PLoS ONE: Rapamycin Hæmmer IGF-1-medieret opregulering af MDM2 og sensibiliserer Cancer Cells til Chemotherapy

Abstrakt

Muse Double Minute 2 (MDM2) protein er en vigtig regulator af celleproliferation og apoptose, der virker primært ved at hæmme p53 tumor suppressor. Tilsvarende PI3-kinase (PI3K) /AKT pathway er kritisk for vækstfaktor-medieret celleoverlevelse. Derudover er det blevet rapporteret, at AKT direkte kan phosphorylere og aktivere MDM2. I denne undersøgelse viser vi, at IGF-1 opregulerer MDM2 proteinniveauer i en PI3K /AKT-afhængig måde. Hæmning af mTOR ved rapamycin eller ekspression af en dominant negativ eukaryot initieringsfaktor 4E bindende protein 1 (4EBP1) mutantprotein, samt ablation af eukaryot initieringsfaktor 4E (eIF4E), effektivt ophæver IGF-1-medieret opregulering af MDM2. Desuden viser vi, at rapamycin effektivt hæmmer MDM2 udtryk og sensibiliserer kræftceller til kemoterapi. Tilsammen har dette studie afslører en hidtil ukendt mekanisme, ved hvilken IGF-1 aktiverer MDM2 via mTOR pathway, og at farmakologisk inhibering af mTOR kombineret med kemoterapi kan være mere effektive i behandling af en undergruppe af cancere huser øget aktivering MDM2.

Henvisning: Du W, Yi Y, Zhang H, Bergholz J, Wu, J., Ying H, et al. (2013) Rapamycin inhiberer IGF-1-medieret opregulering af MDM2 og sensibiliserer cancerceller for kemoterapi. PLoS ONE 8 (4): e63179. doi: 10,1371 /journal.pone.0063179

Redaktør: Zhi-Min Yuan, University of Texas Health Science Center på San Antonio /Greehey CCRI, USA

Modtaget: 16 November, 2012; Accepteret: 29 2013; Udgivet: 30 april, 2013 |

Copyright: © 2013 Du et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud (CA79804) og af National Key Basic Research Program (973 Program) Kina (2012CB910700) til ZX, og USA Department of Defense Congressionally Directed Medical Research Programs tilskud (W81XWH-10 -1-0161) til JB. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Unormal aktivering af murine Dobbelt Minute 2 (MDM2) er blevet etableret som en vigtig årsagsfaktor i udviklingen af ​​menneskelige cancer. MDM2 fungerer som en ubiquitin E3 ligase at lette nedbrydning af p53, en central regulator for celleproliferation, apoptose og begyndende alderdom som reaktion på cellulære belastninger, såsom DNA-beskadigelse og oncogen stress [1]. Amplifikation af

MDM2

gen er blevet observeret i en række humane tumorer og cancere, herunder tumorer i blødt væv, osteosarcom, og esophageal carcinoma [2]. Især MDM2 er blevet vist at besidde p53-uafhængig onkogene funktioner [3], [4]. Arbejde fra os og andre har vist, at MDM2 kan målrette og hæmme retinoblastoma protein (Rb) via proteasom-medieret nedbrydning [5], [6], [7], [8], [9]. MDM2 er også blevet vist at danne kompleks med og regulere proteinstabilitet og /eller aktiviteten af ​​en undergruppe af proteiner involveret i celleproliferation og celledød, herunder p73 [10], [11], E2F1 [12], cyclin-afhængig kinase inhibitor p21 [13], beta-arrestin, og G-protein-koblet receptor-kinase 2 (GRK2) [14], [15].

det er blevet vist, at MDM2 protein subcellulære lokalisering og funktioner moduleres af PI3 -Kinase (PI3K) /AKT pathway. AKT kan direkte phosphorylere MDM2 på Ser166 og Ser188, hvilket vil lette nuklear translokation [16] og p53 nedbrydning, samt p300 interaktion [17], [18]. Desuden har overekspression af AKT blevet vist at stabilisere MDM2 protein [19]. Senest har AKT opstået som en kritisk regulator af pattedyr mål for rapamycin kompleks en (mTORC1). AKT inhiberer TSC2 /TSC1 kompleks, hvilket fører til aktivering af mTORC1 [20]. Vigtigere, nye beviser tyder på, at mTORC1 aktivitet er afgørende for AKT onkogen funktion. Faktisk accelereres tumorvækst ved konstitutiv aktivering af AKT vendes ved inhibering af mTOR [21]. Tilsvarende mus, der udtrykker human Akt1 i prostata udvikle en neoplastisk fænotype, som er helt ophævet ved inhibering af mTOR [22]. Endvidere inaktivering af AKT fører til hæmning af celleproliferation, som er afhængig af mTORC1 [23]. Disse undersøgelser antyder, at AKT-mTOR pathway er afgørende for tumorcellevækst.

