PLoS ONE: Cell Stivhed er en biomarkør for metastatiske potentiale ovariecancerceller

Abstrakte

metastatiske potentiale af celler er en vigtig parameter i udformningen af ​​optimale strategier for den personlige behandling af cancer. Brug af atomic force mikroskopi (AFM), viser vi, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser foretaget i andre typer af epitelcancer, at ovariecancerceller er generelt blødere og vise lavere iboende variabilitet i celle stivhed end ikke maligne ovarieepitelceller. En detaljeret undersøgelse af meget invasive æggestokkene cancerceller (HEY A8) i forhold til deres mindre invasive parentale celler (HEY), viser, at formbarhed er også en nøjagtig biomarkør for metastatisk potentiale. Sammenlignende genekspression analyser viser, at den reducerede stivhed af meget metastatiske HEY A8-celler er associeret med actin cytoskeleton remodeling og mikroskopisk undersøgelse af actin fiberstruktur i disse cellelinier er i overensstemmelse med denne forudsigelse. Vores resultater viser, at celle stivhed kan være en nyttig biomarkør til at vurdere den relative metastatiske potentiale æggestokkene og måske andre typer kræftceller

Henvisning:. Xu W, Mezencev R, Kim B, Wang L, McDonald J, Sulchek T (2012) Cell Stivhed er en biomarkør for metastatiske potentiale æggestokkene Cancer Cells. PLoS ONE 7 (10): e46609. doi: 10,1371 /journal.pone.0046609

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: April 21, 2012; Accepteret: September 4, 2012; Udgivet: 4 oktober 2012

Copyright: © Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne tak NSF (projekt nummer cbet-0.932.510) til finansiel støtte til dette projekt. Forfatterne takker også præsidentens Undergraduate Research Award (PURA) program og Petit Scholars Program på Georgia Tech for at yde støtte til BK. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den mekaniske integritet celler reguleres af et dynamisk netværk af strukturelle, krydsbinding, og signalmolekyler [1]. Derfor kan ændringer i mekaniske egenskaber af individuelle celler afslører vigtige oplysninger om ændringer i disse net. Undersøgelser af en række sygdomme, der anvender forskellige eksperimentelle teknikker har vist, at abnormiteter i de elastiske egenskaber af celler er forbundet med sygdommen patogenese og progression [2], [3], [4], [5], [6], [7] [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. For eksempel invasive tumorceller mekanisk blødgøre og ændre deres vedhæftning til ekstracellulær matrix, hvilket forbedrer deres evne til at undslippe den primære tumor [5], [17], [18]. Målinger af cancerceller stivhed, kvantificeret af Youngs modul, har vist en stærk sammenhæng mellem celle deformerbarhed og celle malignitet [5]. Tilsvarende blev stivheden af ​​metastatisk cancer celler isoleret fra de pleurale væsker brystkræftpatienter rapporteret at være mere end 70% lavere, med en standardafvigelse over fem gange smallere, end godartede reaktive mesotelceller [3].

fordelingen af ​​actin-netværket spiller en vigtig rolle ved bestemmelsen af ​​de mekaniske egenskaber af enkelte celler [19], [20], [21]. Som celler omdanne fra ikke-maligne til cancerøse tilstande, deres cytoskeletale strukturændringer fra en organiseret til en uregelmæssig netværk, og denne ændring reducerer efterfølgende stivheden af ​​enkeltceller [5], [22]. Undersøgelserne af mekaniske egenskaber af kræftceller diskuteret ovenfor indebærer, at ændring af stivhed af enkelte celler kan indikere tilstedeværelsen af ​​malignitet [15], [16], [23], [24].

Behovet for effektiv biomarkører for sygdomme er særlig vigtigt i tilfælde af ovariecancer, som er den mest dødbringende af gynækologiske cancere. Kræft i æggestokkene blev rangeret femte blandt førende årsager til kræft dødsfald i amerikanske kvinder i 2007, og dens 5 års overlevelse var 46% for alle tilfælde diagnosticeret inden 1999-2005 [25]. På grund af den manglende adgang til pålidelig screening i klinisk praksis og asymptomatisk kurs gennem tidlige stadier af sygdommen, er de fleste af æggestokkene kræfttilfælde (68%) diagnosticeret som metastatisk sygdom med dårlig overlevelse [26].

