1-farvning: 0 = 0, 1+ = 1-4, 2+ = 5-8, 3+ = 9-12. Disse tumorer med en score på 0 blev betragtet som TC-1-negative, mens de andre (1+ til 3+) blev betragtet som positive. Procentdelene af Ki-67-reaktive tumorceller blev undersøgt i et high-power felt (400 ×) ved at tælle mere end 1000 tumorceller i tilfældigt udvalgte repræsentative dele af tumoren [13].

2.3 Cellekultur

NSCLC A549, SPC-A-1, 95D, og ​​NCI-H520-celler og tunica mucosa bronchiorum epithel 16HBE celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og opretholdt i vort laboratorium . Cellerne blev dyrket i RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) suppleret med 10% kalvefosterserum (Gibco, Grand Island, NY, USA) og 100 enheder /ml streptomycin /penicillin og dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. For PD173074 eksperimenter blev A549 og A549- pLenti-shRNA1 celler dyrket i serum-frit og epidermal vækstfaktor (EGF) -fri medium (SITA: RPMI 1640 suppleret med 5 pg /ml insulin, 10 pg /ml transferrin, 30 nmol /L natriumselenit, og 0,25% bovint serumalbumin) tilsat PD173074 (opløst i DMSO, Cayman, USA) ved en slutkoncentration på 1 μΜ. Væksten medier til kontrol- cellerne blev suppleret med tilsvarende mængder af DMSO uden inhibitor.

2.4 Knockdown af TC-1 ved RNA Interference

Fire RNAi kandidat målsekvenser for menneskers TC-1 (tabel 1) blev designet og klonet ind i pGCSIL-GFP vektor af Shanghai GeneChem Co., Ltd (Kina). TC-1 shRNA1 (tabel 1) udviste den bedste knockdown effektivitet i 293T-celler cotransficeret med TC-1 og shRNA ekspressionskonstruktioner, som afsløret ved Western blot og immunfluorescens-assays, og blev således valgt til knockdown af det endogene TC-1 i NSCLC celler. Ikke-silencing-shRNA (NSRNA) blev anvendt som en negativ kontrol. De oligonukleotider, der koder TC-1 shRNA1 eller NSRNA sekvens og et loop-sekvens adskiller de komplementære domæner blev syntetiseret og indsat i pGCSIL-GFP ved Shanghai GeneChem Co, Ltd (Kina). Det rekombinante virus blev pakket ved hjælp Lentivector Expression Systems (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Kina). A549-celler blev inficeret med en forbedret infektion opløsning og dyrket i RPMI-1640 medium. En uge efter infektion blev GFP-positive celler sorteret under anvendelse af et flowcytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Den ordnet GFP

+ celler (renhed 97%) blev derefter anvendt i de efterfølgende eksperimenter

2,5 lentivirus Konstruktion og transduktion Celler

HA-TC1 konstruere. i pLenti-DEST vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) blev beskrevet tidligere [14]. Kort fortalt blev en post klon indeholdende fuldlængde TC-1 først skabt af vores team hjælp af pENTR retningsbestemt TOPO kloning (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Efter angivelsen klon blev genereret, blev LR rekombinationsreaktion udført for at overføre genet i pLenti-DEST vektor for at skabe udtrykket klonen. Konstruktionen blev sekventeret for at sikre, at sekvenserne og orienteringen var korrekt. Lentivirus blev fremstillet ved co-transfektion af 293T celler med pLenti ekspressionskonstruktionen hjælp af optimerede emballagemix (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). NCI-H520-celler blev transduceret med lentivirus, og pLenti-LacZ virus blev anvendt som kontrol. Selektion blev initieret 48 timer efter infektion i RPMI-1640-medium med 10 ug /ml blasticidin i fravær af insulin eller EGF. Efter at have nået konfluens blev de selekterede celler passeret og serielt dyrket.