I denne undersøgelse viser vi, at insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF-1) opregulerer MDM2 ekspression gennem AKT-mTOR pathway. Hæmning af mTOR af rapamycin, ekspression af en dominant negativ eukaryot initieringsfaktor 4E bindende protein 1 (4EBP1) mutant eller dæmpning af eukaryot initieringsfaktor 4E (eIF4E) effektivt ophæver IGF-1-medieret opregulering af MDM2. Desuden viser vi, at rapamycin effektivt hæmmer MDM2 udtryk og sensibiliserer kræftceller til kemoterapeutisk lægemiddel-induceret apoptose.

Resultater

IGF-1 inducerer MDM2 Expression i en PI3K-afhængig måde og ikke Alter MDM2 proteinstabilitet eller Steady-state mRNA niveauer

Vi har tidligere vist, at IGF-1 modulerer cyclin-afhængige kinase inhibitor p21 at påvirke celleoverlevelse efter genotoksisk stress [24]. Da IGF-1 er kendt for at aktivere PI3K /AKT pathway, var vi interesserede i at dechifrere rolle PI3K /AKT i IGF-1-medieret celleoverlevelse. Som vist i figur 1A, klart IGF-1 behandling af serum-udsultede humant osteosarcom U2-OS-celler (p53 vildtype) førte til AKT aktivering, som vist ved en stigning i AKT phosphorylering. Navnlig IGF-1-induceret MDM2 protein ekspression, som vist ved en forøgelse af både MDM2 proteinbånd påvises ved en MDM2-specifikt antistof, SMP14, overensstemmelse med tidligere rapporter [6], [9], [25]. Denne virkning af IGF-1 på MDM2 blev effektivt blokeret ved behandling med LY294002, en selektiv PI3K inhibitor [26], men ikke af PD98059, en inhibitor af MAP-kinase-kinase (MEK) eller ved SB203580, en specifik inhibitor af p38 stress- aktiveret proteinkinase [27]. Disse data antyder, at IGF-1 opregulerer MDM2 proteinekspression gennem PI3K-AKT signaleringskaskade.

(A) U2-OS-celler blev serum-udsultet i 24 timer og derefter forbehandlede med enten PI3- kinase (PI3K) inhibitor LY294002 (20 uM), MAP kinase kinase (MEK) inhibitor PD98059 (25 uM) eller p38 stress-aktiveret protein kinase inhibitor SB202190 (10 uM) i fire timer efterfulgt af behandling med IGF-1 (50 ng /ml) i seks timer. Cellerne blev lyseret og underkastet western blot-analyse. (B) H1299-celler blev serumudsultet ved inkubering i fravær af FBS i 24 timer og behandlet med IGF-1 i seks timer som angivet. Cellelysater blev underkastet western blot-analyse. S: Kort eksponering; L:. Lang eksponering

Da vi tidligere har vist, at IGF-1 kan aktivere p53, og MDM2 er en direkte downstream p53 mål [24], spurgte vi, om effekten af ​​IGF-1 på ekspression af MDM2 er afhængig af p53. Vi behandlede p53-nul human ikke-småcellet lungekræft H1299-celler med IGF-1. IGF-1 var alligevel i stand til at inducere MDM2 proteinekspression i H1299-celler på en dosis-afhængig måde (figur 1B), hvilket indikerer, at IGF-1-medieret opregulering af MDM2 er uafhængig af p53.