I denne undersøgelse af de mekaniske egenskaber af celler fra flere forskellige ovariecancer cellelinjer og ikke-maligne immortaliserede æggestokkene overflade epithelceller (IOSE), viser vi, at celle stivhed ikke kun adskiller ovariecancerceller fra ikke-maligne celler, men også kan skelne mere tumorgene /invasive kræftceller fra mindre tumorigene /invasive typer. Vores resultater viser, at måling af celle stivhed æggestokkene og måske andre typer kræftceller ikke alene kan bidrage til en bedre forståelse af de fysiske og molekylære mekanismer bag tumor progression, men kan også tjene som et nyttigt klinisk redskab i vurderingen af ​​metastatisk potentiale .

Materialer og metoder

æggestokkene cellelinje vækst og Sample Preparation

Immortaliserede æggestokkene overflade epitelceller (IOSE) blev generøst tilvejebragt af Dr. N. Auersperg (University of British Columbia, Vancouver, Canada) og dyrket i 199/105-medium (01:01) suppleret med 15% føtalt bovint serum (FBS, Atlanta Biologicals, Atalanta, GA) og 1% antibiotisk-antimycotisk opløsning (Mediatech-Cellgro, Manassas, VA ). Den ovariecancer HEY og HEY A8 cellelinjer blev tilvejebragt af Dr. G. Mills (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX) og dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% FBS og 1% antibiotisk-antimycotisk opløsning (R10-medium). Den kræft i æggestokkene OVCAR-3 og OVCAR-4 cellelinjer blev indkøbt fra Developmental Therapeutic Program (DTP) af National Cancer Institute (NCI) (Bethesda, MD). Før AFM eksperimenter blev celler udpladet i en Fluorodish (Verden Precision Instruments, Sarasota, FL) med en indledende tæthed på 10.000-20.000 celler /cm

2.

Atomic force mikroskopi

Vi har udført atomic force mikroskopi (AFM) mekaniske målinger [27], [28] på enkelte ovarieepitelceller. AFM anvendt i vores eksperimenter er MFP-3D (fra Asyl Research, Santa Barbara, CA) med en kombineret Nikon Ti inverteret optisk mikroskop (Nikon, Melville, NY), der anvendes til optisk justere proben til cellerne. De sonder anvendt i denne undersøgelse var MCST-AUHW (Bruker, Camarillo, CA) med en nominel fjederkonstant på 0,03

N-service /

m

. For at forenkle kontakt geometri og minimere den laterale stamme af prøven under fordybning, er cantilever spids modificeret ved at fastgøre en almindelig silica mikrosfære med en diameter 4,7 um. Målinger blev udført i celledyrkningsmedier ved stuetemperatur, med celler udpladet på glasset bunden af ​​Fluorodish. For at eliminere forstyrrende virkninger af nærliggende celler på cytoskeleton arrangement og morfologi blev enkelte celler målt.

Før celle målinger blev cantilever kalibreret på glasset bunden af ​​Fluorodish ved hjælp af den termiske vibrationer metoden [29] med den resulterende termiske spektrum forsynet med Lorentzian funktion til at bestemme fjederkonstanten. Cellerne blev indrykket omtrent over perinukleære region individuelle celler. Indrykningen dybde blev valgt til at være mindst 1 um for bedre at simulere deformationer, som forekommer fysiologisk. Kraften versus indrykning Kurverne fra hver måling blev analyseret ved anvendelse af en Hertz kontakt model [30], [31] til opnåelse af Youngs modul på hver celle. En skitse af den eksperimentelle oprettet er vist i fig. 1

en

. Scanningelektronmikroskopi af beaded spids anvendt i dette forsøg er vist i fig. 1

b

. Eksempler på optiske billeder opnået under celle fordybning er vist i fig. 1,

c

-.

g

(A) Skitse af målinger på celler med AFM,

δ

er indrykning, (B) SEM billede af beaded spids, stivhed målinger af enkelte celler med AFM til (C) IOSE, (D) OVCAR-4, (E) HEY, (F) OVCAR-3 og (G) HEY A8-celler. Samme cantilever blev anvendt; arm cantilever har en bredde på 20 pm og fungerer som en skala bar.

