PLoS ONE: Rapamycin Forbedrer Anti-Cancer Effekt af Dasatinib ved Undertrykkelse Src /PI3K /mTOR Pathway i NSCLC Cells

Abstrakt

Src og pattedyrs mål for rapamycin (mTOR) signalering er almindeligt aktiveres i ikke- småcellet lungekræft (NSCLC), og derfor potentielle mål for kemoterapi. Selvom den kombinerede anvendelse af Src inhibitor Dasatinib med andre kemoterapeutiske stoffer har vist bedre effekt til behandling af cancer, er de mekanismer, der fører til øget følsomhed Dasatinib ikke helt forstået. I denne undersøgelse fandt vi, at Rapamycin dramatisk forøget Dasatinib-induceret cellevækstinhiberingen og cellecyklus G1 arrest i human lunge adenocarcinom A549-celler uden at påvirke apoptose. De synergistiske virkninger blev konsekvent korreleret med opregulering af cyclinafhængige kinaser inhibitoren proteiner, herunder p16, p19, p21, og p27, samt undertrykkelsen af ​​Cdk4 ekspression og nuklear translokation. Mekanistiske undersøgelser viste, at FoxO1 /FoxO3a og p70S6K /4E-BP1, molekylerne ved nedstrøms Src-PI3K-Akt og mTOR signalering, blev betydeligt undertrykt af den kombinerede brug af dasatinib og Rapamycin. Fastholdende Src og mTOR med små interfererende RNA i A549 celler yderligere bekræftet, at Src /PI3K /mTOR Pathway spillet en afgørende rolle i styrkelsen af ​​anticancer effekt af dasatinib. Desuden blev dette fund også valideret af en række analyser ved hjælp af yderligere to NSCLC cellelinjer, NCI-H1706 og NCI-H460. Sammenfattende vores resultater antydede, at kombinatoriske anvendelse af Src og mTOR-hæmmere kan være en lovende terapeutisk strategi for NSCLC behandling

Henvisning:. Chen B, Xu X, Luo J, Wang H, Zhou S (2015) Rapamycin forbedrer Anti-Cancer Effekt af Dasatinib ved Undertrykkelse Src /PI3K /mTOR Pathway i NSCLC Cells. PLoS ONE 10 (6): e0129663. doi: 10,1371 /journal.pone.0129663

Academic Redaktør: Shi-Yong Sun, Emory University, UNITED STATES

Modtaget: Februar 27, 2015; Accepteret: 11 maj 2015; Udgivet: 10 juni 2015

Copyright: © 2015 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Shanghai Municipal Natural Science Foundation (Grant N0.13ZR1434700) og National Natural Science Foundation of China (Grant N0.81301994). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) er den vigtigste patologiske undertype af lungekræft, som er den mest almindelige dødsårsag af kræft verdensplan [1]. Blandt NSCLC patienter, de Src familie kinaser (SFKs) er konstitutivt overudtrykt eller aktiveret [2,3]. Som et potentielt terapeutisk mål for NSCLC, kan Src spiller en vigtig rolle i progressionen af ​​lunge-adenokarcinomer via regulering signaler fra flere celleoverflademolekyler, herunder integrin, vækstfaktorer og G-protein-koblede receptorer [4,5]. Prækliniske undersøgelser har vist, at SFKs inhibering kan undertrykke proliferation, angiogenese, invasion, og overlevelse af cancerceller [6-9]. Da den specifikke inhibitor af Src har Dasatinib blevet godkendt til behandling af kronisk myeloid leukæmi (CML), og det er nu ved at blive evalueret for klinisk anvendelse i lungecancer [10,11]. Men Dasatinib som monoterapi udviste beskedne klinisk aktivitet, der var lavere end normalt observeret i NSCLC patienter, som fik kemoterapi [11]. I modsætning hertil kombinationen af ​​Dasatinib med cytotoksisk kemoterapi forekom mere lovende end at bruge som et enkelt middel. Da Src kan mediere tumor resistens over for cytotoksisk kemoterapi, har Src inhibering med Dasatinib blevet demonstreret at forbedre responset af colon og lunge cancerceller over for cisplatin in vitro [12,13]. Desuden opnåede en nylig klinisk undersøgelse af Dasatinib i kombination med erlotinib forbedret gavnlig virkning af behandlingen hos patienter med tidligere behandlet NSCLC [14]. Desuden kunne Dasatinib også lette anticancer effekter af strålebehandling [15]. Selvom den overlegne effekt kraftigt har antydet, at kombination med Dasatinib er af afgørende betydning for NSCLC terapier, de mekanismer, der fører til øget følsomhed af kemoterapi er stadig kompleks og ikke helt forstået. I betragtning af at Src modulerer signal transduktioner for spredning, invasion, apoptose,