Dernæst vi undersøgte, om IGF-1 opregulerer MDM2 protein niveauer ved at øge sin protein stabilitet. Som forventet, IGF-1 forhøjet MDM2 proteinekspression (figur 2A). Men IGF-1-behandling ikke signifikant ændrer MDM2 protein halveringstid, som bestemt ved behandling med proteinet biosynteseinhibitor cycloheximid (figur 2A og 2B) og ved pulse-chase-eksperimenter (figur 2C og 2D). Vi derefter undersøgt, om IGF-1 inducerer MDM2 ved at øge dens mRNA-niveauer. viste imidlertid, kvantitativ PCR (Q-PCR) analyse, at MDM2 mRNA-niveauer ikke var væsentligt påvirket af IGF-1 behandling (figur 2E), hvilket indikerer, at IGF-1 ikke påvirker steady-state mRNA niveauer.

( A) U2-OS-celler blev serum-udsultet i 24 timer før behandling med IGF-1 (50 ng /ml) i seks timer. Celler blev derefter behandlet med 50 ug /ml cycloheximid (CHX) i nærvær eller fravær af IGF-1 og opsamlet på de angivne tidspunkter. Cellelysater blev underkastet western blot-analyse for MDM2 og actin. (B) Kvantitative analyser af MDM2 proteinniveauer fra celler behandlet med CHX blev udført ved densitometriscanning for hver enkelt MDM2-proteinbånd og den tilsvarende actin protein band. Forholdet mellem MDM2 løbet actin på Nultidspunktet blev arbitrært sat som 100 procent. Tre uafhængige forsøg blev udført med lignende resultater. (C) U2-OS-celler blev behandlet med IGF-1 (50 ng /ml) i seks timer og metabolisk mærket med

35S-methionin i fyrre minutter, og derefter afdrevet med kold methionin. Cellelysater med lige store mængder af radioaktivitet blev immunfældet med SMP14 antistof mod MDM2. Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og visualiseret ved autoradiografi. (D) Kvantitativ analyse blev udført ved densitometri scanning ved hjælp ImageQuant software. (E) Serum-udsultede U2-OS-celler blev behandlet med IGF-1 (50 ng /ml) i seks timer. MDM2 genekspression blev bestemt ved kvantitativ-PCR (Q-PCR) og normaliseret til GAPDH-ekspression. Data præsenteret som midler og SE for to uafhængige forsøg udført i to eksemplarer.

Hæmning af mTOR af rapamycin Blocks IGF-1- og Heregulin-medierede opregulering af MDM2

AKT har vist sig at være en vigtig regulator af mTORC1 aktivitet. Således har vi undersøgt, om mTOR pathway’en spiller en rolle i IGF-1-medieret opregulering af MDM2. Til dette formål har vi serumudsultet og derefter forbehandlet U2-OS-celler med rapamycin, en selektiv inhibitor for mTOR [28], forud for IGF-1-behandling. Som forventet rapamycin blokerede phosphorylering af det ribosomale protein S6 (figur 3A). Især rapamycin også blokerede IGF-1-induceret MDM2 opregulering (figur 3A). Lignende resultater blev observeret i H1299-celler, i hvilke rapamycin ophævede IGF-1-induceret MDM2 opregulering og phosphorylering af 4EBP1 (figur 3B). Endvidere ekspression af konstitutivt aktive AKT (myristinsyre-AKT) førte til en stigning af MDM2 proteinniveauer, som blev fuldstændig blokeret i nærvær af rapamycin (figur 3C). Tilsammen disse data støtter stærkt den opfattelse, at en rapamycin-følsom vej er kritisk for opregulering af MDM2 via IGF-1 /PI3K /AKT-signalering.

U2-OS (A) eller H1299 (B) celler blev serumudsultet og forbehandlet med rapamycin (50 nM) i fire timer, og derefter behandlet med IGF-1 (50 ng /ml) i seks timer. Cellerne blev lyseret og underkastet western blot-analyse. Kvantitative analyser af MDM2 proteinniveauer blev udført ved densitometriscanning for hver enkelt MDM2-proteinbånd og den tilsvarende actin protein band. Forholdet mellem MDM2 løbet actin i kontrolprøven blev arbitrært sat som 1,0. (C) U2-OS-celler blev inficeret med rekombinant adenovirus der koder for GFP eller myristinsyre-AKT i 24 timer før behandling med rapamycin (100 nM) i fire timer. Cellelysater blev udsat for western blot analyse.

