PLoS ONE: Farmakologisk Tilbageførsel af histon Methylering Presensitizes bugspytkirtelkræftceller for nukleosid Narkotika: In vitro Optimering og Novel Nanopartikel Delivery Studies

Abstrakt

Vi evaluerede potentialet i et testpræparat histon methylering vending agent, 3-deazaneplanocin A (DZNep), forbedre kemosensitivitet af kræft i bugspytkirtlen for nukleosid analoger (dvs. gemcitabins). DZNep bragte forsinket, men selektiv cytotoksicitet til bugspytkirtelkræftceller uden at påvirke normale humane pancreas duktalt epiteliale (Æske med HDPE) celler. Co-eksponering af DZNep og gemcitabin induceret cytotoksiske additivitet eller synergi i både vel- og dårligt differentierede bugspytkirtlen cellelinier ved øget apoptose. I modsætning hertil DZNep udøvede antagonisme med gemcitabin mod Æske med HDPE celler med signifikant reduktion i cytotoksicitet sammenlignet med gemcitabin-alone regime. DZNep marginalt afhang purin nukleosid transportører sin cytotoksicitet, men transport afhængighed blev omgået ved acyl derivatisering. undersøgelser Drug eksponering afslørede, at en kort priming med DZNep efterfulgt af gemcitabin snarere end co-behandling af begge midler til at producere en maksimal chemosensitization respons i begge gemcitabin følsom og gemcitabin-resistente bugspytkirtelkræftceller. DZNep hurtigt og reversibelt faldt trimethylation af histon H3 lysin 27 men steg trimethylation af lysin 9 i en EZH2- og JMJD1A /2C-afhængig måde henholdsvis. Men blev fundet DZNep potensering af nukleosidanalog chemosensitization, skal tidsmæssigt koblet til trimethylation ændringer i lysin 27 og ikke lysin 9. Polymere nanopartikler manipuleret til kronologisk slip DZNep efterfulgt af gemcitabin produceret udtalt chemosensitization og dosis-sænkende effekt. Sammen vores resultater identificere, at en optimeret DZNep eksponering kan presensitize bugspytkirtelkræftceller at anticancer nukleosidanaloger gennem tilbageførsel af histon methylering, understreger de lovende kliniske forsyningsvirksomheder af epigenetiske vending agenter i fremtidige bugspytkirtelkræft kombinationsbehandlinger

Henvisning.: Hung SW, Mody H, Marrache S, Bhutia YD, Davis F, Cho JH et al. (2013) Farmakologisk Tilbageførsel af histon Methylering Presensitizes bugspytkirtelkræftceller for nukleosid Narkotika:

In vitro

Optimering og Novel Nanopartikel Levering Studies. PLoS ONE 8 (8): e71196. doi: 10,1371 /journal.pone.0071196

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA

Modtaget: Februar 13, 2013; Accepteret: 27. juni, 2013; Udgivet: 6. august, 2013 |

Copyright: © 2013 Hung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [Grant P30GM092378] (SD), National Cancer Institute [Grant 1R03CA161832-01] (RG), Georgia Cancer Coalition (RG), og OVPR af The University of Georgia (SD). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Polycomb gruppe proteiner (PCGS) kan omforme kromatin ved at påvirke graden af ​​komprimering, hvilket fører til epigenetisk gendæmpning. Polycomb Repression Complex 2 (PRC2), en af ​​de to klasser af PCGS, inducerer histon methyltransferaseaktivitet primært ved trimethylating histon H3 ved lysin 27 (H3K27me3), mægle lyddæmpning af tumorsuppressorgener. Den katalytiske underenhed af PRC2 er Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2), hvor SET-domænet udgør det aktive sted for histon H3K27 methylering [1]. Undersøgelser støtter EZH2 som en central aktør i udviklingen og progressionen af ​​tumorer på grund af sin evne til at ændre gen udtryk herunder dem involveret i cellecyklus kontrol, celle migration, og DNA-reparation [2]. EZH2 er afgørende i kromatin kontrol med genetisk omprogrammering af cancer stamceller selvfornyelse og differentiering, der har været impliceret i kemoresistens [3] – [6]

Som markør for avanceret og metastatisk sygdom i mange faststof. tumorer, har EZH2 overekspression blevet rapporteret i pancreascancer, især dem, der er dårligt differentieret [6], [7]. EZH2 blev fundet at være opreguleret af onkogene RAS gennem MEK-ERK-signalering, der fører til nedregulering af tumorsuppressorer såsom RUNX3 og p27 (Kip1) [6], [8], [9]. EZH2 udtømning førte til standsning af cellecyklus ved G1 /S overgang, hvilket tyder proteinet kan undertrykke tumoren undertrykke p27-genet [10]. Tilsvarende knockdown af EZH2 resulterede i et signifikant fald i cellulær proliferation og invasivitet [6], [7], [11] og sensibiliserede bugspytkirtelkræftceller til doxorubicin og gemcitabin, afslører potentialet i en EZH2 inhibitor-kemoterapeutisk kombinationsbehandling [6] .

