PLoS ONE: CXCL12 chemokinekspression Undertrykker menneskelige kræft i bugspytkirtlen vækst og Metastasis

Abstrakt

Bugspytkirtelkræft duktalt adenokarcinom er et uløst sundhedsproblem med næsten 75% af patienter diagnosticeret med fremskreden sygdom og en generel 5-års overlevelse nær 5%. Trods den stærke sammenhæng mellem dødelighed og malignitet, er mekanismerne bag formidling og metastase bugspytkirtelkræft dårligt forstået. Korrelative patologisk og cellekultur-analyser tyder kemokinreceptoren CXCR4 spiller en biologisk rolle i bugspytkirtelkræft progression.

In vivo

roller for CXCR4-ligand CXCL12 i bugspytkirtelkræft malignitet blev undersøgt. CXCR4 og CXCR7 blev konsekvent udtrykt i normal og kræft i bugspytkirtlen ductal epitel, etablerede cellelinjer, og patient-afledte primære kræftceller. I forhold til raske eksokrine kanaler blev CXCL12 udtryk patologisk undertrykt i bugspytkirtelkræft vævsprøver og patient-afledte cellelinjer. For at teste de funktionelle konsekvenser af CXCL12 lyddæmpning, bugspytkirtelkræft cellelinjer stabilt expressingthe chemokin blev manipuleret. I overensstemmelse med en rolle for CXCL12 som en tumor suppressor, celler, der producerer chemokinet wereincreasingly vedhængende og migration mangelfuld

in vitro

og dårligt metastatisk

in vivo

, i forhold til at styre celler. Endvidere CXCL12 genindførelse væsentligt reduceret tumorvækst

in vitro,

med betydeligt mindre tumorer

in vivo

, hvilket fører til en udtalt overlevelse fordel i en præklinisk model. Tilsammen udgør disse data viser en funktionel tumor undertrykkende rolle for den normale udtryk for CXCL12 i pancreas kanaler, regulering både tumorvækst andcellulardissemination til metastatiske sites

Henvisning:. Roy I, Zimmerman NP, Mackinnon AC, Tsai S, Evans DB, Dwinell MB (2014) CXCL12 chemokinekspression Undertrykker menneskelige kræft i bugspytkirtlen vækst og metastase. PLoS ONE 9 (3): e90400. doi: 10,1371 /journal.pone.0090400

Redaktør: Jeffrey K. Harrison, University of Florida, USA

Modtaget: 11. november 2013; Accepteret: 29 Januar 2014; Udgivet: 4 marts 2014

Copyright: © 2014 Roy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra A sundere Wisconsin og MCW Cancer center. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Vi har følgende interesser. Dr. Dwinell er en modtager af et patent (# 8.404.640) for brug af CXCL12 i behandlingen af ​​maligne kræft og er medstifter af protein Foundry, LLC. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke vores tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere. Titlen på patentet er: “Metode til at diagnosticere og behandle tyktarmskræft”

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er anunrelenting form for menneskelig cancer, med ingen effektiv teknik til tidlig diagnose. eller behandling, og en incidens næsten lig dødelighed [1], [2]. De fleste patienter, på tidspunktet for diagnosen, allerede har lokalt fremskreden eller metastatisk sygdom, hvilket gør kirurgisk resektion af primær tumor af begrænset terapeutisk værdi [3] .Current farmaceutiske terapier for PDAC er utilstrækkelige som det store flertal af bugspytkirtlen kræftpatienter dør af mikro – eller makro-metastatisk sygdom [4]. er behov for en bedre forståelse af de biologiske mekanismer bag aggressivitet PDAC. Selv om de seneste undersøgelser har fastslået de molekylære faktorer involveret i udviklingen af ​​PDAC [5] – [7], lidt om de biologiske mekanismer, der regulerer celle motilitet og til gengæld metastaser. Kemotaktiske cytokiner eller kemokiner, spiller keyroles i den cellulære migration, og er i stand til at koordinere flere aspekter af cellemigrering maskiner. Gennem aktivering af deres receptorer, chemokinesregulate flere facetter af normal fysiologi, herunder leukocyttrafik, epithelcellevandring nødvendig for sårlukning, væv vaskularisering, og organudvikling under embryogenese [8] – [10]. Tidligere vores laboratorium revealedthe betydning af den dobbelte ekspression af chemokin CXCL12 og dens beslægtede receptor CXCR4 i enterocytterne migration, sårheling og angiogenese [11] – [16]