Fluorescens Imaging og analyse af F-actin

Vi filmede det mærkede F-actin netværk af hver cellelinie ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Celler blev dyrket på et dækglas til en densitet på 5000 celler /cm

2. Dækglasset med udpladede celler blev anbragt i en brønd i en 6-brønds plade med 2 ml celledyrkningsmedier. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C natten over og derefter farvet med fluorokromkonjugerede phalloidin. Cellerne blev farvet ved første fastsættelse med 1 ml 4% formaldehyd i PBS (pH 7,4) i 10 minutter og permeabilisering med 1 ml 0,2% TX-100, blokering med 1% BSA i 20 minutter og inkubering i én time med 1:20 Alexa Fluor 546 phalloidin (Life Technologies, Grand Island, NY) i 1% BSA. Alle trin under farvningen processen blev udført ved stuetemperatur i et mørkt rum. Efter farvning blev cellerne klemt inde mellem dækglas og et objektglas, monteret med forlænge Guld og forseglet med neglelak. Flere billeder af hver cellelinje blev taget med et Nikon Ti mikroskop (Nikon, Melville, NY) med TRITC excitation /emission filter sæt. Analysen var begrænset til enkelte celler, som ikke var i kontakt med andre celler.

De strukturelle karakteristika af actin-netværket blev analyseret ved at kvantificere en orientering parameter for actinfilamenter. En to-dimensionelle Fast Fourier Transform (FFT) blev anvendt til de originale fluorescens billeder ved hjælp af MATLAB rutiner (The MathWorks, Natick, MA). Fra den transformerede billede, custom MATLAB koder beregnet den vinkelmæssige amplitude af FFT som summen af ​​kvadratet af FFT komponenter, hvorfra orienteringen fordeling af actinfilamenter blev bestemt som en funktion af vinkel. De matematiske algoritmer beregner funktionen orientering fordelingen var baseret på dem, der tidligere er rapporteret i litteraturen [32]. Fremgangsmåden er illustreret i fig. S1 i støttemateriale med en repræsentant fluorescens billede af en IOSE celle.

Migration og Invasion Analyser

CytoSelect 24-brønd celle migration og invasion assay kit (Cell Biolabs, San Diego, Californien ) blev anvendt ifølge producentens instruktioner. For migrationen assay 1,5 x 10

5-celler i serumfrit DMEM /F12-medium indeholdende 0,5% BSA, 2 mM CaCl

2 og 2 mM MgCl blev indlæst

2 i individuelle uovertrukne inserter med omtrent 8 um porestørrelse. Indsatsene blev anbragt i en 24-brønds plade indeholdende RPMI-1640-medium suppleret med 10% FBS. Efter 3 timers inkubation ved 37 ° C i befugtet luft med 5% CO

2, de celler, der migrerede til undersiden af ​​inserterne blev frigjort, lyseret og kvantificeret under anvendelse CyQuant GR fluorescerende farvestof på en pladelæser ved 480 nm /520 nm (Synergy 4, BioTek, Winooski, VT). Invasion assays blev udført på en identisk måde med 32 h inkubation under anvendelse basalmembranmatrix-belagte skær. Alle assays blev udført tredobbelt med en indledende tidsforløb undersøgelse udført for at nå væsentlig transmigration.

