PLoS ONE: Fenretinid: en ny behandling af endometriecancer

Abstrakt

Modstand mod progestin behandling er en stor forhindring i behandlingen af ​​fremskreden og tilbagevendende endometriecancer. Fenretinid er et syntetisk retinoid, der er blevet evalueret i kliniske undersøgelser som en kræft terapeutisk og kemo-forebyggende middel. Fenretinid er blevet etableret for at være cytotoksiske for mange slags kræftceller. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at fenretinid faldt cellelevedygtighed og apoptose i Ishikawa-celler, som er en endometriecancer cellelinje, i dosisafhængig måde

in vitro

. Denne effekt

viste sig at være

uafhængig af retinsyre nukleær receptor-signalvejen.

Yderligere

, vi har vist, at denne induktion af apoptose ved fenretinid kan skyldes øget retinol optagelse via STRA6. Silencing af STRA6 viste sig at nedsætte apoptose som blev inhiberet af knockdown af STRA6 ekspression i Ishikawa-celler. Resultater af en

in vivo

undersøgelse viste, at intraperitoneale injektioner af fenretinid i endometriecancer tumorer (oprettet ved hjælp af Ishikawa-celler) i mus hæmmede tumorvækst effektivt. Immunhistokemi af mus tumorer viste et fald i Ki67-ekspression og en stigning i spaltet caspase-3-farvning efter fenretinid behandling sammenlignet med bærerbehandlede mus. Kollektivt, vores resultater er de første til at etablere effekten af ​​fenretinid som et antitumormiddel for endometriecancer både

in vitro

in vivo

, yde en værdifuld rationale for at indlede flere prækliniske studier og kliniske forsøg med fenretinid til behandling af endometriecancer

Henvisning:. Mittal N, Malpani S, Dyson M, Ono M, Coon JS, Kim JJ, et al. (2014) Fenretinid: en ny behandling af endometriecancer. PLoS ONE 9 (10): e110410. doi: 10,1371 /journal.pone.0110410

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: Februar 19, 2014 Accepteret: September 15, 2014; Udgivet: 23. oktober 2014

Copyright: © 2014 Mittal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Disse undersøgelser blev støttet af generøse midler fra John og Diane O’Donnell (til deling af Gynækologi Oncology, NU) og reproduktiv biologi Division, NU. Der blev også støttet af K12HD050121 og ASRM Karriereudvikling Award, som blev tildelt Mary Ellen Pavone. Center-Support Grant (NCI CA060553) blev anvendt til indlejring, sektionering og farvning af tumorvæv. NU Cell Imaging Facility var generøst støttet af NCI CCSG P30 CA060553 som blev tildelt til Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion.

Endometriecancer er den mest udbredte gynækologisk kræft i USA, med en anslået 49,560 nye tilfælde og 8190 – dødsfald i 2013 [1]. Sandsynligheden for en kvindelig bliver diagnosticeret med denne kræft i løbet af hendes levetid er omkring en i 38 [2]. Forekomsten af ​​denne reproduktionsorganer malignitet er steget med gennemsnitligt 1,1% om året fra 2004 til 2008, og dødeligheden er også steget med gennemsnitligt 0,3% om året fra 1998 til 2007 [3]. Kirurgi, kemoterapi og strålebehandling er tre vigtigste etablerede metoder til behandling af endometrisk carcinoma [4], [5]. Kirurgisk fjernelse af livmoderen og adjuverende behandling resulterer i en større end 90% fem års overlevelse. Gentagelse grundet resistens mod kemoterapi eller strålebehandling præsenterer en anden stor udfordring for sundhedspersonale. Derfor er det af yderste vigtigt at identificere nye og effektive behandlinger for livmoderkræft.

Klinisk progestiner, herunder Megace (megestrolacetat) er blevet anvendt til behandling af endometrie maligniteter på grund af den antagonistiske virkning af progesteron på østrogen handling . Gestagener anvendes som primære midler til behandling af fremskreden eller recidiverende sygdom, dem, der er fattige kandidater til kirurgi og hos yngre kvinder, der gerne vil bevare deres fremtidige fertilitet. En komplet respons kan opnås, når progestin terapi anvendes til kvinder med endometriehyperplasi og godt differentieret endometrie adenocarcinom; imidlertid effektiviteten af ​​progestin terapi falder med en stigning i sygdommens sværhedsgrad. Derudover kan gentagelser forekomme én gang progesteron terapi er stoppet [6], [7].