Siden Heregulin kan aktivere AKT, vi spurgte, om denne ligand kunne opregulere MDM2 i en mTOR-afhængig måde. MCF-7-celler eller H1299-celler blev serumudsultet før behandling med rapamycin, og derefter behandlet med heregulin-beta (HRG). Som vist på figur 4A, aktivering af AKT signalering ved HRG effektivt induceret MDM2 protein ekspression, som blev fuldstændig blokeret af rapamycin i både MCF-7 og H1299 celler (figur 4A og 4B). Derudover PI3K-inhibitoren LY294002 inhiberede effektivt virkningen af ​​HRG på opregulering af MDM2 (figur 4B), hvilket indikerer, at Heregulin-medieret opregulering af MDM2 er afhængig af PI3K. Tilsammen indikerer disse data, at en rapamycin-sensitive pathway er nødvendig for opregulering af MDM2 af IGF-1 eller heregulin signalveje.

(A) MCF-7-celler blev serumudsultet og forbehandlet med rapamycin (50 nM) i fire timer og derefter behandlet med Heregulin-beta (HRG; 25 ng /ml) i 24 timer. Cellerne blev lyseret og underkastet western blot-analyse. (B) Serum-udsultede H1299-celler blev forbehandlet med rapamycin (50 nM) eller LY294002 (20 uM) i fire timer, og derefter behandlet med Heregulin-beta (25 ng /ml) i 24 timer. Cellelysater blev underkastet western blot-analyse.

Ekspression af en mutant 4EBP1 Defekt i mTOR Phosphorylering Dæmper IGF-1-medieret opregulering af MDM2

Derefter bestemte vi, om eIF4E, en større nedstrøms mål for mTOR, er involveret i IGF-1-medieret opregulering af MDM2. Da mTOR phosphorylerer 4EBP1, hvilket resulterer i dissociation fra eIF4E og fører til dannelsen af ​​translation initiation komplekset [29], anvendte vi mutant 4EBP1-5A, som mangler de fem Ser /Thr phosphoryleringssteder er omfattet af mTOR og virker således som en dominerende negativ inhibitor ved binding elF4E at forhindre translationsinitiering [30]. Til dette formål blev H1299-celler transient transficeret med enten vildtype 4EBP1 eller 4EBP1-5A, efterfulgt af serum sult og IGF-1 behandling. Som vist i figur 5A, IGF-1 behandling ført til en kraftig stigning i fosforylering af AKT, S6 og 4EBP1, korreleret med en markant stigning i MDM2 udtryk. Især ekspression af vildtype 4EBP1 ændrede ikke signifikant virkningen af ​​IGF-1 på MDM2 ekspression, sandsynligvis på grund af effektiv phosphorylering af 4EBP1 i H1299-celler. Men IGF-1-medieret, MDM2 opregulering blev signifikant inhiberet af ektopisk ekspression af 4EBP1-5A. Dernæst for at undersøge den rolle, eIF4E direkte, vi ablateret endogen eIF4E benytter små interfererende RNA (siRNA) i U2-OS-celler. Mens tavshed eIF4E ikke afgørende påvirket basal MDM2 udtryk (figur 5B), knockdown af eIF4E helt ophævet effekten af ​​IGF-1 på stigende MDM2 niveauer, trods tydelig 4EBP1 fosforylering (figur 5C).

(A) H1299 celler blev transient transficeret med vildtype-4EBP1, 4EBP1-5A eller vektor plasmid. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne delt og opretholdt i yderligere 24 timer før serumudsultning i 24 timer. Celler blev derefter behandlet med eller uden IGF-1 (50 ng /ml) i seks timer. Cellerne blev lyseret og underkastet western blotting. Kvantitative analyser af MDM2 proteinniveauer blev udført ved densitometriscanning for hver enkelt MDM2-proteinbånd og den tilsvarende actin protein band. Forholdet mellem MDM2 løbet actin i kontrolprøven (bane 1) blev arbitrært sat som 1,0. (B) U2-OS-celler blev transient transficeret med siRNA specifikt mod eIF4E (si4E) eller et kodet kontrol (siScr). Cellelysater blev underkastet western blotting, som vist. (C) U2-OS-celler transficeret med si4E eller siScr var serum-udsultet i 24 timer før behandling med eller uden 5 ng /ml IGF-1 i seks timer. Cellelysater blev underkastet western blotting, som vist. (D) U2-OS-celler blev transient transficeret med siRNA specifikt mod S6K (siS6K) eller en kodet siRNA (siScr). Cellelysater blev underkastet western blotting, som vist. (E) U2-OS-celler transficeret med siS6K eller siScr var serum-udsultet i 24 timer før behandling med eller uden 5 ng /ml IGF-1 i seks timer. Cellelysater blev underkastet western blotting, som vist.