Microarray og Pathway Enrichment Analyse

RNA blev ekstraheret fra to ikke-konfluerende kulturer af HEY og HEY A8 celler dyrket i R10-medium under anvendelse Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosciences, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner og RNA integritet blev verificeret ved anvendelse af et Bioanalyzer RNA Pico Chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). mRNA blev mærket under anvendelse af IVT Labeling Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA) og biotin-mærket mRNA blev hybridiseret på GeneChip Probe Arrays U133 Plus 2.0 (Affymetrix). Affymetrix.CEL filer blev behandlet ved hjælp af Affymetrix Expression Console Software version 5.0 ved hjælp af RMA 3′-udtryk workflow. De 4.746 funktioner med laveste 10% -værdier på logaritmen af ​​signalintensiteter på tværs af alle 4 chips blev fjernet, og de resterende 49,929 træk blev analyseret under anvendelse Betydning Analyse af microarrays (SAM) version 4.0 [33] med følgende parametre: Svartype: to-klasse uparrede; Test statistik: T-statistik; Antallet af permutationer: 500; Data i log2 skala; Nr median centrering. Gener blev rapporteret som differentielt udtrykt mellem HEY og HEY A8 klasser, hvis de mødte følgende kriterier:. (I) False Discovery Pris = 1,1% og (ii) absolut fold ændring (FC) ≥1.5

Biologiske fortolkninger af differential genekspression data blev udført af sti berigelse analyse ved hjælp MetaCore 5.2 (GeneGO, St Joseph, MI). Markant forstyrrede veje og netværk blev identificeret ved kortlægning opreguleret og nedreguleret gener (kombineret og individuelt) på GeneGO kanonisk pathway kort (samling af manuelt kurateret signalering og metaboliske veje) og GeneGO proces netværk (manuelt kurateret netværksmodeller af de vigtigste cellulære processer ) [34].

GeneGO kanoniske pathway kort og proces netværk blev rangordnet efter deres relevans til indgangen sæt af gener, der bruger p-værdier beregnet ud fra en hypergeometriske fordeling. Multiple korrektion test blev udført ved hjælp af Falsk Discovery Rate med den adaptive tærskel indstillet til at tillade mere end en vej /netværk fejlagtigt forudsagt som væsentligt beriget.

For yderligere at udvide biologiske fortolkning af forskellen genekspression data, den topologiske betydning analyse (TSA) af genekspression profil blev udført ved hjælp af online-værktøj, som GeneGO Inc (https://topology.genego.com/zcgi/topology_scoring.cgi). Dette værktøj maps differentielt udtrykt gener onto en GeneGO proprietær database af protein-protein interaktioner og identificerer proteiner, der optager topologisk betydelige positioner i forhold til differentielt udtrykte gener [35], [36]. Topologisk betydelige gener (p 0,01) blev identificeret for alle gener opreguleret i HEY A8 celler i forhold til HEY celler ved hjælp af “transkriptionelle aktivering stier fra alle noder” algoritme og efterfølgende kortlagt til GeneGO kanoniske pathway kort som beskrevet ovenfor

.

qPCR

Valgte gener (PRKAA2, TWF1 og MYLK), identificeret ved microarray analyse som betydeligt differentielt udtrykte mellem HEY A8 og HEY celler, valideret ved anvendelse forhåndsudformede TaqMan® genekspression analyser (Life Technologies, Grand Island , NY). RNA blev ekstraheret fra 3 ikke-konfluerende kulturer af HEY og HEY A8 celler (Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit) og revers-transkriberet og amplificeret under anvendelse Bifald 3′-Amp-system (NuGen Technologies, Inc., San Carlos, CA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. qPCR assays blev udført for hvert gen og hver prøve i 4 replikater bruger termiske cykelforhold anbefales til TaqMan® Gene Expression Master Mix og fold ændre værdier mellem Hey A8 og Hey celler blev bestemt ved anvendelse af 2

-ΔΔCt metode bruger GAPDH gen som intern kontrol.

statistisk analyse

Samlet statistisk signifikans af forskelle i gennemsnitlig stivhed blandt celletyper blev testet ved hjælp af Kruskal-Wallis test. Betydningen af ​​forskelle mellem alle par af celler blev testet under anvendelse Dunn post test. Betydningen af ​​forskelle i migration og invasion blandt IOSE, HEY og HEYA8 celler blev testet af ANOVA efterfulgt af Tukey test for parvise sammenligninger (* p 0,05; ** p 0,01; *** p. 0,001 Kruskal-Wallis test, ANOVA og alle indlæg blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-version 5.02 til Windows (GraphPad Software, San Diego, CA). Foreninger mellem celle stivhed og celle invasiv, celle stivhed og celle vandrende egenskaber, og celle stivhed og graden af ​​co-tilpasning af F-actin blev testet ved hjælp af Pearsons produkt-moment korrelation og Spearman rang korrelation og udtrykt som korrelationskoefficienter (r og ρ, henholdsvis). korrelation analyse blev udført ved hjælp af den gratis statistisk software R [37].