På jagt efter målrettet terapeutisk middel mod endometriecancer, tidligere

in vitro

undersøgelser fra vores laboratorium demonstreret markeret inhibering af proliferation af endometriecancer Ishikawa cellelinie ved retinsyre (RA) og RA-agonisten AM580 forbindelse [8]. Imidlertid har deres klinisk anvendelse været der indtil videre begrænset af deres ugunstige bivirkninger profil [9]. RA og deres derivater (enten naturlige eller syntetiske forbindelser) har en anerkendt rolle i reguleringen af ​​cellevækst, differentiering og apoptose. RA har potentiale til behandling og forebyggelse af kræft [10], [11]. Retinol (den dominerende form af retinoider i den menneskelige krop) skal omregnes til retinsyre at vise dets biologiske aktivitet. Den primære kilde til RA er kosten vitamin A, som optages i tarmen og pakket som retinylestere i leveren. Disse retinylestere udskilles i cirkulation bundet til retinol-bindende protein (RBP) og efterfølgende taget i celler via

STRA6

(Stimuleret af RA 6), en afgørende celleoverfladereceptor for RBP [12]. Tidligere har vores laboratorium vist, at STRA6 er den primære regulator af retinol optagelse i endometriet og at nedsat ekspression af dette gen i endometriose kan bidrage til nedsat hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 2 (HSD17β2) mRNA-ekspression [13], hvilket fører til vedvarende forhøjede niveauer af estradiol. Vi har også vist, at retinoider falde østrogen produktion ved at inducere HSD17β2 ekspression i endometriske Ishikawa-celler [14].

STRA6 er den vigtigste celleoverfladereceptor ansvarlig for retinol optagelse. Inde i cellen, kan retinol oxideres til flere biologisk aktiv RA ved alkoholdehydrogenaser. RA ledes derefter fra cytoplasmaet til specifikke nukleare hormon RA receptorer (RAR), og retinoid-X-receptorerne (RXR’er) med to intra-cytoplasmatiske bærerproteiner, specifikt cellulært RA bindende protein 2 (CRABP2) og fedtsyrebindende protein 5 (FABP5 ) [15]. Endelig er den ubrugte RA metaboliseres og bortskaffes ud af cellerne ved CYP26 familie af enzymer [16].

Fenretinid [N-4-hydroxyphenyl retinamid (4-HPR)], en syntetisk derivat af all-trans retinsyre er i stand til at initiere celle apoptose selv i ATRA-resistente cellelinjer med den ekstra fordel at have en mindre bivirkninger profil. Humane undersøgelser har vist, at de store bivirkninger omfatter formindsket tilpasning til mørke øjne, hud og slimhinder tørhed, kløe, nældefeber, gastrointestinal ubehag og ændring okulære overflader. Disse bivirkninger var relativt hyppige, men mild. Som sådan er det fremstår som en af ​​de mest lovende antitumormidler [17]. Undersøgelser har vist, at fenretinid kan fremkalde cytotoksicitet i flere humane kræftceller

in vitro

[18] – [23]. Klinisk har fenretinid blevet anvendt som både et kemoforebyggende middel i bryst- [24], blære [25] og mundslimhinden cancere [26], og som et kemoterapeutisk middel i pædiatriske [27], [28] og voksen cancere [29] – [31]. Virkningsmekanismen af ​​fenretinid induceret celledød er endnu ikke blevet fuldstændigt belyst. Det er imidlertid blevet foreslået, at dets inhibitoriske virkninger kan medieres af både retinsyre receptor-afhængige og -uafhængige mekanismer [17].

Den foreliggende undersøgelse undersøgte terapeutiske potentiale fenretinid som antitumormiddel samt dets potentielle virkningsmekanisme mod endometriecancer både

in vitro

in vivo.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle forsøgene dyr blev godkendt af Northwestern University Animal Care og brug Udvalg.

endometriecancer celler kultur

Endometrie epitel Ishikawa cellelinier (en slags gave fra Dr. Masato Nishida Kasumigaura Rigshospitalet Tsuchiura, Ibaraki, Japan) blev afledt fra humane maligne endometriske epitelceller [32]. Ishikawa-celler blev dyrket i monolag ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator i en blanding af DMEM og F12 (01:01) -medium med 5% føtalt bovint serum (FBS), 1% natriumpyruvat og 1% penicillin-streptomycin, hygromycin antibiotika løsning (Life Technologies, Grand Island, New York).