etc

. af kræftceller, er undersøgelser decifrere reguleringen af ​​Src aktivering og dens interaktion med andre signalmolekyler i kræftbehandling særligt berettiget.

Udover Src, pattedyr mål for rapamycin (mTOR) er også stærkt aktiveret i mange lungekræft patienter og repræsenterer som et andet mål for terapi. Den mTOR signalvej driver mange store cellulære processer og er impliceret i et stigende antal patologiske tilstande, herunder cancer [16]. For nylig er foreløbige kliniske data viste en vis antitumoraktivitet af mTOR inhibitor Rapamycin og dets analoger i nogle kræftformer herunder NSCLC [17,18]. Især Rapamycin er også ved at blive undersøgt for dets evne til at genoprette følsomhed af cancerceller til opstrøms signalering targeted midler [19]. Akt /mTOR inhibering med Rapamycin eller derivater deraf har vist sig at synergistisk øge cytotoksiciteten af ​​stråling og kemoterapeutiske midler, fremme induktionen af ​​cellecyklus og apoptose [20,21]. På den anden side er det blevet påvist, at mTOR kunne aktiveres af Src signalering via phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt pathway [22-24]. Dette førte til den hypotese, at kombinationen af ​​rapamycin med Src-inhibitorer, såsom Dasatinib, kunne lette anticancer aktivitet og være mere effektive i kemoterapi. En nylig undersøgelse viste, at dobbelt inhibering af Src og mTOR var meget effektiv på tumorregression i musemodeller for brystcancer [25]. Men er i øjeblikket tilgængelige med deres kombinatoriske anvendelse til behandling af lungekræft ingen prækliniske data. Også den potentielle effekt af mTOR i reguleringen af ​​Src signalering stort set uklar.

Her ønsker vi at undersøge den kombinatoriske terapeutiske virkning af rapamycin og Dasatinib om lungekræft ved anvendelse af humane lunge adenocarcinomaceller (A549), lunge pladecarcinom celler (NCI-H1703) og stor-cellet lungekræft celler (NCI-H460) som in vitro cellulære modeller. I denne undersøgelse blev Dasatinib-induceret cellevækstinhiberingen og cellecyklusstandsning dramatisk forbedret ved co-behandling med rapamycin, parallelt med derpå opregulering af cyclinafhængige kinaser (CDK’er) inhibitorproteiner. Analyse på signalmolekyler viste, at Src deaktivering effektivt blev lettet af mTOR hæmning via PI3K-Akt vej. Brug små interfererende RNA mod Src og mTOR, observerede vi lignende undertrykkelse til dem fra inhibitorer på celleproliferation, cellecyklusprogression, invasion, og migration i A549 celler. Desuden er vores resultater afslørede synergistisk vekselvirkning mellem Src og mTOR signalings i NSCLC celler, der foreslog lovende terapeutiske fordele af mTOR /Src dobbelt hæmning for NSCLC behandling.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

Dasatinib og Rapamycin blev købt fra Selleck Chemical (Shanghai, Kina). Primære antistoffer mod phospho-Src (Tyr416), Src, phospho-mTOR (Ser2448), mTOR, phospho-PI3K (Tyr458), PI3K p85, phospho-Akt (Thr308), Akt, phospho-FoxO1 (Ser256), phospho-FoxO3a (Ser253), phospho-4E-BP1 (Thr37 /46), 4E-BP1, Cdk2, Cdk4, Cdk6, og Alexa Fluor 555 konjugeret antistof blev opnået fra Cell Signal Technologies (Shanghai, Kina). Primære antistoffer mod CDK inhibitor-proteiner, herunder p16, p19, p21, p27, og β-tubulin blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Shanghai, Kina). Antistoffer mod phospho-p70S6K (Thr389 /412), p70S6K, blev indkøbt fra SAB Signalway (College Park, MD, USA). Den sekundære HRP eller FITC- konjugerede antistoffer, si-mTOR, si-Src, og transfektionsreagenser blev købt fra Santa Cruz Biotechnology (Shanghai, Kina).