Resultater og diskussion

Cell Stivhed er en biomarkør for metastatisk (migrerende /invasiv) Potentielle

Repræsentative kraft-indrykning kurver opnået fra mekanisk sondering af de enkelte celler er plottet i fig. 2

en

. Hver kurve repræsenterer den påførte kraft nødvendig for at indrykke en individuel ovarie celle fra IOSE og HEY cellelinier. Proben i kontakt med cellen ved en fordybning på 0 um. Da hældningen ved et punkt af hver kraft-indrykning kurve er relateret til celle stivhed, variabilitet af skråninger for hver probes celle i en given cellelinje viser variabiliteten af ​​stivhed blandt individuelle celler fra den samme kultur. Generelt kurver svarende til ikke-maligne IOSE celler har større skråninger end dem, der svarer til ovariecancer HEY-celler og er derfor stivere.

(A) Box-and-whisker plots af stivhed af enkeltceller til anden celle linjer, percentiler er 10%, 25%, 50%, 75% og 90%, den indsatte viser de repræsentative kraft kurver IOSE og HEY. Samlet forskel blandt midler er signifikant (p-værdi 2,2 × 10

-16, Kruskal-Wallis); parvise forskelle er væsentlige mellem IOSE og HEY, HEY A8 og OVCAR-3 celler, mellem HEY A8 og HEY celler og mellem HEY A8 og OVCAR-4 celler (p 0,05, Dunns indlæg test); (B) Migration og invasion test for IOSE, hey og HEY A8 celler. F (480/520) er en fluorescensintensitet ved 480 nm excitation og 520 nm emission, som er proportional med antallet af migrerende eller invaderende celler.

Kraften kurver blev analyseret med en Hertz kontakt model at bestemme den tilsvarende Youngs modul på individuelle celler. Vi bestemmes Youngs modul for forskellige ovarieepitelceller cellelinjer, herunder ikke-maligne IOSE og en bred vifte af kræft cellelinier (OVCAR-3, OVCAR-4, HEY, og HEY A8). Fordelingen af ​​Youngs modul af individuelle celler fra forskellige cellelinjer er afbildet i boksen og knurhår plots (fig. 2

en

). IOSE demonstrerede højere middel stivhed end nogen af ​​de ovariecancere. Den overordnede forskel mellem cellelinjer var signifikant (p 2,2 × 10

-16) med følgende par viser signifikante forskelle (p 0,05): IOSE vs OVCAR-3, IOSE vs HEY, IOSE vs HEY A8, OVCAR- 4 vs HEY A8, og HEY vs HEY A8. De gennemsnitlige Youngs moduli og standardafvigelser af disse celler er opsummeret i tabel 1. De ikke-maligne IOSE celler demonstrerede højere iboende variabilitet i celle stivhed end celler fra nogen ovariecancer cellelinie, hvilket er i overensstemmelse med den tidligere rapporterede højere variabilitet i stivhed godartede celler i forhold til brystkræft celler isoleret fra pleurale væsker [3].