In vivo

, undertrykke EZH2 formindsket tumorigenicitet og hæmmede bugspytkirtelkræft metastaser [7]. Klinisk er der observeret positive korrelationer mellem EZH2 udtryk og avancerede bugspytkirtelkræft stadie og grad hos patienter [11]. I mange tilfælde blev høje niveauer af EZH2 i kræft også signifikant associeret med nedsat E-cadherin udtryk og meget aggressiv sygdom. I gemcitabin-behandlede patienter, var signifikant længere overlevelse hos patienter med lav snarere end høj EZH2 udtryk [12]. Følgelig kan EZH2 være en betydelig prognostisk værdi for samlet overlevelse i patienter med pancreascancer [13].

For nylig er det blevet vist, at en potent kemisk inhibitor af S-adenosylhomocysteinhydrolase, 3-deazaneplanocin A (DZNep) , modulerer chromatin gennem indirekte (dvs. reduktion methylgruppe tilgængelighed) hæmning af histon methyltransferaser herunder EZH2 [14], [15]. DZNep, en carbocyklisk analog af adenosin, udtømning cellulære niveauer af de PRC2 komponenter, mens inhibering af associerede H3K27me3 [16]. Mens de mekanismer og virkningerne af DZNep er blevet undersøgt i talrige faste tumorer og leukæmi [2], [3], [14], [15], [17] – [21], ved mindre om potentialet af denne forbindelse til pancreascancer behandling. Alligevel sin nuværende muligheder for at reducere EZH2 niveauer, reverterende epitel-til-mesenchymal overgang (EMT), og forebyggelse af tumor progression, gør det til en yderst lovende antimetastatisk middel [5]. Den terapeutiske potentiale DZNep i kombination med andre midler, såsom polyphenoler og histondeacetylaseinhibitorer, er begyndt at dukke op med opmuntrende resultater [14], [15]. Siden stigende tegn på, at fremtidige kræftbehandling vil drage fordel af de synergistiske virkninger, der opnås fra forskellige kombinationer af epigenetisk vending og konventionelle antitumormidler [22] undersøgte vi potentialet i DZNep-gemcitabin kombination for at forbedre anticancer aktivitet i kræft i bugspytkirtlen. Vores resultater er identificeret, at histon methylering tilbageførsel af DZNep presensitizes bugspytkirtelkræftceller til gemcitabin. Optimering af lægemidlet kombination gennem dosering og levering metoder blev yderligere gennemført.

Materialer og metoder

Reagenser

Radioaktivt mærket (

3H) gemcitabin, adenosin, thymidin, og guanosin blev opnået fra Moravek Biochemicals og Radiochemicals (Brea, CA), mens kold gemcitabin var fra ChemieTek (Indianapolis, IN). Adenosin og guanosin blev venligst stillet til rådighed af Dr. Chung K. Chu (University of Georgia). Thymidin, uridin, nitrobenzyl mercaptopurin ribosid (NBMPR), og 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Dimethylsulfoxid (DMSO) blev indkøbt fra Macron Chemicals (Center Valley, PA), og det bicinchoninsyre (BCA) protein-assay-reagens var fra Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL). Plastic varer til cellekultur blev opnået fra Corning (Corning, NY).

Cell Culture

De bugspytkirtelkræft cellelinier (ASPC-1, BxPC-3, Capan-1, MIA PaCa- 2, og Panc-1) og MCF-10A-celler blev modtaget fra the American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) cellebank. Disse cellelinier blev formeret, ekspanderet og frosset straks efter ankomsten. Cellerne genoplivet fra den frosne lager blev brugt inden for 10-20 passager, der ikke overstiger en periode på 2-3 måneder. Den ATCC bruger morfologiske, cytogenetiske og dna-profil-analyse til karakterisering af cellelinier. Humane pankreatiske duktale epitel (HPDE) -celler [23] blev venligt modtaget fra Dr. Ming Tsao af Ontario Cancer Institute (Toronto, Canada). Den L3.6pl cellelinje [24] blev venligt modtaget fra Dr. Isiah D. Fidler på The University of Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, TX). De Æske med HDPE og L3.6pl cellelinjer blev håndteret som andre cellelinjer og blev genotypebestemt ved DNA-fingeraftryk (PowerPlex 16, Promega, Inc.) i henhold til fabrikantens anvisninger. Den 293T cellelinje blev venligt modtaget fra Dr. J. Michael Thomson af The University of Georgia (Athens, GA). Vækstbetingelser cellelinjer blev udført som tidligere beskrevet [25].