Cell kultur og behandling

human adenocarcinom-cellelinie A549, human lunge pladecarcinom cellelinie NCI-H1703, human stor-cellet lungecancer-cellelinie NCI-H460 og normal bronchial epitelcelle BEAS-2B blev indkøbt fra ATCC (Beijing, Kina), og dyrket i Dulbeccos modificerede eagle medium (Life teknologi, Shanghai, Kina) suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. Celleantal og levedygtighed blev bestemt ved trypan blå-udelukkelse, med mindst 90% levedygtige celler før udsættelse behandling. A549-celler blev behandlet med dasatinib (5, 10, 25 eller 50 nM) alene eller i kombination med rapamycin (20, 50 eller 100 nM) i 24 til 96 timer. Celler behandlet med 0,1% dimethylsulfoxid (DMSO) blev anvendt som kontrol køretøj.

celleproliferation og cellecyklus assays

I celleproliferationsassay, 10

4 celler per brønd blev podet i 24 Tja plader og inkuberet i 24 timer. Cellerne blev behandlet med 5, 10, 15 eller 20 nM Dasatinib i nærvær eller fravær af rapamycin (20, 50 eller 100 nM), og høstet ved 24, 48, 72 og 96 timer. Trypanblåteksklusion assays blev udført til bestemmelse celleantal under anvendelse af en Cellometer Auto T4 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA).

I cellecyklus assay blev cellerne i 6-brønds plader opsamlet, skyllet og fikseret natten over i 75% kold ethanol ved -20 ° C. Derefter blev celler behandlet med Tris-HCI-buffer (pH 7,4) med 100 ug /ml RNase A og farvet med 25 pg /ml propidiumiodid (PI) (Life teknologi, Shanghai, Kina). Ti tusinde celler blev erhvervet og analyseret ved flowcytometri (BD FACSCalibur, CA, USA) baseret på DNA-indhold.

Apoptose assay

1 × 10

6 celler blev behandlet med DMSO ( 0,1%), Dasatinib (10 nM) alene eller i kombination med rapamycin (100 nM) i 96 timer. Celle apoptose blev bestemt ved Annexin V-FITC Apoptose Detektion Kit I (BD Biosciences, Shanghai, Kina) ifølge producentens anvisninger. Fluorescensintensiteter for alle prober blev bestemt ved flowcytometri (BD FACSCalibur, CA, USA).

Real-time kvantitativ PCR

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol-reagens og behandlet med DNase ifølge den producentens anvisninger. Første-streng cDNA blev syntetiseret ved hjælp af M-MLV revers transkriptase og oligo-dT primer (Invitrogen, Shanghai, Kina). Kvantitative real-time PCR assays blev udført i 96-brønds optiske plader på en ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Lifetechnology, Shanghai, Kina) med SYBR Green qPCR Master Mix (Qiagen, Shanghai, Kina). Ekspression af P16, P19, P21, P27, cyklin A /D1 /E og Cdc25A mRNA blev normaliseret mod denne af 18s RNA. Primer sekvenser for real-time PCR-analyser blev opført i S1 tabel.

Western blotting

homogenatet proteiner (20 ug) fra hver behandlede celler blev løst på SDS-polyacrylamidgeler, og elektroforetisk overført til Immobilon-P-membraner. polyvinylidenedifluoride Efterfølgende blev membranerne inkuberet med specifikke antistoffer mod CDK inhibitor proteiner (p16, p19, p21 og P27), cdk2 /4/6, Forkhead box proteiner (FoxO1 og FoxO3a), det phosphorylerede eller total Src, PI3K, Akt, mTOR, p70S6k og 4E-BP1 hhv. Beta-tubulin blev anvendt til normalisering af protein loading. Efter inkubering med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret IgG-antistof blev membranerne udviklet ved anvendelse af ECL Western blotting påvisningsreagens (Thermo, Beijing, Kina). Densitometriske målinger af båndene blev udført ved hjælp Mængde One-software program (Bio-Rad, Beijing, Kina).