Foruden phosphorylering og inhibering 4EBP1, mTOR phosphorylerer og aktiverer ribosomale protein S6 kinase (S6K), som igen phosphorylerer og aktiverer ribosomale protein S6 i tilpligtes at forbedre proteintranslation. Således har vi ablateret S6K af siRNA i U2-OS-celler. Som vist i figur 5D og 5E, vi observerede lignende virkninger som eIF4E knockdown, hvilket indikerer IGF-1-medieret MDM2 opregulering kræver mTOR signalering, som involverer både de eIF4E og S6K veje.

Rapamycin Behandling Reducerer MDM2 Expression og sensibiliserer cancerceller for doxorubicin- induceret apoptose

Da MDM2 er en vigtig negativ regulator af p53, hvilket er afgørende for DNA-beskadigelse-induceret apoptose, undersøgte vi virkningen af ​​rapamycin på doxorubicin-induceret apoptose i p53-positive cancerceller. Vi valgte MCF-7 brystcancerceller, fordi de huser en somatisk mutation i PIK3CA gen, der bibringer en grundlæggende aktiv AKT-mTOR pathway [31]. MCF-7-celler blev forbehandlet med rapamycin, efterfulgt af behandling med en lav dosis af doxorubicin. Cellelevedygtighed blev vurderet ved trypan-blå-udelukkelse assay og western blot-analyse for spaltning af poly ADP-ribose polymerase (PARP), en biokemisk markør for apoptose. Under disse betingelser, hverken rapamycin eller doxorubicin alene signifikant induceret apoptose. Men i nærværelse af rapamycin, doxorubicin effektivt induceret celledød (figur 6A). Især rapamycin blokerede fuldstændigt opregulering af MDM2, men ikke af p53 (figur 6B). Lignende fænomener blev observeret i humant osteosarcom SJSA-1-celler, der huser MDM2 amplifikation [25] (figur 6C og 6D). Sammen antyder disse data, at rapamycin undertrykker MDM2 proteinekspression, hvilket resulterer i sensibilisering af cancerceller til doxorubicin-induceret celledød.

(A-B) MCF-7-celler blev holdt i normalt vækstmedium, forbehandlet med rapamycin (100 nM) i 48 timer og derefter behandlet med doxorubicin (0,6 ug /ml) i 24 timer. Både flydende og adhærerende celler blev opsamlet og udsat for trypanblåt udelukkelse assay (A) og Western blot-analyse (B). Cellelevedygtighed præsenteret som en procentdel af levende celler på den samlede talte celler. Data præsenteret som midler og SE af tre uafhængige forsøg udført in triplo. (C) SJSA-1-celler blev opretholdt i normal dyrkningsmedium, forbehandlet med rapamycin (100 nM) i 48 timer og derefter behandlet med doxorubicin (1 ug /ml) i 36 timer. Både flydende og adhærerende celler blev opsamlet og underkastet western blot-analyse. (D) morfologi SJSA-1 celler blev indspillet af fasekontrast mikroskopi (100 ×).

Vi undersøgte næste hvorvidt nedregulering af MDM2 spiller en forårsagende rolle i sensibilisering af celler til doxorubicin ved rapamycin behandling. Vi behandlede U2-OS-celler med rapamycin og doxorubicin enten i nærvær eller fravær af ektopisk ekspression af MDM2. Som vist i figur 7A, MDM2 ekspression dramatisk vendt spaltede PARP niveauer, sammenlignet med celler, der udtrykker en vektorkontrol. Især MDM2 ekspression reduceret p53 proteinniveauer, samt Ser15 phosphorylering på p53. Desuden MDM2 ekspression effektivt reddet celledød induceret af rapamycin plus doxorubicin kombinationsbehandling (figur 7B og 7C). Disse data indikerer, at inhibering af MDM2 opregulering af rapamycin er hovedansvarlige for sensibiliserende celler for kemoterapeutiske behandling.