MTT cytotoksicitetsanalyse Salg

Celler blev podet ved en densitet på 3 x 10

3 celler /brønd i en 96 brønds mikrotiterplade og dyrket til 90-95% konfluens. Efter behandling blev 50 pi MTT-opløsning (5 mg /ml i PBS) tilsat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet i 2 timer. MTT formazankrystaller blev opløst i 100 pl /brønd af DMSO ved rystning af pladerne på en vippende platform. En 96-brønds scanner blev anvendt til at måle den spektrofotometriske absorbans ved 490 nm. Absorbansen ved 650 nm blev anvendt til baggrund subtraktion. De 50% inhiberende koncentration (IC

50) blev bestemt ved anvendelse af GraphPad Prism 5.0-software.

Caspase 3 Assay

Apoptose blev målt ved anvendelse af Fluorimetrisk Caspase 3 Assay Kit fra Sigma-Aldrich ( katalog nr. CASP3F) i henhold til fabrikantens anvisninger. Kort fortalt 10

4 celler /brønd i en plade med 96 brønde blev behandlet med DZNep og /eller gemcitabin i 72 timer. Celler blev derefter lyseret, og inkuberet på is i 15-20 min. Efter tilsætning assaybuffer indeholdende Ac-DEVD-AMC-substrat blev prøver overført til en 96-brønds plade sort, og fluorescens blev aflæst hver 10 min i 1 time ved stuetemperatur (360 nm excitation, 460 nm emission). Den passende blank (reaktionsblandingen), positiv kontrol (caspase 3), og negativ kontrol (caspase 3+ caspase 3 inhibitor) blev også udført.

.

Drug interaktion Studies

kombinationen indeks grunde til DZNep og gemcitabin blev estimeret ved hjælp af den metode, der er udviklet af Chou og Talalay og CalcuSyn software [26].

nukleosid Optagelse i celler og

Xenopus

oocyter

Disse procedurer blev udført som beskrevet tidligere [27], [28].

generation af

Xenopus

oocyt ekspressionskonstrukter

De fuld længde IMAGE cDNA kloner af transportørerne (hENT1: klon ID 3.010.092, tiltrædelse BC008954; hENT2: klon ID 9.051.840, tiltrædelse BC143335; hCNT1: klon ID 8.991.920, tiltrædelsen BC 126.204; hCNT3: klon ID 7.939.668, tiltrædelse BC093823) blev opnået fra Open Biosystems (Huntsville, AL) . Subkloning af generne ind i

Xenopus

oocyt ekspressionsvektor, syfilis, blev afsluttet ved hjælp af primersættene udpeget i tabel 1.

Western Blotting

Western blotting var udført som tidligere beskrevet [25]. Kanin polyklonalt anti-histon H3K4TM, H3K9MM, H3K9DM, H3K27MM, H3K27DM, H4K20DM, og H4K20TM var fra Millipore (Billerica, MA), samt kanin polyklonalt anti-EED antistof. Også opnået fra Millipore var de monoklonale muse-anti-histon H3K9TM, H3K27TM, og H4K20MM antistoffer såvel som muse monoklonalt anti-EZH2 (klon BD43) og anti-SUZ12 (klon 3C1.2) antistoffer. De kanin polyklonale anti-JMJD1A og anti-JMJD2C antistoffer blev erhvervet fra Sigma-Aldrich. Det monoklonale muse-anti-β-actin antistof blev også købt fra Sigma-Alrich, og HRP-konjugerede sekundære antistoffer var fra Bethyl Laboratories (Montgomery, TX).