især HEY og HEY A8 celler afledt af samme tumor prøven [38] viste betydelige forskelle i stivhed, med HEY A8 celler være mere kompatibelt (fig. 2

en

). Dette fund er signifikant ved, at disse isogene celler også forskellige i deres tumorigenicitet i nøgne mus, hvorved HEY A8-celler er mere tumorigene efter intraperitoneal injektion til nøgne mus [38]. At udforske forholdet mellem mekaniske egenskaber af disse æggestokkene cellelinier og deres metastatiske potentiale, vi undersøgte de vandrende og invasive egenskaber HEY og hey A8 celler i forhold til IOSE bruge

in vitro

analyser. HEY A8 celler udviste den største invasive og vandrende aktivitet efterfulgt af HEY-celler, og de mister kontrollen celler (Fig. 2

b

), hvilket indikerer, at den relative stivhed er omvendt korreleret med indikatorerne for metastatisk potentiale (migration og invasivitet). Disse resultater, som er opsummeret i fig. 3 og tabel 2, er i overensstemmelse med tidligere rapporter forbinder cellulære formbarhed med tumorgenic og metastatisk potentiale [5], [7], [33].

data punkter er udstyret med power lov for klarhed. Fejl barer: standard fejl af midler

genekspressionsprofilering af HEY og HEY A8 Cells Links Øget metastatisk potentiale med Ændringer i Actin-medieret cytoskeletale Remodeling Pathways

Efter at have konstateret. at erhvervelsen af ​​nedsat stivhed i HEY A8-celler i forhold til HEY-celler er korreleret med en stigning i metastatisk potentiale (dvs. cellemigration og invasivitet), udførte vi en komparativ genekspressionsanalyse (mikromatrice) af disse to cellelinjer med henblik på at få indblik i den mulige molekylære grundlag af den erhvervede fænotype.

Brug betydning Analyse af microarrays (SAM) vi identificeret 3.641 differentielt udtrykte funktioner mellem disse cellelinier (File F1) og fastslået, at 1.258 gener var opreguleret og 1.272 nedreguleret i HEY A8 forhold til HEY celler (15 gener viste disharmoniske ændringer i udtryk mellem HEY og HEY A8 celler til redundante probe sæt). Markant beriget GeneGO veje (tabel 3) og proces netværk (tabel 4), der svarer til vores sæt af differentielt udtrykte gener viser, at forskellene mellem HEY og HEY A8 celler omfatter ændringer i mitotisk fase af cellecyklus (spindel montering /kromosom adskillelse, spindel mikrotubuli) , regulering af epitelial-til-mesenkymale overgang (EMT), cytoskelet remodeling, celleadhæsion og regulering af CFTR (cystisk fibrose transmembrane ledningsevne regulator)

Red termometer:. gener transkriptionelt up- reguleret i HEY A8 celler; blå termometer: gener transkriptionelt nedreguleret i HEY A8 celler; gule termometer: proteiner topologisk relevante for sæt up-regulerede gener

(A) IOSE, (B) OVCAR-4, (C) HEY, (D) OVCAR-3 og (E. ) HEY A8.

(A) repræsentant orientering fordelingsfunktion for hver cellelinie, (B) stivhed versus grad af coalignment af F-actin, error søjle repræsenterer standardfejl på middelværdien (SEM).

for yderligere at udforske potentialet biologiske betydning af forskellene i genekspression mellem HEY og HEY A8 celler, vi ansat topologisk betydning analyse (TSA). Anvendelse af denne fremgangsmåde identificerede vi 1.108 unikke Entrez Gene id’er svarende til topologisk relevante proteiner associeret med op-regulerede gener i HEY A8-celler (Entrez gen id’er omdannes til de 1.199 officielle gen symboler er præsenteret i File S2). Markant beriget GeneGO veje for disse topologisk relevante proteiner (360 veje på FDR = 0,26%) tyder betydelige biologiske forskelle mellem HEY og HEY A8 celler, herunder dem, der ikke kunne identificeres på transkriptionel niveau (File S3). En detaljeret gennemgang af ovennævnte resultater er uden for rammerne af dette papir og vil blive præsenteret andetsteds. Her vil vi begrænse vores diskussion til disse ændringer er mest relevante for de observerede forskelle i celle stivhed diskuteret ovenfor.