(A-B) U2-OS-celler blev transient transficeret med MDM2 eller en vektorkontrol. Fireogtyve timer efter transfektionerne celler blev forbehandlet med rapamycin (100 nM) i 48 timer og derefter behandlet med doxorubicin (1 ug /ml) i 36 timer. Både flydende og adhærerende celler blev opsamlet og underkastet western blotting (A) eller flowcytometri analyse (B). (C) morfologi U2-OS-celler blev indspillet af fasekontrast mikroskopi (100 ×).

Diskussion

I denne undersøgelse har vi påvist, at IGF-1 opregulerer MDM2 protein niveauer via mTOR pathway, således at tilføje endnu et lag af fine regulering til MDM2-p53 pathway af IGF-1 /AKT signaleringskaskade. AKT er tidligere blevet vist at interagere fysisk med og phosphorylerer MDM2, hvilket letter MDM2 nuklear translokation [16]. Phosphorylering af MDM2 forbedrer MDM2 samspil med p300, hvilket øger ubiquitin E3-ligaseaktivitet mod p53 og lette p53 ubiquitinering og nedbrydning [17]. Desuden har phosphorylering af MDM2 på Ser166 og Ser188 ved AKT blevet vist at stabilisere MDM2-protein ved at inhibere dens self-ubiquitinering [19]. Det blev dog også rapporteret, at AKT-medieret phosphorylering af MDM2 ikke synes at dramatisk påvirke MDM2 subcellulære lokalisering [18]. Selv om det er klart, at AKT positivt regulerer MDM2, de præcise molekylære mekanismer synes at være celle type- og kontekstafhængig.

Tidligere undersøgelser tyder på, at MDM2 kan reguleres på translationel niveau. Forbedret oversættelse af MDM2 er blevet observeret i humane choriocarcinoma cellelinjer [32]. MDM2-mRNA indeholder et særskilt 5′-utranslaterede region (UTR), som spiller en rolle i translationseffektivitet [33]. Derudover steg MDM2 ekspression induceret af BCR /ABL ekspression er associeret med øget MDM2 oversættelse grund regulering ved 5 ‘UTR af MDM2-mRNA [34]. Desuden hæmning af IGF-1-signalering, enten ved knockout af IGF-1-receptor (IGF-1R) eller ved en IGF-1R kinase inhibitor, er blevet vist at nedsætte MDM2 oversættelse medieret via dets 5’-UTR [35]. Især er det blevet rapporteret, at hepatocytvækstfaktor (HGF) letter MDM2 oversættelse via mTOR i embryoniske hepatocytter [36].

I denne undersøgelse viser vi, at både IGF-1 og heregulin signalering aktivere MDM2 gennem AKT -mTOR pathway. Denne undersøgelse har to vigtige konsekvenser. Første, cellulære reaktioner på forskellige belastninger konvergere på p53-MDM2 pathway, der tjener som den centrale sensor for stress. For det andet er der to vigtige regulatoriske mekanismer til modulerer MDM2 protein niveauer: p53-afhængig transkriptionel regulering og mTOR-afhængig translationel kontrol. Stresssignaler, herunder DNA-skade, hypoxi, næringsberøvelse og oxidativ stress, aktiverer p53, hvilket igen transkriptionelt opregulerer MDM2 ekspression. Vækstfaktorsignalering, på den anden side, aktiverer AKT-mTOR pathway at forbedre MDM2 proteintranslation. Denne fine regulering af MDM2 sikrer, at p53 er under tæt kontrol. Desuden vores data viser, at eIF4E eller S6K ablation ikke i væsentlig grad påvirker MDM2 basale niveauer. Men nedregulering af enten eIF4E eller S6K helt afskaffet IGF-1-induceret MDM2 opregulering. Disse resultater indikerer, at mTOR pathway er nødvendig for vækstfaktor-medieret MDM2 opregulering.