Små interfererende RNA (siRNA) knockdown

Ishikawa celler blev dyrket til ca. 80% konfluens, transficeres derefter med en nontargeting negativ kontrol siRNA (siCTL) eller siRNA’er mod STRA6 (Life Technologies) ved 30 nM koncentration under anvendelse af lipofectamin RNAiMAX ifølge producentens anbefalinger (Life Technologies). Transficerede celler blev behandlet med enten DMSO eller 6 uM fenretinid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) opløsning 60 timer efter transfektion. Celler blev opsamlet efter 24 timers behandling og forarbejdet til realtids-PCR eller Western blotting.

Cellelevedygtighed assay

Prestoblue (Life Technologies) cellelevedygtighed reagens blev anvendt til estimering af cellernes levedygtighed. Prestoblue er en resazurin – baseret membran permeabel løsning, efter reduktion, omdannes til resorufin, et rødt fluorescerende forbindelse, der kan måles kvantitativt at bestemme cellelevedygtighed [33]. Ishikawa-celler blev podet (5 x 10

3 celler pr brønd) i plader med 96 brønde og dyrket i 24 timer ved 37 ° C. Cellerne blev derefter serum sultet i 16-18 timer [34], [35]. Celler blev derefter dyrket i frisk medium og behandlet med forskellige koncentrationer af fenretinid og megestrolacetat (Sigma-Aldrich) i 24 timer ved 37 ° C. Cytotoksiciteten af ​​fenretinid og megestrolacetat blev målt ved tilsætning af Prestoblue reagens ifølge producentens anvisninger. Fluorescenssignalet blev målt for at bestemme cellernes levedygtighed på Synergy HT pladelæser fra Bio-Tek med KC4 3.4 software ved 530/590 nm.

Western blot-analyse

Ishikawa-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af fenretinid og megestrolacetat (Sigma-Aldrich) eller vehikel, lyseret i RIPA [50 mM Tris, pH 8.0,150 mM natriumchlorid, 1,0% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS (natriumdodecylsulfat ) suppleret med protease og phosphataseinhibitorer (Sigma-Aldrich). Klare lysater blev opnået efter centrifugering ved 14.000 rpm i 15 minutter, og proteinkoncentrationen blev målt ved anvendelse af Micro BCA kit (Thermo Scientific, Rockford, Illinois). Proteiner blev løst ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamid gelelektroforese på NOVEX NuPAGE 4-12% Bis-tris geler (Life Technologies) og overført til polyvinylidendifluorid membraner (Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ). Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i en time ved stuetemperatur og hybridiseret med specifikke primære antistoffer for total og spaltes PARP [poly (ADP-ribose) polymerase], Caspase-9 spaltet Caspase-9 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) natten over ved 4 ° C. Proteinbåndene blev visualiseret under anvendelse af et forøget kemiluminescens-reagens ECL Super Signal West Femto detektion kit (Thermo Scientific) efter hybridisering med en peberrodsperoxidase-konjugeret gede-anti-kanin sekundært antistof (Cell Signaling Technology). Membranerne blev strippet med Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) og undersøgt med beta-actin (β-actin) antistof (Sigma-Aldrich) for protein lastning kontrol.

Fast time PCR

Totalt RNA blev isoleret fra Ishikawa-celler under anvendelse Quiagen RNAeasy Kit (Quiagen, Valencia, CA) ifølge fabrikantens protokol. Renheden og koncentrationen af ​​ekstraheret RNA blev bestemt under anvendelse af ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop). 1 pg af RNA blev revers-transkriberet med Q-script cDNA super mix (Quanta Biosciences Inc., Gaithersburg, MD, USA) i overensstemmelse med producentens protokol. Real-time kvantitativ PCR blev udført med ABI 7900 Sequence Detection og ABI Power Syber Green genekspressionssystemer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). MRNA blev kvantificeret under anvendelse af kommercielt tilgængelige specifikke primere til STRA6, CRBP1, CYP26A1, CRABP2, FABP5, RAR-α, RAR-β, og RXR-α (Quiagen) og husholdning genet GAPDH (Integrated DNA Technologies, Chicago, IL). Den fold ændring i udtrykket blev beregnet ved hjælp af den ΔΔCt metoden [36] med GAPDH som en intern kontrol. PCR’er blev udført på et ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) i 40 cykler (95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 minut) efter 10 minutters inkubering ved 95 ° C.