Cell immunfluorescensfarvning

Efter podet i 12-brønds plade i 24 timer, A549 celler blev behandlet med DMSO (0,1%), Dasatinib (10 nM) alene eller i kombination med rapamycin (100 nM) i 48 timer. Celler blev vasket og fikseret med 0,4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur, derefter inkuberet med primære antistoffer mod phosphoryleret Src eller Cdk4 natten over ved 4 ° C. Efter vask blev cellerne inkuberet med FITC-mærket eller Alexa Fluor 555 konjugeret sekundært antistof. Efterfølgende blev cellekernen farvet med PI og derefter, ved anvendelse af Cytation 3 multiple imaging system (BioTek, VT, USA).

Små interfererende RNA (siRNA) transfektion

A549-celler blev podet i en seks brønds vævsdyrkningsplade med 2 x 10

5 celler per brønd i 2 ml antibiotikum-frit medium og inkuberes i 24 timer. Ifølge producentens instruktioner, blev celler inkuberet med transfektion medium indeholdende si-Src, si-mTOR, eller kontrol siRNA i 8 timer. Derefter transfektion blev mediet erstattet med normal frisk komplet medium, efterfulgt af yderligere inkubering i 24 til 72 timer. Efterfølgende blev cellerne indsamlet til assays på celleproliferation, cellecyklus og western blotting, hhv.

Cell invasion assay

Cell invasion assay blev udført ved hjælp af trans-brønd kamre (Matrigel-coatede membran for invasion, BD Biosciences, Shanghai, Kina). I alt 5 × 10

5-celler blev udpladet i det øvre kammer med serum-frit medium og behandlet med 0,1% DMSO, Dasatinib (10 nM) alene eller i kombination med rapamycin (100 nM). Derefter blev cellerne lov til at invadere mod 10% FBS som en kemoattraktant i det nedre kammer i 24 timer. Celler i det øvre kammer blev omhyggeligt fjernet ved anvendelse vatpind, og cellerne på undersiden membran blev fikseret og farvet med nuklear fast red. Antallet af invaderede celler blev talt under mikroskop og den procentvise invasion blev beregnet ved celler invaderende gennem Matrigel matrix og membran i forhold til invasion af celler i kontrolgruppen.

sårheling assay

celler blev podet i 24-brønds vævskulturplader, og nåede 70-80% konfluens som et monolag efter 24 timers vækst. Monolaget blev forsigtigt og langsomt ridset med en ny 1 ml pipettespids hen over midten af ​​brønden. Så godt var vaske to gange med medium for at fjerne fritliggende celler. Efter påfyldning brønden med frisk medium, blev cellerne behandlet og dyrket i yderligere 18 timer. Monolagcellerne blev fotograferet under et inverteret fasekontrastmikroskop.

Statistisk analyse

Alle data repræsenterer mindst tre uafhængige forsøg og er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD) Statistiske sammenligninger blev udført under anvendelse af en softwarepakke SPSS 16.0 og analyseret med envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af en post hoc Dunnetts test, hvor det er relevant. Den statistiske signifikans blev sat til p-værdier 0,05 (*), eller 0,01 (**).

Resultater

Rapamycin forbedret hæmmende effekt Dasatinib på celledeling og cellecyklus progression i A549 celler

Som vist i figur 1A, Dasatinib på farmakologisk relevante niveauer markant nedsat cellen antallet af A549-celler på en koncentrationsafhængig måde. Bemærkelsesværdigt, co-behandling med rapamycin (50 og 100 nM) signifikant forøget Dasatinib-medieret vækstinhibering i A549-celler, i at 10 nM Dasatinib plus 100 nM Rapamycin kunne opnå lige størrelser af anticanceraktivitet end Dasatinib alene i en koncentration på 50 nM. Resultater om de tidsmæssige virkninger af Dasatinib med Rapamycin indikerede, at A549 celledeling den blev signifikant hæmmet af Dasatinib (10 nM) gennem 96 h behandling (Fig 1B). Vigtigt er, co-behandling med rapamycin (100 nM) yderligere reducerede celleantal så tidligt som 48 timer, hvilket tyder på den markerede synergistisk virkning til behandling af Dasatinib selv. Imidlertid Rapamycin alene viste mindre suppression på vækstkurven af ​​kræftceller.