Den øverste scorer GeneGO vej for topologisk relevante proteiner (File S3) er “TGF, WNT og cytoskeletal remodeling vej “(fig. 4). Denne vej blev også identificeret som væsentligt beriget for gener nedreguleret i HEY A8 celler (tabel 3). Disse resultater viser, at forskelle i stivhed mellem HEY og HEY A8-celler er relateret til cytoskelet remodeling. Vores resultater understøtter tidligere forudsigelser, at grundlaget for reduceret stivhed i forbindelse med kræft [39] og meget invasive celler [40] kan være forbundet med cytoskeletal remodeling. Yderligere støtte for denne konklusion kommer fra TSA som fandt forskellige isophorms af actin-superfamilien topologisk signifikant for gener opreguleret i HEY A8-celler (File S2), samt fra differentiel ekspression analyse, som fandt, at de actin-monomere proteiner CFL2 , TWF1 og PFN1 der regulerer inkorporering af actin monomerer i filamenter [41] er overudtrykt i HEY A8 celler. Overekspression af cofilin-2 (CFL2) forøger filament actin omsætningen efter depolymerisering filamenter ved deres spidse ender [42], mens twinfilin (TWF1) fungerer som en actin-monomer-sekvestrerende protein, der også skærer actinfilamenter at fremme filament demontering

in vitro

og dens hurtige omsætning

in vivo

[43]. Den omstændighed, at myosin let kæde-kinase (MYLK), som fremmer en actin-aktiveret myosin motorisk aktivitet og spændinger generation [44], er betydeligt nedreguleret i HEY A8 celler støtter yderligere rollen af ​​stress fibre i observerede forskel i celle stivhed. Interessant BDM og ML-7, inhibitorerne ifølge MYLK, er tidligere blevet rapporteret at inducere blødgøring af fibroblast-cellelinjer [45]. Phosphorylering af myosin let kæde, stress fiber dannelse og efterfølgende stigning i celle stivhed kan også induceres via RhoA /Rho-kinase pathway [46], som inaktiveres ved cAMP-afhængig proteinkinase (PKA) [47]. Vi fandt, at lovgivningsmæssige (PRKAR2A, PRKAR2B) og katalytisk (PRKACB) subunit gener af PKA er signifikant overudtrykt i HEY A8 forhold til HEY celler tyder PKA-afhængige inaktivering af RhoA /Rho-kinase pathway i HEY A8 celler. qPCR validering af differentiel genekspression data fra microarray eksperiment bekræftede overekspression af PRKAA2 og TWF1 gener med respektive fold ændrer 3,89 og 2,63 og nedsat ekspression af MYLK genet med fold-change -2.0 i HEY A8-celler i forhold til HEY-celler (fig. S2).

Mikroskopiske analyser af kræft i æggestokkene og Control Cells Bekræft, at actin-medieret cytoskeletale remodeling er associeret med Ændring i metastatisk potentiale

Da vores molekylære analyser viste, at actin-medieret cytoskeletal remodeling kan være en stor bidragyder til de observerede forskelle i celle stivhed mellem HEY og de mere invasive /tumorigene HEY A8-celler testede vi hypotesen ved at undersøge cytoskeletale struktur HEY og HEY A8 celler i forhold til andre ovariecancerceller (OVCAR-3, OVCAR-4) og ikke -malignant udødeliggjort æggestokkene overflade epitelceller (IOSE). Resultaterne vist i fig. 5 display tættere, godt afstemt F-actin med længere stress fibre i IOSE forhold til alle de æggestokkene kræftceller. Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporterede sammenligninger mellem normale celler og cancerceller [5], [20].

Desuden er graden af ​​co-alignment af F-actin fibre mellem de forskellige undersøgte cellelinjer korrelerede med den observerede forskel i celler stivhed. For eksempel, for de stivere IOSE celler tilvejebringes actinfilamenter distribueres gennem cellen kroppen, idet de fleste bundter F-actin på linje langs den lange akse af cellen med veldefinerede stress fibre og fokale kontakter. I modsætning hertil actinfilamenter i de blødere ovariecancerceller er mindre organiseret og bundter F-actin er orienteret tilfældigt med sprængte, korte segmenter. I OVCAR-4-celler, er actinfilamenter afstemt kun lokalt og danne en sammenfiltret net. I HEY celler, actinfilamenter bryde ind kortere segmenter og vise reduceret co-tilpasning. F-actin i OVCAR-3 celler opretholder en kortikal struktur med de fleste filamenter liggende i det perifere område af cellen, selv ved en relativt lav densitet. HEY A8 celler udviser lignende egenskaber ved F-actin distribution til HEY-celler, men med en lavere massefylde. Da actincytoskelettet bidrager til de mekaniske egenskaber af cellerne, observerede variationer er i overensstemmelse med forskelle i celle stivhed og med tidligere rapporter [8], [19].