xenograft mus model

Female CD-1 atymiske nøgne mus (4-5 uger gamle, Charles River Laboratories International Inc., Wilmington, MA) blev opretholdt under specifikke patogenfrie betingelser baseret på de retningslinjer, som den Northwestern University, Institutional Animal Care og brug Udvalg. Mus var ovariektomerede, og, en estradiol pellet (1,7 mg /pellet, 60 dage frigivelse) (Innovative Research of America, Sarasota, Florida) blev implanteret subkutant. Ishikawa humane endometriske cancercelle-line-celler (2 x 10

6 /0,1 ml) blev suspenderet i 01:01 PBS /Matrigel (BD Biosciences, San Jose, California) og injiceret subkutant i både højre og venstre flanker af hver mus tumorer fik lov til at vokse og når tumorerne nåede 50-150 mm

3 (der opstod i omkring 2 uger), blev musene inddelt i 4 grupper: 1. køretøj, 2. megestrolacetat, 3 fenretinid (Tocris Bioscience, Bristol , UK) og Fenretinid + megestrolacetat. Megestrol actate pellets (21 mg, 21-dages release for 1 mg /dag) (Innovative Research of America) blev implanteret subkutant. Musene blev givet 120 mg /kg af fenretinid ved et volumen på 10 ml /kg legemsvægt, 5 gange om ugen i 3 uger via intraperitoneal injektion. Kontrolmus blev behandlet på lignende måde med i.p. injektioner af 5% ethanol i 0,9% natriumchloridopløsning indeholdende 1,65 mg /ml bovint serumalbumin. Der var ingen tegn på lokal eller systemisk toksicitet efter intraperitoneal behandling med den indgivne dosis [37] (Fig. S2). Mus blev vejet og tumorstørrelser blev målt med passere to gange om ugen gennem hele behandlingsforløbet. Musene blev aflivet med CO2-kvælning og tumorerne blev reseceret. Tumorvæv fra mus blev vejet, derefter indlejret i paraffin blok og underkastet immunohistokemi eller hematoxylin og eosin (H 0,05 blev anvendt som kriterium for statistisk signifikans

Resultater

Fenretinid nedsætter cellernes levedygtighed og øger apoptose af endometriecancer Ishikawa celler

in vitro

behandlingen af ​​Ishikawa celler med fenretinid signifikant hæmmede celle levedygtighed og øget apoptose i en dosisafhængig måde (fig.1A 1D). Fenretinid ved 6 til 20 uM forårsagede et fald på 38% til 99% i cellelevedygtighed og stigning i apoptose som tydeligt ved stigninger i proteinniveauer af spaltet caspase -9 og spaltes-PARP sammenlignet med optaget fra en bil behandlede celler. Fenretinid viste sig at være toksisk for cellerne ved doser højere end 2 pM-koncentration efter 24 timers behandling (data ikke vist). For at bestemme virkningerne af Megace blev Ishikawa-celler behandlet med Megace alene i forskellige koncentrationer og i kombination med fenretinid i 24 timer og cellelevedygtighed apoptose blev vurderet. Megace havde ikke nogen effekt på Ishikawa cellelevedygtighed og apoptose op til 10 uM såvel alene som i kombination med 6 uM fenretinid (figur 1B, 1C 1E). Disse resultater tyder på, at fenretinid reducerer cellelevedygtigheden og inducerer apoptose i Ishikawa celler

in vitro

gør det til en lovende kandidat til at teste dens effektivitet

in vivo

.