Flere undersøgelser har impliceret en rolle for chemokin. receptorer, især CXCR4 og CCR7, i cancer progression og metastase [9], [17] – [22]. CXCR4-ekspression er blevet forbundet med malignitet af over gennem 20 forskellige cancere [17], [23]. Vi har tidligere vist, at CXCL12 udtrykkes i normale epitelceller i tarmen og mælkekirtler, men er epigenetisk tavshed i human og kolorektal cancer [24], [25] .Dette mønster af CXCL12 gen repressionresults i tumorceller hvis chemokin – receptor profilesmirror den for meget mobile leukocytter, som udtrykker receptorerne CXCR4 og CXCR7 men ikke liganden. Vi viste, at re-ekspressionen af ​​CXCL12 faldt evne bryst og kolorektal cancer celler til at metastaserer [24] – [26] .Several undersøgelser haveextended disse skelsættende resultater at vise gavnlige virkninger af autokrine CXCL12 i bryst-, lunge-, mave-, og hoved og halscancer [27] – [30]. Tab af CXCL12expression i osteosarkom og brystkræft patient tumor specimenswas korreleret med dårligere prognose [31] – [34]. I bugspytkirtelkræft, modstridende og ufuldstændige rapporter tyder enten at CXCL12 ekspression er forhøjet eller at CXCL12 ikke udtrykkes i langt de fleste af patienterne [35], [36]. Således mens en voksende mængde af beviser tyder en tumor-undertrykkende rolle for CXCL12 i human cancer malignitet, forbliver dens mekanistiske roller i PDAC dårligt forstået.

Den fremherskende model for kræft metastaser er, at maligne tumorer spredes til fjerne væv gennem over-ekspression af CXCR4 [22], [37], [38], hvorved sensibiliserende maligne celler til at spredes i respons til fjerne gradienter af CXCL12 produceret af metastatiske destination organer. Denne model er også blevet brugt til at forklare PDAC metastase, som flere rapporter dokumenterer ekspressionen af ​​CXCR4 af pancreas carcinoma cellelinier og humane væv [39] – [42]. Men ingen af ​​disse undersøgelser har nøje undersøgt den parallelle ekspression af CXCL12 eller CXCR7 i forbindelse med CXCR4 eller defineret ekspression af nogen af ​​de tre komponenter i dette chemokin akse i normale pancreas epithelium.The mål i vores undersøgelse var at bestemme ekspressionsprofilen og funktionel rolle CXCL12-CXCR4-CXCR7 akse i både raske normale og maligne bugspytkirtlen. Heri vore data viser, at mens receptorekspression forøges, CXCL12 ekspression betydeligt formindsket i opereret PDAC væv og et batteri ofpancreatic cancercellelinjer sammenlignet med normale pancreas. CXCL12 udtryk blev forbigående restaureret med hæmmere af epigenetisk repression.Stable genindførelse af CXCL12 i PDAC celler forhindrede rettet celle migration og hepatisk metastase og bremset tumorvækst

in vitro

in vivo

, hvilket resulterer i øget overlevelse i prækliniske modeller.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Fritagelse, de-identificerede normal pancreas, PDAC vævsprøver, og unikke patient-afledte PDAC celler blev opnået fra den Kirurgisk Oncology Biorepository hjælp af en Medical College of Wisconsin (MCW) InstitutionalReview Board # 4 godkendte protokol. Væv og celler i biobanken blev opnået fra patienter efter underskrevet skriftligt informeret samtykke og er kodet og de-identificeret, med personlige identificerbare oplysninger ikke deles med forskning efterforskere. Prækliniske mus xenografundersøgelser blev afsluttet ved hjælp af protokoller og procedurer dokumenteret i en etableret Animal Brug Application (AUA076) godkendt af MCW Institutional Animal Care og brug Udvalg og i overensstemmelse med retningslinjer fastlagt af Office of Laboratory Animal Welfare og i overensstemmelse med vejledning til pleje og brug af LaboratoryAnimals. Alle mus blev huset under patogenfrie betingelser, fået mad og vand ad libitum og holdt i en 10 hr: 14-timers lys /mørke-cyklus i en temperaturreguleret rum (25 ± 2 ° C) .Animals blev aflivet ved afslutningen af undersøgelsen eller efter tegn på angst eller dårlig huld som vurderet af uddannet laboratoriepersonale og bekræftet af MCW Biomedical Resource center-medarbejdere dyrlæger til at lindre smerte og ubehag forbundet med tumordannelse.