2.6 Real Time-polymerasekædereaktion

Det totale RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) , og cDNA blev syntetiseret under anvendelse af PrimeScript RT Master Mix (Takara, Japan). Kvantitativ PCR blev udført ved anvendelse af en kontinuerlig fluorescens detektion termiske cykler ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (ABI, CA, USA) med SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Japan). Målingerne blev udført tredobbelt under anvendelse af GAPDH som en endogen kontrol. QRT-PCR blev udført under anvendelse af primere for TC-1 (5-AGCCACCAAGCCATC ATCAT-3, 5-TGTGTCGAAGTGGTAGCCATG-3) og GAPDH (5-AGGTCCACC ACTGACACGTT-3, 5-GCCTCAAGATCATCAGCA AT-3).

2.7 Western blotting

Western blotting blev udført som tidligere [10] beskrevne. Celler blev høstet og vasket med PBS efter dyrkning i 48 timer med MG-132 (opløst i DMSO, Cayman, USA) ved en slutkoncentration på 500 nM. Lige proteinmængder af prøverne blev separeret ved 10% SDS-PAGE. Efter blotting på en nitrocellulosemembran (Amersham Biosciences, Piscataway, NY, USA) blev membranen inkuberet i blokeringsbuffer [Tris-pufret saltvand (TBS) indeholdende 0,1% Tween 20 og 5% skummetmælk] i 1 time ved 25 ° C og derefter med det primære antistof (TC-1, 1:300, Gene Tex, Amerika; p-actin, 1:500, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) ved 4 ° C natten over. Derefter blev membranen skyllet tre gange med TBS-T og inkuberet med peberrodsperoxidase-mærkede sekundære antistoffer i 2 timer ved 25 ° C. De immunreaktive bånd blev afsløret under anvendelse af et forøget kemiluminescens-systemet (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), og fotografierne af båndene blev analyseret under anvendelse FluorChemTMIS-8900 (Alpha Innotech Co., San Leandro, CA, USA).

2.8 MTT assay

celler (1 x 10

3 celler /brønd) blev podet på plader med 96 brønde. Ved en række tidspunkter, blev 20 pi MTT tilsat til hver brønd, og cellerne blev derefter inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Derefter 150 pi dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma, USA) blev tilsat til hver brønd. Pladerne blev rystet i 10 minutter, og den optiske densitet (OD) værdi blev målt ved 490 nm under anvendelse af en mikropladelæser (Bio-Rad Model 680, USA). Cellevæksten kurver blev derefter trukket. Alle forsøg blev gentaget tre gange, og gennemsnitsværdierne blev vedtaget.

2.9 Plate kolonidannelse Assay

Celler (4 × 10

2 celler /brønd) blev podet på seks -Nå plader og spredt jævnt med lidt ryste pladerne. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2, indtil synlige kolonier fremkom. Kolonierne blev fikseret med 95% ethanol og farvet med krystalviolet farvning opløsning. Kolonierne med mere end 40 celler blev talt under anvendelse af et omvendt mikroskop, og dannelseshastigheden koloni blev beregnet ved følgende formel: Plate kolonidannelse effektivitet = (antal kolonier /antal celler indpodet) × 100%. Alle forsøg blev gentaget tre gange, og gennemsnitsværdierne blev vedtaget.

2.10 flowcytometri Analyse af Cell Cycle

Cellerne blev høstet ved trypsinisering og opsamles i centrifugerør (2 × 10

6 celler /rør). Derefter blev 1 ml af PBS og 2 ml dehydreret alkohol til hvert rør (4 ° C natten over) for at fastgøre cellerne. Efter RNAse og PI behandling blev procentdelen af ​​celler i S-fasen, målt ved anvendelse af en BD FACSAria flowcytometer (Franklin Lakes, NJ, USA). Dataene blev analyseret ved anvendelse af ModFit LT (Verity Software House, USA).

2.11 flowcytometrianalyse af celleapoptose

Cellerne blev høstet ved trypsinisering og opsamlet i centrifugerør (1 × 10

6 celler /rør). Efter to gange vask med iskold PBS, blev cellerne inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke i en opløsning indeholdende PE-A og PerCP-Cy5.5 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA) i fluorescens-aktiveret celle sorteringsanlæg (FACS) analyse under anvendelse af en FACS instrument udstyret med en dublet diskriminerende modul (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Dataene blev analyseret ved anvendelse af CellQuest-software (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Ti tusinde til 20.000 celler blev analyseret per prøve.