Inhibering af mTOR under anvendelse af specifikke farmakologiske hæmmere resulterer i G1 /S cellecyklusstandsning, dæmpning af cellevækst, og apoptose [37 ]. Prækliniske undersøgelser viser, at rapamycin og dets derivater hæmme kræft cellevækst og spredning, som har vist sig både

in vitro

og i en række humane kræftformer med dyremodeller [38]. Desuden blev det rapporteret, at inhibering af mTOR fremmer apoptose gennem translationel kontrol med Mcl-1, en bcl-2 som familiemedlem [39]. Men i de fleste tilfælde, inhibering af mTOR alene ikke effektivt inducerer apoptose; snarere, det sensibiliserer celler på apoptotiske stimuli. For eksempel rapamycin øger evnen af ​​cisplatin til at inducere apoptose i humane promyelocyt leukæmi-cellelinier og æggestokkene cancercellelinier [40]. RAD001, et rapamycinderivat, har vist sig at sensibilisere et antal p53-positive cancerceller til cisplatin-induceret apoptose ved at inhibere p21-proteinekspression gennem undertrykkelse af almindelig oversættelse [41]. Desuden rapamycin sensibiliserede myelomatosecellelinjer til dexamethason-induceret apoptose, der er forbundet med reduceret ekspression af cyclin D2 og survivin [42]. Det er også blevet rapporteret, at ekspression af konstitutivt aktive mutant 4E-BP1 efterligner virkningen af ​​rapamycin til forøgelse af apoptose i myelomatose celler, hvilket antyder, at mTOR inhibitorer sensibilisere celler ved at inhibere cap-afhængig translation [43]. I overensstemmelse med dette begreb, små molekyler, der er målrettet cap-afhængig translation initiering ved inhibering af eIF4A kan gendanne lægemiddelfølsomhed i en muselymfom model [44].

I denne undersøgelse observerede vi, at kombinationen rapamycin og doxorubicin behandling førte til reduceret MDM2 udtryk, hvilket resulterede i øget apoptose, implicerer, at p53 kan være involveret i denne proces. Vores data viser, at doxorubicin opreguleret p53 som forventet. Men mens rapamycin /doxorubicin kombinationsbehandling ikke signifikant påvirker p53 proteinniveauer, phosphorylering i serin 15 på p53 blev forøget, hvilket antyder, at p53-aktivitet blev induceret. Vigtigere, ektopisk udtryk for MDM2 vendt apoptose, samtidig med reducerede niveauer p53 protein og serin 15 phosphorylering. Ikke desto mindre kan MDM2 også have p53-uafhængige funktioner at inhibere apoptose i nærvær af doxorubicin /rapamycin kombinationsbehandling.

Sammenfattende vores undersøgelse viser, at rapamycin sensibiliserer cancerceller til kemoterapeutisk lægemiddel-induceret apoptose og foreslår, at mTOR -targeted anticancer-terapi kombineret med kemoterapi kan være mere effektiv i behandling af p53-positive kræftformer.

Materialer og metoder

cellekultur Drug behandlinger og plasmider

Menneskelig bryst carcinom MCF-7-celler, osteosarcom U2-oS-celler og ikke-småcellet lungekræft H1299 celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) indeholdende 4,5 g /l glucose suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, certificeret, GIBCO) , 100 enheder /ml penicillin (GIBCO), 100 pg /ml streptomycin (GIBCO) og 2 mM L-glutamin (GIBCO). Alle cellelinjer blev passeret anvendelse af 0,05% trypsin-EDTA-opløsning (GIBCO). Celler blev holdt i en befugtet 37 ° C inkubator under en CO 5%

2 atmosfære. Celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). MCF-7, U2-OS eller H1299 celler ved 60-70% konfluens blev serum sultet i 24 timer i serumfrit DMEM forud for IGF-1-behandling. IGF-1 (Sigma) blev fremstillet som en 100 pg /ml stamopløsning i vand. Kemiske inhibitorer LY294002, PD98059, SB202190 (Calbiochem), og rapamycin (Sigma) blev fremstillet som 1.000 × stamopløsninger. Doxorubicin (Sigma) blev fremstillet som en 2 mg /ml stamopløsning. Heregulin-beta (Upstate) blev fremstillet som en 20 ug /ml opløsning i PBS. Til UV-behandling blev mediet fjernet, og cellerne bestråles med låg fjernet i en Spectrolinker XL-1000 UV tværbinder (SPECTRONICS Corporation). Efter bestråling blev medier tilsat til skålene, og cellerne blev dyrket som angivet for hvert forsøg før samling af både flydende og adhærente celler.