Humane bugspytkirtelkræft cellelinjer

Panc1 (CRL-1469), MiaPaCa2 (CRL-1420), blev Capan2 (HTB-80), og HPAFII (CRL-1997) cellelinjer købt fra ATCC. Panc1 og MiaPaCa2 cellelinjer blev opretholdt i DMEM suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS). De Capan2and HPAFII cellelinier blev opretholdt i 10% (vol /vol) FBS suppleret McCoys 5Aor MEM-medium, henholdsvis. I nogle eksperimenter blev celler dyrket i normalt medium behandlet dagligt med 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza) eller Trichostatin-A (EMD Biosciences). MiaPaCa2 cellelinier blev transfekteret med Firefly-luciferase under zeocin markering. Resulterende luciferase-udtrykkende MiaPaCa2 celler blev efterfølgende transficeret med plasmider, der koder enten eGFP eller human CXCL12, og kloner dyrket under neomycin udvælgelsesbetingelserne [26]. Cellelinjer blev de-identificeret alle identifikationsparametrene fra individuelle samtykkende patienter med kræft i bugspytkirtlen og blev bekræftet at være af PDAC oprindelse efter DNA karyotype og protein udtryk analyse.

Humane pancreas tissuespecimens

Normale kanaler og Panin læsioner blev isoleret udelukkende fra tilstødende normale væv udsmid af organtransplantation eller pancreas operationer, der ikke involverer PDAC eller andre eksokrine maligniteter. Patienternes sygdomsstatus af disse normale og tumor tissueswas bekræftet af en bord-certificeret pathologist.A alt 25 væv fra 21 forskellige patienter blev anvendt til normale analyser. I alt 82 væv fra 29 forskellige patienter blev anvendt til tumor analyser. Af de 29 patienter, der leverer PDAC væv, havde 11 patienter fik neo-adjuverende behandling.

RT-PCR

RNA blev isoleret fra celler og vævsprøver ved hjælp af RNAeasy (Qiagen) og behandlet med DNase (Ambion), omdannes til cDNA, og CXCL12, CXCR4, CXCR7, og GAPDH transcript ekspression analyseret som defineret og tidligere optimeret til effektivitet i et lineært område [24], [43] .En region i 5′-utranslaterede region af mannose binding lectin genet blev amplificeret til at detektere genomiske DNA kontaminanter [12]

Immunoanalyses

Ufarvede objektglas blev genereret fra pancreas tumorprøver og CXCL12 immunofarvede anvendelse af et antistof fra R ab72100), og Ki-67 (ab15580) blev påvist under anvendelse af antistoffer fra Abcam.Visualization blev udført under anvendelse peberrod-peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer og 3,3′-diaminobenzidinePeroxidase Substrate Kit (Vector Labs). At undgå baggrundsinterferens objektglas blev ikke modfarvet. Protein-ekspressionsniveauer blev scoret med et standard 4-punkts skala [0 = fraværende, 1 = svag, 2 = blandet, og 3 = stærk farvning intensitet] [44]. Analyser blev uafhængigt afsluttet med en investigator blindet for sygdomsstatus og immunfarvning protokol. Secerneret CXCL12 protein fra supernatanten af ​​bugspytkirtelkræftceller dyrket i serumfrie medier blev påvist ved ourpreviously etableret sandwich ELISA-metode under anvendelse af antistoffer fra R . figur 2A). CXCL12 chemokinekspression blev specifikt begrænset til duktalt rum og ude af acinære og endokrine celler, som begge farvet for kemokinreceptorerne CXCR4 og CXCR7 (data ikke vist). Inkubation af parallelle sektioner med isotypekontrolantistoffer confirmedspecificity (fig. 2A). Vi undersøgte dernæst ekspression i præmaligne læsioner på bugspytkirtlen, kaldet bugspytkirtlen Intra-epiteliale neoplasmer (PanINs) [48] – [51]. Som vist i figur 2C-D, CK19 + PanINsexpressed både CXCR4 og CXCR7. Til sammenligning CXCL12 farvning wasmore variabel, med blandet tomarkedly reduceret ekspression i PanINs sammenlignet med normale pancreas kanaler (2C-D). I en begrænset analyse, kunne påvises nogen signifikante forskelle i CXCL12 udtryk mellem PanIN1, PanIN2, og PanIN3 læsioner.