2,12

In vivo

Tumorigenicitet Assay

For tumorigeniciteten assay, 4- til 6 uger gamle BALB /c athymiske nøgne mus (Experimental Animal Center, Forth Military Medical University, Xi’an, Kina) blev subkutant administreret 5 x 10

6 A549- pLenti-shRNA1, A549- pLenti-NSRNA, NCI-H520-pLenti-TC-1 eller NCI-H520-pLenti-LacZ-celler. Dimensionerne af tumorerne blev målt hver femte dag i en periode på 30 dage under anvendelse af en lineær tykkelse. Tumorvolumenet blev beregnet under anvendelse af følgende ligning: V (mm

3) = a x b

2/2, hvor “a” er den største dimension og “b” er den vinkelrette diameter. Hver gruppe omfattede fem mus. Dyrene blev aflivet efter 30 dage, og tumorerne blev målt og fjernet til yderligere undersøgelse.

2,13

In vivo

PD173074 Behandling Assay

I alt 5 × 10

6 A549- pLenti-shRNA1 eller A549-celler (01:01 cellesuspension; Matrigel) blev implanteret i flanken af ​​4- til 6 uger gamle Balb /C athymiske nøgne mus. Når tumorerne blev målbare, blev 50 mg /kg PD173074 /mus eller et ækvivalent volumen puffer alene administreres dagligt i i alt 28 dage. Desuden modtog musene eller ikke har modtaget to doser af 5 mg /kg cisplatin i.v. på dag 1 og 15. tumorvolumen blev overvåget ved anvendelse af en lineær tykkelse. Dyrene blev aflivet, når tumor byrde nåede 15 mm i enhver dimension, og overlevelse blev optaget med en Kaplan-Meier plot.

2.14 Statistisk analyse

Dataene er udtrykt som middelværdi ± standard fejl (SE). SPSS 13.0 softwarepakke (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) blev anvendt til de statistiske analyser. Mann-Whitney U test blev anvendt for de parametriske data, og Student

t

test blev hjælp for sammenligninger af midler mellem to grupper af måledata. Analyse af varians (ANOVA) blev anvendt til sammenligninger af midler til flere grupper af måledata, og Student-Newman-Keuls (SNK) test blev anvendt til yderligere sammenligninger af hver gruppe. Log-rank (Mantel-Cox) test blev anvendt til at analysere overlevelseskurven. AP værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

3,1 TC-1 udtrykkes på høje niveauer og associerede stærkt med Cell Proliferation i Human Primary NSCLC

Til vurdere ekspressionen af ​​TC-1 i humane primære NSCLC, immunohistokemi blev udført under anvendelse af 122 prøver af NSCLC, herunder 68 pladecellecarcinom og 54 adenocarcinom prøver, der blev opnået fra 83 hanner og 39 hunner (tabel 2). TC-1-ekspression var tydelig i 49 (72,06%) af de pladecellekarcinom prøver og 41 (75,93%) af de adenocarcinom prøver. Ekspressionen af ​​TC-1 blev hovedsagelig lokaliseret i cytoplasmaet, men nuklear farvning var også delvist til stede. I normal lungevæv, ikke-neoplastisk bronchiale og alveolære epiteler celler var konsekvent ikke-reaktivt eller lav-reaktiv over for TC-1 (fig. 1). Desuden TC-1-ekspression præsenteret små forskelle mellem køn, alder og histologiske undertyper (P 10%) og lav-proliferation gruppe (Ki-67 mærkningsindeks ≤10%) i både lungen skvamøs celle carcinom og adenocarcinom prøver (P 0,05), hvilket antyder, at TC-1-ekspression er stærkt korreleret med celleproliferation af NSCLC

3.2 Generering af stabile kloner af NSCLC celler, der overudtrykker eller nedregulering af TC-1

.