adenovirusinfektion, transient transfektion og RNA Interference

Celler på 60% konfluens blev inficeret med adenovirus, der koder AKT eller en vektorkontrol, og inkuberet i to timer ved 37 ° C med svag omrøring ved tyve minutters intervaller, efterfulgt af tilsætning af dyrkningsmedier og inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2 i 24 timer. H1299-celler ved 80% konfluens eller U2-OS-celler ved 50% konfluens blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Medier blev udskiftet otte (H1299) eller seks (U2-OS) timer efter transfektion. Små interfererende RNA mod eIF4E (AAGCAAACCUGCGGCUGAUCU), S6K (GGACATGGCAGGAGTGTTT) og scrambled siRNA styrer specifik for hver siRNA oligonukleotid blev købt fra Shanghai GenePharma Co., Ltd. og transficeret ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Western blot-analyse

Celler blev opsamlet, vasket med PBS og resuspenderet i EBC

250 lyseringsbuffer (250 mM NaCl, 50 mM Tris pH 8,0, 0,5% Nonidet P-40, 50 mM NaF, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid , 2 ug /ml aprotinin og 2 ug /ml leupeptin). Proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad). Lige store mængder protein blev påsat, adskilt ved SDS-PAGE, overført til PVDF-membraner (Millipore) og hybridiseret til en passende primære antistof og HRP-konjugeret sekundært antistof til efterfølgende påvisning ved forøget kemiluminescens. Monoklonalt antistof SMP14 specifikt for MDM2 (Santa Cruz) blev anvendt ved 1:200 fortyndinger. Det monoklonale antistof DO-1 specifikt for p53 (Santa Cruz) blev anvendt i en fortynding på 1:250. Polyklonalt antistof C-11 specifikt for actin (Santa Cruz) blev anvendt i en fortynding på 1:1000. Antistoffer specifikke for PARP (# 9542), phospho-AKT (Ser473; # 9271), total AKT (# 9272), Phospho-S6 ribosomprotein (serin 235/236; # 2211), S6 ribosomprotein (# 2217), S6 kinase (# 9202), eIF4E, Phospho-4EBP1 (Ser65; # 9456) eller 4EBP1 (# 9452) blev købt fra Cell Signaling Technology og anvendes på 1:1000 fortyndinger

flowcytometrianalyse

Celler blev trypsiniseret, vasket med koldt PBS og fikseret i 70% ethanol ved 4 ° C natten over. Celler blev farvet med propidiumiodid (PI) suppleret med 80 ug /ml RNase A ved 37 ° C i mørke i én time. Celler blev derefter underkastet flowcytometrianalyse af FACScan flowcytometer (Becton Dickson), og dataene blev analyseret under anvendelse Cell Quest software (Becton Dickson).

Kvantitativ PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler ved hjælp Tryzol ifølge producentens instruktioner (Gibco). RNA blev revers transkriberet under anvendelse iScript cDNA Synthesis Kit (BioRad). Reaktionen blev også udført i fravær af revers transkriptase til at tjene som en negativ kontrol. Q-PCR blev udført i 25 pi reaktionsvolumener (8 ng cDNA, 12,5 pi Taqman Universal PCR Master Mix, 1,25 pi Demand Gene Expression reagens, Applied Biosystems) for både MDM2 og GAPDH. Q-PCR-reaktionen blev udført i en ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Q-PCR var som følger: 10 minutter ved 95 ° C efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder og annealing /forløbende ved 60 ° C i ét minut. Relative kvantificeringsfremgangsmåder værdier blev beregnet under anvendelse af ΔΔCt metoden.

Cell Levedygtighed Assay

Både flydende og adhærerende celler blev opsamlet og resuspenderet i PBS. Lige volumener af trypanblåt farveopløsning (0,4%, Gibco) og cellesuspensionen blev blandet og farvet i fem minutter ved stuetemperatur. Antallet af farvede og ufarvede celler blev talt med et hæmacytometer. Mindst 500 celler pr prøve blev talt. Procentdelen af ​​levedygtighed repræsenterer forholdet af ufarvede celler til det totale antal celler. Studerendes

t-

test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans af forskelle mellem grupperne.

Tak

Vi takker Dr. J Lawrence (University of Virginia, Charlottesville, Virginia) til pCMV4-4EBP1 og pCMV4-4EBP1-5A plasmider.