Syntese af Parent nukleosider og derivater

Troxacitabine og dets lipofile prodrug, som tidligere beskrevet (forbindelse 2K [29]; forbindelse 6h [30]; C

24H

41N

3O

5), blev opnået fra Dr. Chung K . Chu (University of Georgia). Syntesen af ​​en DZNep analog begyndte ud fra D-ribose. D-ribose blev behandlet med 2,2-dimethoxypropan i nærvær af en katalytisk mængde af

s

toluensulfonsyre til opnåelse af et isopropylidin derivat, efterfulgt af beskyttelse af den primære alkohol med triphenylmethylchlorid. Det beskyttede lactol blev derefter omsat med vinylmagnesiumbromid til at give en enkelt diastereomericdiol, som efterfølgende blev beskyttet med TBDMS kun på allyliske hydroxyl position til opnåelse silyldienol. Til at optage en anden dobbeltbinding for ringslutningsmetatese reaktionen blev den beskyttede sekundære alkohol oxideres til en keton ved Swern-oxidation, efterfulgt af en Wittig-reaktion med methyltriphenylphosphoniumbromid og n-BuLi at tilvejebringe dienen. Silylgruppen fra dienen blev fjernet med TBAF til opnåelse af en mindre sterisk krævende dienol, som derefter blev omdannet til cyclopentenol med en anden generation Grubbs-katalysator i godt udbytte. For at udføre Mitsunobu-kobling, bis-Boc-3-deaza-adenin blev fremstillet. Mitsunobu-kobling gav den ønskede N-9-isomeren som et hovedprodukt. Fjernelse af beskyttelse, der bruger 2 N-HCI i methanol produceret DZNep. Tre alkoholgrupper af DZNep blev beskyttet med TBS, som blev erstattet med de to amidprolægemidler (carbonkæder af C6 til C8) ved acylering af N

6-NH

2-gruppe. Forbindelsen blev endelig fuldt afbeskyttet af TBAF at give DZNep prodrug 1 (C

20H

29ClN

4O

4) og DZNep Prodrug 2 (C

18H

24N

4O

4). Synteserne procedurer og fysisk-kemiske karakteriseringer af forbindelserne vil blive offentliggjort andetsteds.

nanopartikelformulering

Alle kemikalier blev indkøbt fra Sigma-Aldrich og anvendt uden yderligere oprensning, medmindre andet er angivet. PLGA-COOH med en indre viskositet på 0,18 dl /g blev indkøbt fra Lactel. The (5-carboxypentyl) triphenylphosphonium (TPP) kation blev syntetiseret ifølge fremgangsmåder fra litteraturen [31]. HO-PEG-OH med en MW på 3.350 g /mol blev indkøbt fra Sigma-Aldrich. DSPE-PEG-COOH med en MW på 2.000 g /mol blev indkøbt fra Avanti Polar Lipids. Polyvinylalkohol (PVA) med en gennemsnitlig molekylvægt på 10,000-26,000 blev købt fra Alfa Aesar. Destilleret vand blev oprenset ved passage gennem en Millipore Milli-Q Biocel vandrensningssystem (18.2 MQ) med et 0,22 um filter. HPLC-analyser blev udført ved hjælp af en Agilent 1200-serien instrument. Størrelse og Zetapotential målinger blev udført på et Malvern Zetasizer Nanoseries instrument. Gelpermeationskromatografi (GPC) data blev indsamlet på en Shimadzu LC20-AD Prominence flydende chromatographer. Alle NMR-spektre blev registreret på et Varian 400 MHz NMR. TEM billeder blev taget på en Tecnai 20 FEM mikroskop. Ultralydbehandling blev udført på en Misonix S-4000 Ultrasonic flydende processor.

Syntese af PLGA-

b

-PEG-OH

Syntese af PLGA-PEG

b

-OH blev udført som tidligere beskrevet [32].

Syntese af PLGA-

b

-PEG-TPP

Syntese af PLGA-PEG

b

-TPP blev udført som tidligere beskrevet [32].

Syntese af gemcitabin Encapsulated Nanopartikler (perle-PLGA-

b

-PEG-OH-nationale parlamenter)

Gemcitabin (10 mg /ml i nanopure H

2O) blev emulgeret med PLGA-

b

-PEG-OH (5 mg i CH

2Cl

2) ved hjælp af sonde lydbehandling for én minut (Amplitude: 40% af 600 W effekt, Puls: 1 sek på, 1 sek slukket). Den primære emulsion blev emulgeret igen ved tilsætning af vand-i-olie-emulsion til 2 ml nanorent vand indeholdende 0,5% polyby 8 ml nanorent vand indeholdende 0,05% PVA og sonikeret under anvendelse af de ovennævnte betingelser. Organiske opløsningsmiddel blev fjernet ved vask tre gange under anvendelse af en Amicon filtreringsmembran med en 100 kDa cut-off. NPS blev resuspenderet i nanopure vand og opbevaret ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse. Dynamisk lysspredning (DLS) målinger blev udført for at bestemme størrelse, polydispergeringsindeks (PDI), og zetapotentialet af NPS. NP’er blev karakteriseret ved anvendelse af TEM ved en acceleration spænding på 200 kV. TEM blev fremstillet ved aflejring af 8 pi NPS (5 mg /ml) på en 200-mesh carbon-kobbernet. Prøver blev blottet væk efter 15 minutter og gitre blev negativt farvet med sterilt 2% (vægt /volumen) uranylacetat vandig opløsning i 15 minutter.