Ishikawa celler blev behandlet med DMSO (Veh), (a) 2-20μM fenretinid, (B) 0.1-10μM Megace eller (c) en kombination af Megace + fenretinid i 24 timer og cellelevedygtighed blev målt under anvendelse af Prestoblue reagens. Data er præsenteret som gange ændring i relative fluorescensenheder fra DMSO behandlede prøver og repræsenterer middelværdien ± SEM for 4-5 uafhængige forsøg. En stjerne angiver en signifikant (*

P

0,05) fald i cellelevedygtighed i Ishikawa-celler behandlet med fenretinid sammenlignet med DMSO-behandlede gruppe. (D) Ishikawa-celler blev behandlet med DMSO (Veh) eller 1-10μM fenretinid som inducerede apoptose i en dosisafhængig måde inden for 24 timer af behandlingen som vist ved stigninger i spaltet caspase-9 og spaltede-PARP-proteinniveauer ved Western blotting. (E) Behandlingen af ​​Ishikawa celler med Megace havde ikke nogen effekt på disse markører for apoptose. Actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Blots er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter.

Fenretinid udøver en stigning i retinol optagelse via STRA6 og CRBP1

For at bestemme virkningen af ​​fenretinid på retinsyre signalvejen i endometriecancer, real time RT PCR blev udført. MRNA-niveauer af STRA6, CRBP1 og CYP26A1 steg betydeligt med fenretinid behandling [Fig.2 (A-C)]. MRNA’et af disse gener forblev uændret med Megace behandling alene eller i kombination med fenretinid [Fig.3 (A-C]. Imidlertid fenretinid havde ikke nogen effekt på mRNA-niveauerne af nukleare receptor gener (RAR-a, RAR-p , RXR- α), eller de intra-cytoplasmatiske bærerproteiner CRABP2 og FABP5 (fig S1).

Totalt RNA blev isoleret fra Ishikawa-celler behandlet med DMSO (Veh) eller 0.25-10μM fenretinid i 24 timer og ekspression af gener involveret i retinol optagelse blev målt ved RT-qPCR. data er præsenteret som gange ændring i relativ mRNA-ekspression af Fenretinid behandlede celler fra DMSO behandlede prøver celler og repræsenterer middelværdien ± SEM af 3 uafhængige forsøg. en stjerne angiver en signifikant ( *

P

0,05) forøgelse i mRNA-ekspression af (A) STRA6, (B) CRBP1 og (C) CYP26A1 gener i Ishikawa-celler behandlet med fenretinid sammenlignet med DMSO-behandlede gruppe

Totalt RNA blev isoleret fra Ishikawa-celler behandlet med DMSO (Vehicle), Megace, fenretinid og en kombination af Megace og fenretinid begge. Relative mRNA udtryk for (A) STRA6, (B) CRBP1 og (C) CYP26A1 blev analyseret med RT- qPCR. Data er præsenteret som gange ændring i relative udtryk for mRNA fra DMSO behandlede prøver og repræsenterer middelværdien ± SEM for 5 uafhængige eksperimenter. En stjerne angiver en signifikant (*

P

0,05). Stigning i mRNA-ekspression af disse gener i Ishikawa celler behandlet med fenretinid eller Megace + Fenretinid celler sammenlignet med DMSO behandlede celler

STRA6 knockdown påvirkninger Fenretinid medieret apoptose i endometrie Ishikawa celler

STRA6 er den primære celleoverfladen retinol receptor i cellerne er ansvarlige for retinol optagelse. At fastslå, hvorvidt STRA6 er afgørende for fenretinid induceret apoptose i Ishikawa-celler, blev endogen STRA6 udtryk slået ned ved hjælp af siRNA. Som vist i fig. 4A, kunne vi markant knockdown (76%) udtryk for STRA6 i Ishikawa-celler. Knockdown af STRA6 ophæver fenretinid apoptose i Ishikawa-celler (fig. 4B) som vist ved formindskede niveauer af spaltet caspase-9 og spaltes PARP når STRA6 er tavshed. Disse resultater kraftigt støtte vores hypotese, at STRA6 er afgørende for fenretinid induceret apoptose i endometrie Ishikawa celler.