for at undersøge virkningen af ​​TC-1 afvigende ekspression på NSCLC-celler, qReal-Time PCR og western blotting blev udført under anvendelse af humane NSCLC cellelinjer A549, SPC-A-1, 95D, og ​​NCI-H520, og 16HBE cellelinie blev anvendt som en kontrolgruppe. Som vist i fig. 2A, ekspressionsniveauet af TC-1 i A549, SPC-A-1, og 95D-celler var højere end det, der opnås i 16HBE celler og ekspressionsniveauet af TC-1 i NCI-H520-celler var lavere end hos de 16HBE celler. Baseret på disse resultater, blev A549 og NCI-H520 fundet at være repræsentative celler, der udviser den højeste og en lavere ekspressionsniveau af TC-1 og blev udvalgt til yderligere undersøgelse. Derefter blev pLenti-shRNA1 transficeret i A549-celler, og pLenti-TC-1 blev transficeret i NCI-H520 celler. Stabile kloner blev isoleret efter klon screening ved fluorescensaktiveret cellesortering eller blasticidin hhv. Den qReal-Time PCR og western blotting-resultater viste, at TC-1-ekspression blev markant nedsat eller forøget i de behandlede celler sammenlignet med kontrollen, hvorimod den negative kontrol ikke udviste nogen ændring i niveauet af TC-1-ekspression (fig. 2B og 2C).

QRT-PCR og western blotting viste, at A549, SPC-A-1, og 95D-celler udtrykker høje niveauer af TC-1-mRNA og protein, og at NCI-H520-celler udtrykker lave niveauer af TC -1 mRNA og protein (A). De QRT-PCR og Western blotting resultaterne vist i B og C, viser, at TC-1 mRNA og protein er signifikant nedreguleret i A549-pLenti-shRNA1 celler og signifikant opreguleret i NCI-H520-pLenti-TC-1-celler i forhold til kontrollerne. Søjlerne repræsenterer gennemsnittet af den relative mRNA mængde fra mindst tre uafhængige forsøg. Søjlerne viser SE. * Angiver statistisk signifikante ændringer (P 0,05). Blandt fem grupper (A) eller tre grupper (B, C)

3,3 TC-1 Fremmer Cell Proliferation og Cell Cycle Overgang og Hæmmer Cell Apoptose i NSCLC

in vitro

for at undersøge funktionen af ​​TC-1-ekspression i NSCLC celleproliferation, tab af funktion og vinde-funktions blev udført. Især i MTT-assayet, transfektion af pLenti-TC1 transfektion forøgede proliferation af NCI-H520-celler sammenlignet med kontrolcellerne. Alternativt TC1 knockdown hjælp TC1-shRNA1 viste signifikant nedregulering af proliferation i A549-pLenti-shRNA1 celler sammenlignet med NSRNA-transfekterede celler (fig. 3A). Endvidere koloni numrene på de pLenti-TC-1 og pLenti-NS RNA grupper var højere end dem opnået for de pLenti-LacZ og pLenti-shRNA1 grupper, (fig. 3B). Disse resultater antyder, at TC-1 fremmer celleproliferation i NSCLC

in vitro

.

(A) MTT assay. Vægtfyldeværdien optisk blev påvist ved en række tidspunkter for at evaluere celleproliferation. (B) Plate kolonidannelse assayet. Kolonierne blev farvet med krystalviolet farvning opløsning og talt, og klonen dannelseshastigheden blev derefter beregnet. (C) Cell cycle assay. Procentdelen af ​​celler i S-fasen blev målt ved anvendelse af et flowcytometer, og dataene blev analyseret under anvendelse af ModFit LT. (D) Cell apoptose assay. Cellerne blev inkuberet i mørke i en opløsning indeholdende PE-A og PerCP-Cy5.5. Procentdelen af ​​apoptotiske celler (nederste højre kvadrant) blev analyseret under anvendelse af en FACS udstyret med en dublet diskriminerende modul, og dataene blev analyseret under anvendelse af CellQuest software. Søjlerne repræsenterer gennemsnittet kolonidannelse sats (B), S-fase cellerate (C), og apoptose cellerate (D) fra mindst tre uafhængige forsøg. Søjlerne viser SE. * Angiver statistisk signifikante ændringer (P 0,05) blandt tre grupper