(A) koncentrationsafhængig virkning Rapamycin om anticancer aktivitet af Dasatinib i A549-celler. Som beskrevet i “

Methods

“, A549-celler blev behandlet med vehikelkontrol (0,1% DMSO) eller Dasatinib (5, 10, 25, og 50 nM) i nærvær og fravær af rapamycin (20, 50 og 100 nM). Levedygtige celleantal blev analyseret efter 72 timer efter co-behandling. (B) Virkninger af Rapamycin om de tidsmæssige ændringer af dasatinib-induceret vækstinhibering i A549-celler. Celler blev behandlet med vehikelkontrol (0,1% DMSO), Dasatinib (10 nM) med eller uden Rapamycin (100 nM). Celleantal blev målt ved 0, 24, 48, 72, og 96 timer efter behandlingen. (C) Virkninger af Dasatinib og Rapamycin om fordelingen cellecyklus. A549-celler blev behandlet med dasatinib (10 nM) eller Rapamycin (100 nM) i 96 timer og analyseret ved flowcytometri efter PI-farvning. Resultater udtrykkes som den gennemsnitlige procentdel af celler ved G0 /G1, S og G2 /M-fasen fra tre uafhængige forsøg. (D) Virkninger af Dasatinib og rapamycin på apoptose i A549-celler. Celler blev behandlet med dasatinib (10 nM) eller Rapamycin (100 nM) i 96 timer og de apoptotiske blev bestemt ved flowcytometri med Annexin-V og PI-farvning. Kolonner, gennemsnit af tre bestemmelser; barer, SD. * P 0,05, ** p 0,01.

Tidligere undersøgelser har vist, at både Src og mTOR ofte konstitutivt aktiveret i akut myeloid leukæmi (AML) -celler og derfor udgør potentielle terapeutiske mål. For eksempel kunne den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) inhibitor erlotinib inducere standsning af cellecyklus ved G1-fasen ved inhibering af onkogene signalering via Src og mTOR [26]. Enige, vores resultater fra cellecyklus assay i A549-celler viste, at Dasatinib (10 nM) signifikant forøget andelen af ​​celler ved G1-fasen i sammenligning med kontrolgruppen (Fig 1C), hvilket antyder en direkte standsning af cellecyklusprogression af Src inhibition i cancerceller. I modsætning hertil Rapamycin (100 nM) alene udviste ringe effekt på fordelingen af ​​cellerne i forskellige cellecyklusfaser. Tilstedeværelsen af ​​Rapamycin i co-behandling med Dasatinib markant øgede procentdelen celle ved G1-fasen, hvilket resulterer i betydelig blokering af G1 /S overgang og cellemitose. Resultatet var i overensstemmelse med den synergieffekt inhibering af cellevækst ved Dasatinib og rapamycin i kombination. I mellemtiden blev observeret effekten af ​​dasatinib og Rapamycin på celle apoptose blev også evalueret i A549 celler, men ingen signifikant forskel på celle apoptose blandt behandlinger med kontrol, Dasatinib eller Rapamycin (Fig 1D), hvilket tyder på, at Rapamycin og Dasatinib havde mindre effekt på den apoptose i A549 celler.

Rapamycin forstærkes Dasatinib til opregulere CDK inhibitorproteiner og nedregulere Cdk4

G1 cellecyklusstop styres af flere faktorer, herunder cycliner, celledeling cyklus protein ( CDC), CDK’er og CDK inhibitorproteiner. Vores foreløbige undersøgelse viste, at udtrykkene for cyclin A /D1 /E og Cdc25A ikke blev væsentligt ændret af Dasatinib og Rapamycin på mRNA og protein niveauer (S1 Fig). Som for CDK-inhibitorer, Dasatinib øgede ekspression af p16, p19, og p21 både mRNA (Fig 2A) og protein (figur 2B) niveauer, med statistisk forskel fra kontrolgrupperne. Interessant, co-behandling med Rapamycin markant fremmet Dasatinib-induceret opregulering af p16, p19, p21, og p27, men Rapamycin alene syntes at have ringe indflydelse på ekspressionen af ​​disse CDK inhibitor proteiner. Som følge heraf blev ekspressionen af ​​Cdk4 dramatisk undertrykt af kombinationen af ​​Dasatinib og Rapamycin, men hverken Cdk2 eller Cdk6 syntes klart lydhøre over for de behandlinger (Fig 2B).