Serial sektioner af normal og sygt pancreas væv blev farvet for CXCL12, CXCR4, CXCR7, og CK19. CXCL12 farvning tilsyneladende i normale eksokrine kanaler blev formindsket i PDAC væv. CXCR4-farvning steg i Panin og PDAC forhold til normal duktalt epitel. CXCR7 ekspression var variabel i normalt epitel, Panin læsioner, og PDAC. (A) Normal væv fra en enkelt patient med sund bugspytkirtel repræsenterer observationer fra 25 forskellige normale væv fra 21 individuelle patienter. (B) PDAC væv fra en patient repræsenterer observationer fra 82 forskellige væv fra 29 forskellige patienter. 1000 × forstørrelse repræsenterer indsatte boks på 200 ×. (C) Farvning blev kvantificeret ved blindet scoring af serielle snit i forhold til CK19 farvning. (***) Angiver

P

≤0.001.

Repræsentative 200 × billeder af den samme (A) normale eller (B) pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) væv vist ved 1000 × forstørrelse i figur 1. Repræsentative seriel sektion billeder af en pancreatisk intestinal neoplasme (Panin) læsion ved (C) 200 × eller (D) 1000 ganges forstørrelse. Serielle vævssnit blev immunfarvet med antistoffer mod CK19, CXCL12, CXCR4, og CXCR7, eller de isotypekontroller. n = 25 forskellige normale væv fra 21 individuelle patienter, 82 forskellige væv fra 29 forskellige PDAC patienter, eller 19 patologisk bekræftede Panin læsioner.

Analyse af PDAC tumorvæv revealeda yderligere, og mere udtalt, udryddelse af CXCL12 i CK-19 + tumorceller (figur 1B, Fig.2B). I heterogene tumorvæv indeholdende både maligne og normale kirtler blev CXCL12 farvning formindsket i maligne celler, butpreserved i tilstødende normale duktale celler (data ikke vist). Analyse af seriel væv sectionsrevealed at malignt væv med lave niveauer af CXCL12had en gensidig stigning i CXCR4, samt CXCR7, farvning (fig. 1B, fig. 2B). Kvantificering af CXCL12, CXCR4, og CXCR7 immunfarvning intensitet bekræftede signifikant fald i CXCL12 udtryk under progressionfrom normal prækursorer Panin til ondartet pancreas væv (Fig. 1C). I modsætning hertil blev CXCR4 udtryk forhøjet i PanINsand PDAC sammenlignet med normale kanaler (Fig.1C). Scoring af CXCR7 udtryk afslørede et bifasisk mønster med lavere udtryk forekommer i Panin scenen og højere udtryk tilbagevendende i PDAC (Fig.1C) .Når patienterne blev opdelt i grupper afhængig af, om de havde modtaget neo-adjuverende behandling, patienter, der fik standard-of-care regimer af gemcitabin eller FOLFIRINOX terapi [52] – [54] havde signifikant (

P

≤0.05) højere score for CXCL12 udtryk (0,82 ± 0,18) sammenlignet med patienter, der ikke modtager neoadjuverende terapi (0,43 ± 0,09)