cellecyklus fase fordeling blev målt ved flowcytometri.. Resultaterne viste, at procentdelen af ​​celler i S-fasen blev signifikant øget efter behandling med pLenti-TC1 sammenlignet med den opnået efter behandling med pLenti-LacZ. I modsætning hertil procentdelen af ​​celler i S-fasen faldt signifikant behandlingen med pLenti- shRNA1 sammenlignet med den opnået med pLenti-NSRNA (fig. 3C). Disse resultater indikerer, at TC-1 fremmer G1-til-S-faseovergangen.

Endvidere er virkningen af ​​TC-1 på NSCLC-celle apoptose blev analyseret ved flowcytometri. Som vist i fig. 3D, cellerne transficeret med pLenti-TC-1 vises lavere apoptotiske satser sammenlignet med cellerne transficeret med pLenti-LacZ, og cellerne transficeret med pLenti-shRNA1 vises højere apoptotiske satser sammenlignet med cellerne transficeret med pLenti-NSRNA, hvilket antyder, at TC -1 hæmmer celle apoptose i NSCLC.

3.4 TC-1 Fremmer NSCLC Cell proliferation

in vivo

for at vurdere funktionen af ​​TC-1-ekspression i NSCLC celledeling

in vivo

, en

in vivo

tumorgenicitet blev udført. Dimensionerne af tumorerne blev målt hver femte dag i en periode på 30 dage (fig. 4B og 4D). Ved afslutningen af ​​eksperimentet, blev musene aflivet, og tumorerne blev fjernet og fotograferet (fig. 4A og 4C). Som vist i fig. 4, vores tumorigenisitetsforsøg assay resultater viser, at opregulering af ekspressionsniveauet af TC-1 fremmer celleproliferation

in vivo

, hvorimod knockdown af ekspressionsniveauet af TC-1 inhiberer celleproliferation

in vivo

.

Subkutan tumor model (n = 5). Celler blev subkutant injiceret i flanken af ​​athymiske nøgne mus, og tumorvolumen blev registreret hver femte dag (C, D). Musene blev aflivet 30 dage efter injektion blev tumorerne fjernet, og fotografier blev taget (A, B).

En del af hver subkutan knude blev sektioneret og underkastet immunhistokemisk for Ki-67. Vores resultater viste, at der var en signifikant forskel i antallet af Ki-67-reaktive tumorceller i de subkutane knuder mellem de to grupper (Ki-67 indekser for de subkutane knuder var følgende: A549- pLenti-NSRNA, 68,98 ± 2,56%; A549- pLenti-shRNA1, 28,63 ± 2,38%, P 0,05; NCI-H520- pLenti-TC-1, 86,26 ± 3,16%; NCI-H520- pLenti-LacZ, 51,34 ± 1,78%, P 0,05) . Disse resultater viser, at TC-1 signifikant forbedrer spredning kapacitet NSCLC celler

in vivo

.

3,5 PD173074 Formindsker Ekspression af TC-1 i en dosis-afhængig måde over et bestemt interval

for at teste, om tilsætning af PD173074 påvirker ekspressionen af ​​TC-1 i NSCLC, blev A549 og A549-pLenti-shRNA1 celler i SITA behandlet med PD173074. Resultaterne af RT-PCR og western blotting viste, at ekspressionsniveauet af TC-1 faldt med en stigning i koncentrationen af ​​PD173074 og udjævner når koncentrationen af ​​PD173074 når 1 μΜ (Fig. 5). Koncentrationen af ​​1 μΜ blev således udvalgt til yderligere undersøgelse.