A549 celler blev behandlet med kontrol køretøj (0,1 % DMSO) eller Dasatinib (10 nM) i nærvær og fravær af rapamycin (100 nM) i 24 timer. (A) Relativ ekspression af CDK inhibitor proteiner (p16, P19, p21 og P27) på mRNA-niveau. Kolonner, gennemsnit af tre bestemmelser; barer, SD. * P 0,05, ** p 0,01. (B) Ekspression af CDK inhibitorproteiner, CDK’er og Foxos bestemt ved Western blotting. (D) Lokalisering af Cdk4 bestemt ved immunfluorescensfarvning. Repræsentative billeder indikeret farvning af Cdk4 (rød), kerne (blå), og de fusionerede billeder.

For yderligere at bekræfte effekten af ​​dasatinib og Rapamycin på CDK inhibitor proteiner, udtryk og distribution af Cdk4 i A549-celler blev yderligere analyseret ved immunfluorescensfarvning. Normalt Cdk4 binder til cyclin D til dannelse af et kompleks i cytoplasmaet, så akkumuleres på kernemembranen og translokere ind i kernen, når celler fremskridt gennem G1 /S-fase. Vores Resultatet viste, at Cdk4 overvejende lokaliseret i kernen i A549-celler; imidlertid blev de delvist afsondret i cytoplasmaet under behandling med dasatinib (fig 2C). Endvidere blev translokation af Cdk4 i nucleus væsentligt blokeret af behandlingen med dasatinib og Rapamycin i kombination. Samlet set viser disse resultater konsekvent foreslået, at inhibering af cellecyklusprogression af Dasatinib og Rapamycin var medieret gennem opregulering af CDK inhibitor proteiner samt nedreguleringen af ​​Cdk4 i A549-celler. Salg

Tidligere rapporter har vist, at p19, p21 og p27 blev transkriptionelt reguleret af Foxos, som senere er blevet bevist som efterfølgende mål for PI3K /AKT [25,27]. Det blev for nylig rapporteret, at p16 kan også reguleres af Src-AKT-vej i cellulær ældning i humane prostata kræftceller [28]. I denne undersøgelse vores resultat indikerede, at phosphoryleringsniveauerne af FOXO1 og FOXO3a også blev markant forøget ved samtidig behandling sammenlignet med den, der induceres ved enten Src eller mTOR inhibitor alene (figur 2B). Endvidere var resultatet parallelt med ekspressionen af ​​CDK-inhibitorer. Derfor vi spekuleret på, at opregulering af CDK-inhibitorer ved Dasatinib og Rapamycin sandsynligvis blev tilskrevet den Src og PI3K /AKT-vejen.

Rapamycin synergieffekt med Dasatinib undertrykke PI3K-Akt-mTOR signalering i A549 celler

den seneste undersøgelse viste, at Src fosforylering kan lette aktiveringen af ​​Akt-mTOR signalvejen i AML-celler [29]. For at undersøge den mulige interaktion mellem Src og mTOR veje, vi analyserede aktiveringen af ​​Src, PI3K, AKT, og mTOR i rækkefølge. For det første immunfluorescensfarvning phospho-Src indikerede, at Src-aktivering blev inhiberet af Dasatinib og mere signifikant undertrykt ved samtidig behandling med rapamycin (fig 3A), hvilket antyder, at mTOR inhibering med Rapamycin kan virke synergistisk med Dasatinib til undertrykkelse Src aktivering i A549-celler . Og dette resultat blev yderligere bekræftet ved Western blotting (Fig 3B). Desuden viste vores data, at hæmning af Src ved Dasatinib også kunne undertrykke aktivering af PI3K-Akt signalering i A549 celler, hvilket var i overensstemmelse med tidligere rapporter [29]. Mere vigtigt blev hæmninger af Src, PI3K, og AKT enstemmigt forstærkes af tilstedeværelsen af ​​Rapamycin i sammenligning med Dasatinib alene, som vist i fig 3B og 3C. Det var værd at bemærke, at resultatet var godt korreleret med de bemærkninger vedrørende udtryk for CDK-hæmmer og Forkhead box proteiner (Fig 2B), der er aftalt med vores spekulationer om sammenhængen mellem cellecyklus arrest og Src-PI3K-AKT deaktivering. På den anden side er immunfarvning og Western blotting resultater viste, at Src aktivering blev inhiberet af rapamycin, i mindre grad end Dasatinib. Disse data stiltiende at mTOR, som traditionelt blev anerkendt som den lydhør mål for PI3K /AKT-signalering, kan også spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​Src aktivering.