CXCL12 udtryk og epigenetisk regulering i bugspytkirtelkræft cellelinjer

for yderligere at karakterisere chemokin -. receptor-ekspression og identificere en passende model til at studere funktionen af ​​CXCL12 i PDAC, primær patient- afledte og etablerede bugspytkirtlen kræft cellelinjer blev analyseret gennem RT-PCR ved hjælp af vores tidligere optimerede primer sæt til CXCL12, CXCR4, og CXCR7 [24], [43]. RT-PCR angivet konsekvent mangel på CXCL12 udskrift i patient-afledte primære såvel som Panc1, MiaPaCa2, Capan2, og HPAFII cellelinier (Fig.3A-B). Efter aftale med immunhistokemiske analyser blev CXCR4 mRNA bevaret i 7of de 8 PDAC cellelinjer, mens CXCR7 udtryk var mere variabel (Fig.3A-B). Flowcytometri bekræftede celleoverfladen lokalisering af CXCR4 og CXCR7 på repræsentative cellelinier (Fig.3C). For at konstatere, om den manglende CXCL12 ekspression afspejles epigenetisk inaktivering blev celler behandlet med titrerede doser af DNA methyltransferase inhibitor 5-aza. Den hæmmer reddede CXCL12mRNA udtryk i repræsentative cellelinier (Fig.3D). Behandling med histondeacetylaseinhibitoren Trichostatin-aalso restaureret ekspression af CXCL12 i Capan2 celler (Fig. 3E). Baseret på vores forudgående undersøgelser der undersøger de specifikke mekanismer CXCL12 promotor hypermethylering i kolorektale og brystkræft [24], [25], antyder disse data, at CXCL12 ekspression reguleres gennem epigenetiske mekanismer i kræft i bugspytkirtlen som well.Cumulatively, thesedata angiver CXCL12 gen undertrykkelse i human tissueand et batteri af ny og etableret PDAC celle lines.The MiaPaCa2 cellelinje blev identificeret som en ideel model, som dens CXCL12-CXCR4-CXCR7 udtryk mønster efterligner observeret i malignt humant PDAC væv.

RT PCR-analyse viste, at (A) patient-afledte bugspytkirtelkræft cellelinier (# 1, # 2, # 3, # 4) eller (B) etablerede cellelinier manglede udtryk for CXCL12 og vedligeholdes udtryk for CXCR4. CXCR7 mRNA var til stede i 3 af 8 PDAC lines.Flow cytometrisk detektion (C) på overfladen CXCR4 eller CXCR7 proteinekspression. Cellelinier treatedseven dage med en koncentration kurve af (D) 5-aza-2-deoxycytidin (5-aza) genoprettede ekspression af CXCL12.Linestreated 4 dage med en koncentration kurve af (E) Trichostatin-A (TSA) restaureret CXCL12-mRNA-ekspression i Capan2 celler.

CXCL12 re-udtryk i humane PDAC celler disruptedchemotaxis, øget klæbemiddel potentiale, og nedsat hepatisk metastaser

Den konventionelle paradigme for kemokinmedieret metastase af kræftceller er, at udtryk af CXCR4 er pro-metastatisk. Denne model stammer fra evne eksogene CXCL12 at stimulere migration af kræftceller

I

vitro [13], [45], [55]. Som forventet, måling af det native potentiale af flere CXCL12-deficient pancreatiske cellelinjer migration afslørede, at CXCR4-udtrykkende PDAC celler migrere til akut CXCL12 stimulation (Fig. 4A). Vigtigere er det, Panc1 og MiaPaCa2 celler migrerede mod CXCL12 i bifasisk-koncentrationsafhængig måde i overensstemmelse med nuværende forståelse af kemotaktisk migration [55], [56]. Den HPAFII cellelinie, som manglede overfladeekspression af enten CXCR4 eller CXCR7 var ikke i stand til at migrere som respons på CXCL12 behandling (fig. 4A). Panc1 cellsalso invaderede en ekstracellulær matrix som respons på akut exogen CXCL12 stimulation (Fig. 4B).

(A) Panc1 og MiaPaCa2 celler migrerede i retning exogene gradienter af CXCL12 i et område fra 1 nM til 1000 nM under serum- frie forhold (*), (**), og (***) betegner

P

≤0.05,

P

≤0.01, og

P

≤0.001 henholdsvis i sammenligning med ikke-stimulerede celler (NS). Receptor-null HPAFII celler ikke migrere som respons på CXCL12. (B) CXCL12 dirigerer Panc1 celle chemoinvasion i et tredimensionalt Matrigel stik. Den positive kontrol (+) var 10% serumholdigt medium. (*), (**), Og (***) betegner

P

≤0.05,

P

≤0.01, og

P

≤0.001 henholdsvis i sammenligning med ikke-stimulerede celler (NS).