Syntese af DZNep Encapsulated Nanopartikler (DZNep-PLGA-

b

-PEG-OH-nationale parlamenter)

DZNep (10 mg /ml i nanopure H

2O) blev emulgeret med PLGA-

b

-PEG-OH (5 mg i CH

2Cl

2) ved hjælp af sonde lydbehandling i et minut (Amplitude 40% af 600 W effekt, Puls: 1 sek på, 1 sek slukket). Den primære emulsion blev emulgeret igen ved tilsætning af det ovenfor dannede vand-i-olie emulsion til 2 ml nanorent vand indeholdende 0,5% PVA og sonikeret under anvendelse af lignende betingelser. Endelig blev denne emulsion re-emulgeret under anvendelse 8 ml nanorent vand indeholdende 0,05% PVA under sonikering ved anvendelse af de tilsvarende betingelser som før. Organiske opløsningsmiddel blev fjernet ved vask tre gange under anvendelse af en Amicon filtreringsmembran med en 100 kDa cut-off. NPS blev resuspenderet i nanopure vand og opbevaret ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse. DLS målinger blev udført for at bestemme størrelse, polydispergeringsindeks (PDI), og zetapotentialet af NPS. Nationale parlamenter blev karakteriseret ved hjælp af TEM som nævnt ovenfor.

Syntese af gemcitabin og DZNep Encapsulated nationale parlamenter (perle-DZNep-PLGA-

b

-PEG-OH-nationale parlamenter)

Gemcitabin og DZNep coindkapslet PLGA-b-PEG-OH NP’er fulgte den nøjagtige procedure nævnt ovenfor undtagen det første trin, hvor DZNep (10 mg /ml i nanopure H

2O) og gemcitabin (10 mg /ml i nanopure H

2O) blev emulgeret med PLGA-PEG-OH (5 mg i CH

2Cl

2). Organiske opløsningsmiddel blev fjernet ved vask tre gange under anvendelse af en Amicon filtreringsmembran med en 100 kDa cut-off. NPS blev resuspenderet i nanopure vand og opbevaret ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse. DLS målinger blev udført for at bestemme størrelse, polydispergeringsindeks (PDI), og zetapotentialet af NPS. Nationale parlamenter blev karakteriseret ved hjælp af TEM som nævnt ovenfor.

Syntese af Controlled Release perle-DZNep-PLGA-

b

-PEG-TPP-nationale parlamenter

Gemcitabin (10 mg /ml i nanopure H

2O) blev emulgeret med PLGA-

b

-PEG-TPP (5 mg i CH

2Cl

2) ved hjælp af sonde lydbehandling i et minut (Amplitude: 40% af 600 W effekt, Puls: 1 sek på, 1 sek slukket). Den primære emulsion blev emulgeret igen ved tilsætning af vand-i-olie-emulsion til 2 ml nanorent vand indeholdende 0,5% PVA og sonikeret under anvendelse af lignende betingelser. Endelig denne emulsion blev emulgeret ved anvendelse af 8 ml nanorent vand indeholdende 0,05% PVA og DZNep (10 mg /ml i nanopure H

2O) under sonikering ved anvendelse af betingelser som nævnt ovenfor. Organiske opløsningsmiddel blev fjernet ved vask tre gange under anvendelse af en Amicon filtreringsmembran med en 100 kDa cut-off. NPS blev resuspenderet i nanopure vand og opbevaret ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse. DLS målinger blev udført for at bestemme størrelse, polydispergeringsindeks (PDI), og zetapotentialet af NPS. Nationale parlamenter blev karakteriseret ved hjælp af TEM som nævnt ovenfor.