Ishikawa celler blev transficeret med 30 nM siCTL (nontargeting negativ kontrol siRNA) eller siSTRA6. (A) Samlet RNA blev isoleret fra ubehandlede Ishikawa-celler ved 3 på hinanden følgende dage post transfektion og ekspression af STRA6 genet blev målt ved RT-qPCR. Data er præsenteret som gange ændring i relativ mRNA ekspression af STRA6 i siSTRA6 transficerede celler og siCTL transficerede celler og repræsenterer middelværdien ± SEM for 5 uafhængige eksperimenter. En stjerne angiver en signifikant (*

P

0,05) fald i mRNA ekspressionen af ​​STRA6. (B) Transficerede Ishikawa-celler blev behandlet med DMSO (Veh) eller 6 um fenretinid i 24 timer efter og immunoblotting for apoptotiske markører blev udført. STRA6 genekspression knockdown inhiberet fenretinid induceret apoptose i Ishikawa-celler som vist ved fald i proteinniveauer af spaltet caspase-9 og spaltes-PARP. Blots er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter

Fenretinid hæmmer tumor progression:. En mus xenotransplantationsmodel

Første

in vitro

observationer foreslog, at anticancer aktivitet fenretinid kan opstå fra sit potentiale til at fremme apoptose i tumorceller. For at undersøge denne antitumoraktivitet fenretinid

in vivo

, blev musene indpodet med subkutane tumorer. Fenretinid behandling undertrykte signifikant tumorudvikling i mus sammenlignet med vehikel-behandlede mus (figur 5B) baseret på gange ændring i tumorstørrelse. Faldet i tumorvolumen var også signifikant i Megace behandlet samt Megace + fenretinid behandlede (figur 5B) sammenlignet med optaget fra en bil behandlede mus. Desuden mus syntes at tolerere Fenretinid og Megace behandlinger uden synlige symptomer på toksicitet eller alvorlig tab af kropsvægt sammenlignet med vehikel-behandlede gruppe (figur S2).

(A) Ovariektomiserede nøgne CD-1-hunmus blev injiceret med Ishikawa-celler i både flankerne og østrogen piller blev implanteret. Tumorer fik lov til at vokse i 2 uger. Efter 2 uger af tumoretablering, blev musene behandlet med vehikel (20 mus), Megace (19 mus), fenretinid (21 mus) eller Megace + fenretinid (20 mus) og tumorerne blev høstet efter 3 ugers behandling. (B) Billeder af repræsentative udskårne tumorer fra hver gruppe. (C) Den fold ændring i tumor volumen (fra dag 1 behandling til dag offer) køretøj, fenretinde, meagce eller begge fenretinid + Megace behandlede mus blev plottet efter 3 ugers behandling. Data er vist som middelværdi ± min til max på to forskellige eksperimenter. P-værdier indikerer en signifikant inhibering med fenretinid, Megace eller Megace + fenretinid både på tumorvækst (* P 0,05). Det største fald i tumorstørrelse blev observeret i mus behandlet med fenretinid alene.

Behandling med fenretinid nedsætter spredning og øger apoptose i mus tumorer

Effekten af ​​fenretinid på celledeling og apoptose blev vurderet ved immunohistokemi og H

in vivo

.

Udskårne tumorer blev fikseret i formalin, paraffin indlejret og sektioneret. (A) H & E-farvning og immunhistokemisk farvning med anti-Ki67-antistof (proliferationsmarkør) og anti-spaltet caspase -3 (apoptose markør) af hele sektioner af tumorxenotransplantater. (B) Billederne er på 100

μ

m.

Diskussion

Fenretinid allerede har vist sig at være en effektiv terapeutisk og kemoforebyggende alternativ i bryst og æggestokke cancere [17]. Nærværende undersøgelse viser brugen af ​​fenretinid som en mulig anti tumor middel mod endometriecancer ved hjælp af både

in vitro

in vivo studier

. Fenretinid faldt human endometriecancer Ishikawa cellelevedygtighed ved at inducere apoptose som demonstreret ved en stigning i celledød markører (spaltet caspase-9 og spaltes PARP). Det inhiberede også tumorvækst

in vivo

, som ses ved et fald i celleproliferation (Ki67) og en stigning i apoptose (spaltet caspase-3) hos mus tumorxenoplantater. Derudover har vi vist, at antitumorvirkninger af fenretinid medieres af en stigning i retinol optagelse, med en øget ekspression af STRA6 set i Fenretinid behandlede celler.