Vi mener, at pro-metastatisk respons PDAC celler skyldes silencing af ekspression af CXCL12. For at teste denne blev indført sammen ekspression af chemokin, under anvendelse doublestable plasmid integration, i MiaPaCa2 celler. Celler blev først stabilt transficeret med ildflue-luciferase og derefter transficeret med yderligere gener ved anvendelse af en anden udvælgelse reagent.Several CXCL12-udtrykkende kloner blev genereret sammen med en kontrol klon transficeret med eGFP, der hver udviser ækvivalenter niveauer af luciferaseaktivitet (Fig.5A-B ). Vigtigere, manglende chemokin produktion var bekræftes af ELISA i Panc1, MiaPaCa2, Capan2, og HPAFII cellelinjer (fig. 5C). Funktionel chemokin produktion i CXCL12-udtrykkende kloner sammenlignet med GFP-udtrykkende kloner til af MiaPaCa2 celler blev valideret ved ELISA andtranswell migration af U937-celler (Fig.5C-D) .MiaPaCa2 secernerer CXCL12demonstrated en signifikant reduktion i vandrende reaktion på TGF-βor CXCL12 begge kendte førere af

in vitro

PDAC celle migration (Fig.6A-D). I betragtning af betydningen af ​​lim potentiale i de metastatiske evner kræftceller blev celleadhæsion næste målt. CXCL12 positive celler var signifikant mere klæbende til vævskultur plasticcompared kemokin nul-celler (Fig. 6E). Disse

in vitro Salg data indikerer, at den samlede malignt potentiale bugspytkirtelkræftceller, både i evnen af ​​disse celler til at migrere og omgå substrat adhæsion, er formindsket efter genindførelse af CXCL12 transkriptet i PDAC celler.

Luciferase niveauer i kontrol GFP eller tre forskellige (31, # 2, # 3) CXCL12-udtrykkende MiaPaCa2 kloner målt ved spektrofotometer (A) eller IVIS-100 BioPhotonic imager (B). Niveauer af CXCL12 blev målt ved ELISA (C) i etablerede PDAC cellelinier samt GFP- og CXCL12-udtrykkende MiaPaCa2-luciferase kloner. (D) CXCL12-udskilles af transficerede MiaPaCa2-luciferase kloner # 1 og # 2 stimulerede U937 kemotaxi. Celler behandlet med neutraliserende antistof til CXCL12 (αL12) bekræftede specificitet U937 kemotaksi. Værdier i A, C og D er gennemsnit ± SEM, n = 2-3.

(A) Transwell migration analyser afslørede betydeligt reduceret kemotaksi af CXCL12 udtrykker kloner (# 1 og # 2) sammenlignet med ligand null (GFP) celler. Tiltrækningsmidler var serumfrie medier (-), 10% serum (+), eller 10 nM CXCL12 (L12) i serumfrie medier. betegne

P

≤0.01 og

P

≤0.001, sammenlignet med 10 Nm CXCL12-stimuleret GFP celler, n = 5. (B) CXCL12 re-udtryk formindsket TGF-β (5 ng /ml) -induceret kemotaksi i forhold til CXCL12-nul-celler. (##) Angiver

P

≤0.01 forhold til TGF-beta-stimulerede GFP celler, n = 4. (C) (D) Repræsentative billeder af eksperimenter i (A) og (B) hhv. (E) CXCL12-udtrykkende celler var signifikant mere klæbende til vævsdyrkningsplastic sammenlignet med CXCL12-null celler. Ubehandlede celler = (-), neutraliserende antistof for CXCL12 aktivitet = (αL12), og en positiv kontrol = 1 ng /ml EGF (+). (##) Angiver

P

≤0.01 sammenlignet med 10% serum-stimulerede kontrol celler. (*), (**), Og (***) betegner

P

≤0.05,

P

≤0.01 og

P

≤0.001, sammenlignet med stimulerede GFP celler, n = 7.

Vi næste forsøgt at afgøre, om den samtidige øget klæbemiddel og faldt migratoryphenotypes i PDAC celler ville suppressmetastatic spredt

in vivo

usinga heterotopisk xenograft musemodel. CXCL12-udtrykkende og CXCL12-nul-celler blev injiceret i milten fra SCID-mus. Over 28 dage,

in vivo

sporing af celler viste, at sammenlignet med kontrol- celler, der var en væsentlig ændring i evnen af ​​CXCL12-udtrykkende MiaPaCa2 celler at formidle væk fra den oprindelige websted af podning (Fig.7A -B).

Ex vivo

analyse viste, at luminescens ved stedet for milt inokulation var uændret, mens mus injiceret med PDAC der producerer CXCL12had væsentligt lavere levertumor byrde end mus injiceret med GFP-kontrolceller (Fig.7C-E). Disse data antyder, at CXCL12 specifikt ændrer evnen hos bugspytkirtelkræftceller til hjem til leveren, et organ med høj ekspression af CXCL12 og en fælles metastatisk destination PDAC patienter.