Syntese af Controlled Release perle-DZNep-DSPE-PEG-OH-nationale parlamenter

Gemcitabin (10 mg /ml i nanopure H

2O) blev emulgeret med PLGA-b-PEG-OH (5 mg i CH

2Cl

2) ved anvendelse probesonikering i et minut (Amplitude: 40% af 600 W strøm, Pulse: 1 sek på, 1 sek slukket) . Den primære emulsion blev emulgeret igen ved tilsætning af vand-i-olie-emulsion til 2 ml nanorent vand indeholdende 0,5% PVA og sonikeret under anvendelse af de ovennævnte betingelser. Denne emulsion blev yderligere emulgeret under anvendelse af 8 ml nanorent vand indeholdende 0,05% PVA, 0,1% DSPE-PEG-COOH, og DZNep (10 mg /ml i nanopure H

2O) under sonikering under anvendelse af de samme betingelser som nævnt ovenfor. Organiske opløsningsmiddel blev fjernet ved vask tre gange under anvendelse af en Amicon filtreringsmembran med en 100 kDa cut-off. NPS blev resuspenderet i nanopure vand og opbevaret ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse. DLS målinger blev udført for at bestemme størrelse, polydispergeringsindeks (PDI), og zetapotentialet af NPS. Nationale parlamenter blev karakteriseret ved hjælp af TEM som nævnt ovenfor.

Brugte læssere og indkapsling Effektivitet af gemcitabin og DZNep i nationale parlamenter

Gemcitabin og DZNep lastning og indkapslingseffektivitet (EE) blev bestemt ved at opløse det polymere kerne i 0,1 M NaOH og kvantificering af mængden af ​​terapeutisk i NPS anvendelse af HPLC (mobil fase: acetonitril med 20% H

2O og 0,1% trifluoreddikesyre, Bølgelængde anvendt:. 270 nm

frigivelseskinetik Studier af DZNep /gemcitabin NPS Salg

NP’er blev anbragt i Slide-a-Lyzer® MINI dialyseenheder med en MW cutoff på 10.000 g /mol. prøver blev dialyseret mod 1 × PBS (6,0 L) i en konstant temperatur rysteapparat ved 37 ° . C og 35 rpm ved forskellige forudbestemte tidspunkter blev prøver fjernet og gemcitabin /DZNep-indholdet blev bestemt ved at opløse den polymere kerne i 0,1 mmol NaOH og kvantificere ved HPLC-analyse (mobil fase: acetonitril med 20% H

2O og 0,1% trifluoreddikesyre, Bølgelængde anvendt: 270 nm)

statistiske Analyser

for tilfælde, hvor kun to betingelser blev sammenlignet, blev student t-test bruges til at identificere signifikante forskelle.. I tilfælde, hvor tre eller flere betingelser blev sammenlignet, var envejs ANOVA der gennemføres i efterfulgt af Tukey Multiple Sammenligning Test. Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange. Medmindre andet er angivet,

s

0,05 og

s

. 0,01 sammenlignet med kontrol betingelser er repræsenteret ved et og to stjerner henholdsvis

Resultater

DZNep selektivt øger Gemcitabin cytotoksicitet i kræft men ikke Normal pancreasceller

Vi begyndte ved at studere cytotoksicitet DZNep på normale og kræft i bugspytkirtlen cellelinjer. Behandling med stigende koncentrationer af DZNep (0,1 nM-100 uM) viste en signifikant reduktion i cellulær levedygtighed i alle seks pancreascancer testede cellelinjer (dvs. BxPC-3, Capan-1, L3.6pl, AsPC-1, MIA PaCa- 2, PANC-1) (fig. 1A). iagttoges cytotoksicitet starter ved ca. 0,5-1 uM DZNep, afhængigt af cellelinjen, og øges gradvist med højere koncentrationer derefter. Cytotoksicitet begyndte først ~48 h behandling (data ikke vist). Maksimal reduktion i cellelevedygtighed (-50% reduktion med 10 pM DZNep i 72 timer) blev observeret i dårligt differentierede MIA PaCa-2, som kun er marginalt gemcitabin-følsom (fig. 1A). I subsammenflydende celler blev virkningen af ​​DZNep på MIA PaCa-2 var næsten svarer til den i gemcitabin (fig. 1C). DZNep viste meget lavere cytotoksicitet i godt differentierede, gemcitabin følsomme bugspytkirtelkræft cellelinjer (dvs. BxPC-3, Capan-1, L3.6pl) sammenlignet med gemcitabin (Fig. 1C). At bemærke, sås ingen signifikante ændringer i proliferationen og cellulær levedygtighed normal human pancreas ductal epitel (Æske med HDPE) -celler (op til 10 uM DZNep i 72 timer), som er yderst gemcitabin-følsomme, samt to andre normale cellelinier ( 293T (human embryonisk nyre) og MCF-10A (human bryst epitel)) (fig. 1A-B, S1). Disse resultater viser, at DZNep selektivt formidler cytotoksiske effekter til (dårligt differentierede) bugspytkirtelkræftceller uden væsentlig forringelse af proliferation i normale pancreas epitelceller.