A549 celler blev behandlet med køretøj kontrol (0,1% DMSO) , Dasatinib (10 nM) med eller uden Rapamycin (100 nM) i 24 timer. Homogenat proteiner (20 ug) fra helcellelysat blev opsamlet og anvendt til Western blotting. (A) Aktivering af Src bestemt ved immunfluorescensfarvning. Repræsentative billeder angivet farvning af Src (rød), kerne (blå), og de fusionerede billeder. (B) Aktiveringen af ​​Src, PI3K, og Akt bestemt ved western blotting. (C) Densitometri kvantificering af Src, PI3K og Akt phosphorylering i A549-celler. (D) Aktiveringen af ​​mTOR signalering bestemt ved western blotting. (E) Densitometri kvantificering af mTOR, p70S6K og 4E-BP1 fosforylering i A549 celler. Data præsenteret gennemsnitlige relative phosphorylering nøgletal til den ubehandlede kontrol fra tre uafhængige forsøg. Kolonner, gennemsnit af tre bestemmelser; barer, SD. * P 0,05, ** p 0,01.

Efterfølgende blev aktiveringen af ​​mTOR bestemt ved anvendelse western blotting på phosphorylerede niveauer af mTOR. Som forventet blev aktiveringen af ​​mTOR signifikant inhiberet af inhibitoren Rapamycin. Selvom Dasatinib udviste moderat effekt i at undertrykke mTOR aktivering, kombinationen med Rapamycin bemærkelsesværdigt avancerede inhiberingen der induceres af Dasatinib alene (Fig 3D og 3E). Desuden phosphorylering af p70S6K og 4E-BP1, de kendte mål på den neden for mTOR pathway, blev begge signifikant undertrykt af Rapamycin og de var også faldet yderligere ved kombination med Dasatinib. Kollektivt, disse resultater antydede, at Rapamycin synergieffekt med Dasatinib i undertrykkelsen af ​​PI3K-Akt-mTOR signalvejen i A549 celler.

Dual undertrykkelse af mTOR og Src ved siRNAs inducerede cellecyklusstop og væksthæmning i A549 celler

for at validere den potentielle interaktion mellem Src og mTOR signalering, vi undersøgt yderligere ændring af phosphoryleringsniveauerne af PI3K /AKT og ekspressionsniveauerne af CDK inhibitor proteiner i A549 celler med den kunstige knock-down af Src eller mTOR . Som vist i fig 4A, vil den begrænsende ekspression af Src eller mTOR af siRNA’er undertrykt phosphoryleringsniveauerne af PI3K /AKT og p70S6K /4E-BP1, henholdsvis betydeligt. Omvendt ekspressionsniveauerne af de CDK inhibitor proteiner, herunder p16, p19, p21, og p27, blev alle tilsyneladende forhøjet ved si-mTOR eller si-Src (Fig 4B). Efter aftale blev ekspressionen af ​​FoxO1 også steget, mens Cdk4 faldet betydeligt. Hvad vigtigere er, den dobbelte knock-down af mTOR og Src fremmes signifikant inhibering af PI3K /AKT, p70S6K /4E-BP1, og resulterede i opregulering af CDK inhibitorproteiner, når der sammenlignes med enten si-mTOR eller si-Src alene. Resultaterne var i overensstemmelse med vores resultater i A549 celler behandlet med Rapamycin og Dasatinib.