For nylig undersøgelser fra Carrera et al har vist den rolle, STRA6 i p53 medieret celledød responser i normale og cancerceller, som svarer til vores forskningsresultater og fundet at være uafhængig af den nedstrøms aktivering af RA-mål [38]. De demonstrerede, at transfektion med STRA6 inducerede en væsentlig mængde af apoptose i RA følsomme ovariecancerceller (specifikt PA-1 og A1847) samt i RA ufølsom HCT116 colon cancerceller. Derudover fandt forfatterne, at STRA6 transfektion inducerede både en pro-apoptotisk og tumor undertrykkende indvirkning. Disse resultater, sammen med resultaterne af vores undersøgelse, tyder på, at STRA6 induktion kan have en potentiel rolle i tumor undertrykkelse.

Forrige litteratur antyder en interaktion i den vellykkede behandling af kræftceller med kemoterapeutiske stoffer, og deres potentiale til at udløse apoptotiske veje. Det er stadig ikke klart, om de biologiske virkninger af kemoterapeutiske midler er medieret af en direkte interaktion med nukleare retinoidreceptorer eller via hidtil ukendte nukleare receptor-uafhængige pathways [39]. Vi fandt, at behandling af Ishikawa-celler med fenretinid resulterede i cellulær apoptose via induktion af caspase-9, caspase -3 og PARP. Induktionen af ​​disse apoptotiske veje er også blevet set i brystcancer [17] og ovariecancer [40]. Interessant nok har et fase III bryst forebyggelse af kræft forsøg i præmenopausale kvinder vist, at behandling med fenretinid faldt incidensen af ​​sekundære bryst maligniteter og ovariecancere [41].

I modsætning til vores nuværende undersøgelse, andre undersøgelser har vist, at RA-analoger kan også fungere ved at aktivere nukleare receptorer. Konkret blev Ishikawa celler spredning faldet og apoptose blev induceret via RA signalering involverer RAR /RXR aktivering [8].

Gestagener har længe været anvendt i reproduktive alderen kvinder, der ønsker at bevare deres fertilitet, samt i avanceret og tilbagevendende endometriecancer sager, som ikke kan behandles med anticancer midler, men 30% eller flere patienter med endometriecancer udviser modstand mod hormonbehandlinger, der begrænser brugen af ​​progestin terapi [42]. I den foreliggende undersøgelse, Megace alene inducerede ikke nogen apoptose i vores endometriecancer model, heller ikke forstærke anti- tumor aktivitet fenretinid

in vitro

eller

in vivo

.

begrænsningerne af den foreliggende undersøgelse, er brugen af ​​enkelt musemodel og anvendelsen af ​​dyrkede endometriske Ishikawa-celler i stedet for primære endometriecancer-celler. Brug af primær kultur er vanskelig på grund af den manglende evne til at vokse primære cancerceller uden stromale faktorer. Yderligere undersøgelser er berettiget til at etablere antitumor kapacitet fenretinid i forskellige endometriecancer cellelinjer og tumor musemodeller.

Som konklusion har vi demonstreret, at fenretinid nedsætter cellelevedygtigheden, øger apoptose, og forårsager et fald i tumorstørrelse. Vi mener, at fenretinid induceret apoptose på grund af en stigning i retinol optagelse, specielt ved at øge genekspression af STRA6. Vi mener, at denne undersøgelse er blandt de første til at demonstrere, at fenretinid har anti-tumor potentiale mod endometriecancer. Vi mener, at der er behov for fremtidige prækliniske og kliniske forsøg for at validere sit potentiale som en ny mulig terapeutisk kandidat til behandling af endometriecancer.

Støtte Information

Figur S1.

Behandling af Ishikawa-celler med fenretinid på 0,25-10

μ

M koncentrationer i 24 timer ændrede ikke ekspressionen af ​​retinsyre nuklear receptor gener. Dataene er repræsentative for middelværdier ± standardafvigelse af tre forskellige eksperimenter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0110410.s001

(TIF)

Figur S2. Salg Behandlinger med enten fenretinid eller Megace har nogen effekt på mus kropsvægt. Kroppen vægte blev målt fra Vehicle behandlet eller narkotika behandlede grupper af mus to gange om ugen under hele eksperimentet rime

doi:. 10,1371 /journal.pone.0110410.s002

(TIF)