A. Alle kræft cellelinier undtagen den normale HDPE er DZNep-responsiv og reduceret cellulær levedygtighed. B. DZNep og gemcitabin viste antagonistiske virkninger i HDPE. C. DZNep og gemcitabin viste additive eller synergistiske virkninger i mange af de cancerøse pancreatiske cellelinjer. Fireogtyve timer efter 3 × 10

3 celler /brønd blev podet i en 96-brønds plade blev celler behandlet med enten DZNep, gemcitabin, eller en kombination af begge ved et ækvimolært forhold i 72 timer. Cellulær levedygtighed blev målt ved anvendelse af et MTT-assay. Cytotoksisk IC

50 værdier er angivet. Betydninger mellem gemcitabin og DZNep samt DZNep + gemcitabin og DZNep blev identificeret ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey post-hoc test. Kombination index (CI) plots (mellemværker) viser samspillet mellem de to lægemidler. CI 1, antagonisme; CI = 1, additivitet; CI 1, synergisme. Søjlediagrammer til højre angiver den relative caspase-3-aktivitet (RCA) af hver behandling som målt ved fluorescensintensitet. Værdier var baggrundssubtraktion og præsenteres som fold-ændring fra kontrollen. Signifikans mellem et enkelt lægemiddel versus lægemiddelkombinationen blev identificeret via envejs ANOVA efterfulgt af Tukey post-hoc-analyse. Cellerne blev behandlet med 1 pM DZNep, 100 nM gemcitabin, eller begge dele.

Barer

, SD.

n

= 3. *

s

0,05, **

s

. 0,01

Opmuntret af den potentielle evne DZNep at kompensere for nukleosidanalog ildfasthed i pancreascancer, vi co-behandlede celler med DZNep og gemcitabin i ækvimolære forhold og sammenlignet de cellulære levedygtigheder med dem, der opnås, når celler blev behandlet med enten DZNep eller gemcitabin alene. Interessant nok viste co-behandling signifikant højere reduktioner i cellulære levedygtigheder af de fleste gemcitabin-sensitive og -insensitive kræftceller end når forbindelserne blev anvendt som enkeltstående midler (fig. 1C). Omvendt er co-behandling reducerede cytotoksicitet ( 2-fold ved 100 nM koncentration) i HPDE (Fig 1B.), Hvilket tyder på en cytobeskyttende rolle DZNep kun på normale celler

Vi estimeret kombinationen indeks (. CI) plots [26] for at identificere den type interaktion mellem DZNep og gemcitabin. Disse skøn identificeret en synergistisk eller additiv vekselvirkning mellem DZNep og gemcitabin (100 nM-10 pM) i alle bugspytkirtelkræft cellelinjer med den eneste undtagelse af AsPC-1, samt en skarp antagonistisk interaktion i normal HDPE (Fig. 1C). Samtidig behandling af DZNep (1 nM-10 uM) med forskellige gemcitabin koncentrationer (1-100 nM) viste, at DZNep potenserer cytotoksicitet i et gemcitabin dosisafhængig måde i marginalt gemcitabin-sensitive MIA PaCa-2, mens en sådan potensering forekom i en overvejende gemcitabin dosis-uafhængig måde i meget gemcitabin følsomme Capan-1-celler (fig. S2). HPDE forblev cytotoksiske for gemcitabin, bekræfter antagonisme mellem de to forbindelser (fig. S2). Yderligere interaktionsanalyse med forskellige forhold mellem gemcitabin: DZNep (01:01, 01:04, 04:01, 01:10, 10:01) identificerede en maksimalt synergistisk og cytotoksisk reaktion i MIA PaCa-2 ved hjælp forholdet 1:10 ( fig. S3). Endelig, for at forstå mekanismen af ​​reduktionen i cellulær levedygtighed gennemførte vi caspase-3 baseret apoptoseassays. Disse resultater (Fig. 1C) identificeret en betydelig induktion af apoptose som en væsentlig medvirkende mekanisme til DZNep-inducerede stigning i gemcitabin cytotoksicitet (Fig. 1C).