(A) Repræsentative bioluminescens billeder af mus xenotransplanterede med GFP- eller CXCL12-udtrykkende celler ved implantation (dag 0) eller studere endpoint (dag 28). (B) Hele kroppen

in vivo

udstråling over tid af GFP- og CXCL12-mus. (C)

Ex vivo

udstråling af udskåret milt (C), hvilket afspejler tumorceller ved injektionsstedet, eller den metastatiske destination (D), hvilket afspejler nedsat hepatisk metastase af CXCL12-udtrykkende celler i forhold til GFP-celler . (**) Betegner

P

≤0.01, n = 4-5. (E) Repræsentant H . E-billeder viser udtalt tumor masse i leveren af ​​kontrol (GFP), i forhold til eksperimentel (CXCL12) xenotransplanterede mus

Samtidig CXCL12, faldt CXCR4 og CXCR7 udtryk tumorcelleproliferation og metastase og forlænget overlevelse i et præklinisk PDAC model

Tidligere havde vi observeret, at re-ekspressionen af ​​CXCL12 i kolorektal cancer celler føre til øget anoikis, detachement baseret apoptose [24], [43]. Vi testede, om re-introduktion af CXCL12 i PDAC celler ville ændre deres apoptotiske eller proliferative potentialer. I serumfrie betingelser blev en stigning i apoptose detekteret i adhærente CXCL12-udtrykkende bugspytkirtelkræftceller sammenlignet med GFP-udtrykkende kontroller, selvom dette respons blev svækket ved tilsætning af serum (fig. 8A-B). Ved anvendelse af en etableret model til undersøgelse af løsrivelse-induceret apoptose blev celler dyrket på Poly-HEMA [43]. Som med adhærente celler, blev apoptose steg i ikke-adhærente CXCL12-positive PDAC celler sammenlignet med kontroller, men igen tilsætningen af ​​serum resulterede ikke i nogen ændring i apoptose (Fig.8C-D). Cell nummer uændret mellem ikke-klæbende CXCL12-positive og negative cellepopulationer (Fig. 8C-D).

Apoptose af GFP og CXCL12-udtrykkende MiaPaCa2 celler blev vurderet ved hjælp af caspase 3/7 Glo assay.Cells blev sultet i 24 timer og dyrket i 0% serum (A, C) eller 1% serum (B, D) indeholdende medium. (A-B) Apoptose i adhærente CXCL12-udtrykkende celler var forhøjet sammenlignet med enten GFP-udtrykkende kloner i serumfrie betingelser med ingen ændring hos 1% serum. GFP-celler werestimulated med 100 uM gemcitabin som kontrol. (C-D) til at måle celleantal og frigørelse baseret apoptose af celler i suspension, MiaPaCa2-luciferase-celler blev dyrket på poly-HEMA. Brug af Viacount reagens og flowcytometrisk celletælling, var der ingen forskel i levende celletal observeret i ikke-klæbende CXCL12-null (GFP) eller udtrykkende celler ved dyrkning enten i 0% (C) eller 1% serum (D). Apoptose af poly-HEMA dyrkede celler afslørede en i stigning i aktiv caspase-3/7 begrænset til celler dyrket i serumfrie betingelser kun (C) uden nogen ændringer observeret i 1% serum (D). Gemcitabin (GEM) blev anvendt som en kontrol for nedsat celletal og forøget apoptose. (*), (**) Og (***) betegne

P

≤0.05,

P

≤0.01, og

P

≤0.001 henholdsvis sammenlignet med kontrolceller (GFP). Værdier er gennemsnit ± SEM, n = 4-5.

I betragtning af den minimal ændring i anoikis-følsomhed i CXCL12-udtrykkende PDAC celler i serum indeholdende vilkår, vi næste testede deres vækstpotentiale. I skærende kontrast til vores data i humane kolorektale eller brystcancer [24] – [26], [43], befolkningstilvækst på CXCL12 udtrykker PDAC var signifikant faldt sammenlignet med chemokin mangelfuld celler (fig.9). Langsommere vækst af CXCL12-udtrykkende celler blev observeret i både serum-frit og serum-holdige betingelser (Fig.9A-B).