Vi analyseret kvantitativt graden af ​​co-alignment af F-actin i alle fem cellelinier ved anvendelse orientering fordelingsfunktion. Resultaterne vises i fig. 6

en

. En parameter

D

, defineret som blev anvendt til at kvantificere graden af ​​co-tilpasning af F-actin fra orientering fordelingsfunktioner, hvor

P (θ)

repræsenterer orientering fordelingsfunktionen, hvilket er sandsynligheden for en fiber orienteret ved vinklen

θ

i fluorescens billede.

P

0 (θ)

er retningen fordelingsfunktion for det ekstreme tilfælde, hvor F-actin er fuldstændig tilfældigt fordelt, og derfor har en værdi på

P

0 (θ) =

1/180. I det ekstreme tilfælde, hvor alle actin fibre er orienteret tilfældigt uden nogen præference, bør orienteringen fordelingsfunktion være en konstant og uafhængig af vinklen. Fra definitionen af ​​

D

, en højere værdi af

D

indikerer en stigende afvigelse fra tilfældig tilpasning og en højere grad af co-tilpasning af F-actin. Orientering fordelinger af F-actin varierer blandt de fem ovarie cellelinier (fig. 6

en

). I ikke-maligne IOSE celler, blev de fleste af bundter F-actin på linje langs den lange akse af cellen, hvilket er ~135 °. I modsætning hertil OVCAR-4 celler udviser flere orienteringer af F-actin, hvilket indikerer, at actinfilamenter hverken er ensartet rettet ind, eller jævnt fordelt. Dette resultat er umiddelbart fremgår af den fluorescens billedet i fig. 5. Forholdet mellem graden af ​​co-alignment af F-actin og stivhed enkelt celle er afbildet i fig. 6

b

, der viser stærk og signifikant positiv korrelation (r = 0,99834 med p-val = 8,064 × 10

-5 og ρ = 1 med p-val = 0,01667). Dette resultat tyder på, at ændringer i co-tilpasning af F-actin bundter også kunne bidrage til forskelle i celle stivhed inden de undersøgte æggestokkene cellelinjer.

Konklusioner

Vores analyse af ikke-malign IOSE og fire ovariecancer cellelinier viser, at cancerceller udviser en lavere middel stivhed i forhold til ikke-maligne precursorceller. Interessant, finder vi også, at stigningen i invasive og vandrende kapacitet er forbundet med HEY A8 celler i forhold til HEY celler også er korreleret med en signifikant reduktion i celle stivhed. Sammenlignende genekspression analyse af HEY A8 og HEY-celler indikerer, at den molekylære basis af reduktionen i stivhed mellem disse celler er reflekterende af omfattende molekylære ændringer, herunder ændringer i aktincytoskelettet remodeling pathways. Mikroskopiske analyser af actin cytoskeleton i ovariecancer og kontrolceller er konsistente med denne hypotese.

Da vores målinger er udført med cancercellelinjer, vil yderligere undersøgelser være nødvendige for at se, om lignende resultater er fundet i tilfælde af patienten -afledte celler. Etablering relative metastatiske potentiale af cancerceller er en vigtig faktor i udformningen af ​​optimale strategier i personlig behandling af cancer [48]. I øjeblikket er omfattende molekylær profilering til at estimere den metastatiske potentiale af cancerceller [49]. Kollektivt vores resultater viser, at mekanisk stivhed kan være en nyttig biomarkør i udviklingen af ​​nøjagtige, ikke-invasive kliniske metoder til at evaluere den relative metastatiske potentiale ovarie- og måske andre typer af cancerceller.