Nukleosid Transporter Lette Cellular Indtastning af DZNep

Da DZNep er et hydrofilt nukleosidanalog med en log P -1,38 [5], vi hypotese, at den træder i celler vil afhænge af ekspressionen af ​​nukleosid transportører, og derfor ville manglen på tilstrækkelig luftfartsselskab udtryk begrænse dens cellulære aktivitet. For at teste dette, vi udført en konkurrencedygtig analyse ved at vurdere niveauet af hæmning i den cellulære transport af nukleosider med DZNep. Vi valgte PANC-1 og MIA PaCa-2-cellelinjer for disse studier, fordi de er blevet indberettet for at udtrykke flere nukleosid transportører [33]. Transport analyse identificeret en signifikant inhibering af

3H-adenosin og

3H-guanosin (puriner) transport, men ikke

3H-thymidin (pyrimidin) (fig. 2A). Gemcitabin transport i begge celletyper blev kun inhiberet ved en højere koncentration (200 uM) (fig. 2A). Disse data antyder, at DZNep cellulære indstrømning lettes af purin, men ikke pyrimidin, nukleosid transportører.

A. DZNep hindrede optagelsen af ​​radioaktivt mærkede purinnukleosider i PANC-1 og MIA PaCa-2. Fireogtyve timer efter 5 × 10

4 celler /brønd blev podet i en 24-brønds plade blev celler lov til optagelse den angivne radiomærket nucleosid i nærværelse af DZNep eller dets respektive umærket nukleosid. B. Hæmning af adenosin transport i

Xenopus

oocytter med DZNep. C. Farmakologisk hæmning af hENT1 og overskydende uridin faldt cytotoksiciteten af ​​DZNep i MIA PaCa-2. Fireogtyve timer efter 3 × 10

3 celler /brønd blev podet i en 96-brønds plade blev celler behandlet med stigende koncentrationer af DZNep i nærværelse af DMSO (kontrol), 10 uM NBMPR, eller 200 pM uridin. Cellulær levedygtighed blev målt ved anvendelse af et MTT-assay. IC

50 værdier er angivet. Signifikante forskelle mellem kontrol- og hver behandling blev bestemt under anvendelse af Students t-test.

Barer

, SD.

n

= 3. *

s

0,05, **

s

. 0,01

For yderligere at karakterisere identitet purin nukleosid transportører medierer DZNep tilstrømning, vi undersøgte evne DZNep at hæmme

3H-adenosin transport i

Xenopus

oocytter der udtrykker individuelle transportører. En signifikant inhibering af hENT1- og hCNT3-medieret

3H-adenosin transport blev observeret, hvorimod en signifikant inhibering af hCNT2-medieret

3H-adenosin transport blev bemærket kun ved koncentrationen højere (200 pM) (fig. 2B ). Ingen signifikant reduktion i adenosin transport med DZNep blev observeret i hENT2 udtrykker oocytter.

Dernæst at undersøge virkningen af ​​hENT1 og hCNT3 på DZNep cytotoksicitet i bugspytkirtelkræftceller undersøgte vi udbredelsen af ​​MIA PaCa- 2 i nærvær af en farmakologisk inhibitor af hENT1 (10 nM NBMPR) eller overskydende uridin (200 uM) som kompetitivt inhiberer alle ents og CNTs. Vores resultater viser, at begge betingelser kan reducere DZNep cytotoksicitet af MIA PaCa-2, som vurderet ved stigninger i cytotoksisk IC

50 estimater (2-8 gange) (fig. 2C).

Acyl Derivatisering af DZNep øger Sensibilisering af pancreasceller til Gemcitabin

Siden DZNep mindste delvist udnytter transportører for at udøve sit fulde potentiale, er det sandsynligt, at transporter-mangel patienter kan reagere dårligt på DZNep. For at omgå dette problem, genereret vi polære acylderivater af DZNep (fig. 3A) ved hjælp af en syntetisk fremgangsmåde beskrevet i

Materialer og fremgangsmåder

. Vi erstattet DZNep på N

6-NH

2-gruppe med acyl sidekæder til at generere to lipofile prodrugs (Prodrug 1: C

20H

29ClN

4O

4 prodrug 2 : C

18H

24N

4O

4). De syntetiserede prolægemidler blev bedømt for deres anti-proliferative aktiviteter, både alene og i kombination med gemcitabin, i en normal (HDPE), gemcitabin-sensitive (Capan-1), og gemcitabin-resistente (MIA PaCa-2) cellelinie.