(A) aktivering niveauer af PI3K, AKT, og mTOR bestemt af western blotting. A549-celler blev transficeret med si-Src, si-mTOR, eller kontrol siRNA i 8 timer, efterfulgt af en forlænget inkubation på 24 t. Homogenat proteiner (20 ug) fra helcellelysat blev opsamlet og anvendt til Western blotting. (B) Ekspressionen af ​​CDK inhibitor proteiner (p16, p19, p21 og p27), FoxO1, og Cdk4 bestemt ved western blotting. (C) Virkninger af si-mTOR og si-Src på cellecyklusprogression. A549-celler blev transficeret med si-Src, si-mTOR, eller kontrol siRNA i 8 timer, efterfulgt af en langvarig inkubation på 24 t. Hvorefter cellerne blev opsamlet og analyseret ved flowcytometri med PI-farvning. Resultater udtrykkes som den gennemsnitlige procentdel af celler ved G0 /G1, S og G2 /M-fasen fra tre uafhængige forsøg. Resultaterne blev udtrykt som den gennemsnitlige procentdel af celler ved G0 /G1, S og G2 /M fase fra tre uafhængige forsøg. (D) Virkninger af si-mTOR og si-Src på de permanente ændringer af celledeling. A549 alen blev transficeret med si-Src, si-mTOR, eller kontrol siRNA i 8 timer, og derefter inkuberet med normalt medium i 72 timer. Celleantal blev målt ved 0, 24, 48, og 72 timer efter transfektion. Dataene blev præsenteret som middelværdi ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * P 0,05, ** p 0,01.

Desuden knock-down af mTOR og Src resulterede i lignende cellecyklusstop som ville frembringes af de specifikke inhibitorer rapamycin og dasatinib. Som vist i fig 4C, den dobbelte hæmning af mTOR og Src ved siRNAs inducerede mere signifikant undertrykkelse af cellecyklusprogression i G1-fasen i A549-celler sammenlignet med enten si-mTOR eller si-Src alene. Desuden blev celleproliferationen påvirkes i sammenlignelig måde med den, der induceres af de kemiske inhibitorer (fig 4D). Det var bemærkelsesværdigt, at si-mTOR alene også inducerede moderat G1 anholdelse og væksthæmning i A549 celler, muligvis på grund af dens højere effektivitet i deprimerende mTOR end pålagt af Rapamycin. Kollektivt, si-mTOR forbedret betydeligt cellecyklusstandsningen og væksthæmning, der fremkaldes af si-Src i A549 celler, som støttede vores fund vedrørende forbedrede kemoterapeutiske effekt af Dasatinib i kombination med Rapamycin.

Rapamycin forbedret hæmmende effekt af Dasatinib på celle invasion og migration i A549 celler

for yderligere at bekræfte den forstærkende virkning af Rapamycin på anticancer aktivitet Dasatinib, vi undersøgte invasionen og migrering af A549 celler under forskellige behandlinger. Som vist i fig 5A, den invasive evne gennem Matrigelcoatede filtre af celler behandlet med Dasatinib blev signifikant reduceret i sammenligning med kontrolceller. Samtidig behandling af Dasatinib med Rapamycin yderligere faldt invasionen procent af A549 celler med næsten 50%, mens Rapamycin alene ikke udviste klar undertrykkelse på celle invasion i forhold til kontrollen.

(A) Repræsentative billeder ( øvre panel) og kvantificering (nederste panel) af invaderende celler. Som detaljeret med “celleinvasion assay” i “

Methods

” blev A549-celler behandlet med DMSO (0,1%), Dasatinib (10 nM) alene eller i kombination med rapamycin (100 nM) i 24 timer. Antallet af indtrængende celler blev talt under mikroskop, og dataene blev præsenteret som middelværdi ± SD fra tre uafhængige eksperimenter, * p 0,05, ** p 0,01. (B) et repræsentativt udvalg af sårheling assays i A549-celler, der var behandlet med DMSO (0,1%), Dasatinib (10 nM) eller Rapamycin (100 nM) i 18 timer. (C) Ekspression af MMP-2/9 og E-cadherin bestemt ved western blotting i A549-celler, der blev behandlet med DMSO (0,1%), Dasatinib (10 nM) eller Rapamycin (100 nM) i 24 timer.

Desuden blev virkningen af ​​Dasatinib og rapamycin på migrationen evne A549-celler vurderet ved sårheling under anvendelse af fysisk sårede celler (fig 5B). Ved 18 timer efter at være blevet ridset, de ubehandlede A549-celler effektivt migreret i indsnittet, og virkningen af ​​Rapamycin alene på cellemigrering optrådte begrænset. I modsætning hertil blev migrationen tydeligvis hæmmet af behandlingen med dasatinib.