QRT-PCR og Western blotting Resultaterne viste, at ekspressionsniveauet af TC-1 faldt med en stigning i koncentrationen af ​​PD173074 og niveauer ud når koncentrationen af PD173074 når 1 μΜ i A549 (A) og A549-pLenti-shRNA1 (B) celler. Søjlerne repræsenterer gennemsnittet af den relative mRNA mængde fra mindst tre uafhængige forsøg. Søjlerne viser SE. * Angiver statistisk signifikante ændringer (P 0,05). Blandt fem grupper

3.6 PD173074 hæmninger af celleproliferation, Cycle Transition, og apoptose Resistance Afhænger af TC-1 Expression niveau

in vitro

for at undersøge effekten af ​​PD173074 på TC-1-medieret celleproliferation i NSCLC, en MTT assay blev tallerken kolonidannelse assay, cellecyklus analyse og celle apoptose analyse udført. Som vist i fig. 6A, PD173074 behandling har en markant indflydelse på celle vækstkurver de utransficerede celler, som illustreret ved forskellen mellem A549 + PD173074 gruppen og A549-gruppen, men har ringe indflydelse på celle vækstkurver de transfekterede celler, som angivet af forskellen mellem A549-pLenti-shRNA1 + PD173074 gruppen og A549-pLenti-shRNA1 gruppe. Et lignende resultat blev observeret i pladen kolonidannelse assayet: der var en signifikant forskel i dannelsen sats koloni mellem A549 + PD173074 gruppen og A549-gruppen, men kun mindre forskelle i formationen rate koloni blev observeret mellem A549-pLenti- shRNA1 + PD173074 gruppen og A549-pLenti-shRNA1 gruppe (fig. 6B). Som vist i fig. 6C de procentdele af celler i S-fasen i bestandene af PD173074-behandlede A549 celler, A549 celler, PD173074-behandlede A549-pLenti-shRNA1 celler, og A549-pLenti-shRNA1 celler 29,47 ± 0,62%, 49,5 ± 1,89% , 28,02 ± 0,97%, og 29,5 ± 1,02%, hhv. Det er klart, at der var en signifikant forskel mellem A549 + PD173074 gruppen og A549-gruppen, men kun ringe forskel mellem A549, pLenti-shRNA1 + PD173074 gruppen og A549-pLenti-shRNA1 gruppe. Som vist i fig. 6D, de apoptotiske satser af PD173074-behandlede A549-celler var signifikant højere end den for A549-celler; dog var der ingen markant forskel i den apoptotiske sats mellem PD173074-behandlede A549-pLenti-shRNA1 celler og A549-pLenti-shRNA1 celler. Tilsammen indikerer disse data, at PD173074 hæmmer TC-1-medieret celleproliferation, cellecyklus overgang, og celle apoptose modstand, når TC-1 er stærkt eller moderat udtryk, men ikke når det er ydmyge udtryk.

(A ) MTT assay. Vægtfyldeværdien optisk blev påvist ved en række tidspunkter for at evaluere celleproliferation. (B) Plate kolonidannelse assayet. Kolonierne blev farvet med krystalviolet farvning opløsning og talt, og klonen dannelseshastigheden blev derefter beregnet. (C) Cell cycle assay. Procentdelen af ​​celler i S-fasen blev målt ved anvendelse af et flowcytometer, og dataene blev analyseret under anvendelse af ModFit LT. (D) Cell apoptose assay. Cellerne blev inkuberet i mørke i en opløsning indeholdende PE-A og PerCP-Cy5.5. Procentdelen af ​​apoptotiske celler (nederste højre kvadrant) blev analyseret ved anvendelse af en FACS udstyret med en dublet diskriminerende modul, og dataene blev analyseret under anvendelse af CellQuest software. Søjlerne repræsenterer gennemsnittet kolonidannelse sats (B), S-fase cellerate (C), og apoptose cellerate (D) fra mindst tre uafhængige forsøg. Søjlerne viser SE. * Angiver statistisk signifikante ændringer (P 0,05). Mellem A549 gruppen og A549 + PD173074 gruppe

3.7 PD173074 hæmninger af celleproliferation, Cycle Transition, og apoptose Resistance Afhænger af TC-1 Expression