PLoS ONE: overekspression af Stilladser Protein NEDD9 Fremmer Migration og Invasion i livmoderhalskræft via Tyrosinphosphorylerede FAK og SRC

Abstrakt

NEDD9, et knudepunkt vedhæftning stillads protein, for nylig har været foreslået at regulere invasion og metastase i nogle kræftformer, men ukendt i livmoderhalskræft. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme, om NEDD9 var involveret i progressionen og metastase af livmoderhalskræft. Forsøgsresultaterne viste NEDD9 protein blev overudtrykt i livmoderhalskræft sammenlignet med normale cervikale epitel væv. Overekspression af NEDD9 var korreleret med histologiske sortering, lymfeknude metastaser, og FIGO stadium af livmoderhalskræft. Silencing NEDD9 resulterede i tyrosindephosphorylering af FAK og SRC oncoproteiner og nedsat cellemigration og invasion i cervikal carcinom SiHa og HeLa-celler. Overekspression af NEDD9 førte til tyrosinphosphorylering af FAK og SRC oncoproteiner, og øget cellemigration og invasion. Desuden blev tyrosinphosphorylering af NEDD9 faldt betydeligt via undertrykke tyrosinphosphorylering af FAK eller SRC, hvilket tyder på en positiv spiral af tyrosinphosphorylering mellem NEDD9 og FAK eller SRC. Desuden viste vores data, at lukke munden NEDD9 faldt vimentin udtryk og øget E-cadherin ekspression i livmoderhalskræft celler, og vice versa. E-cadherin var genstand for regulering af NEDD9, FAK og SRC, men ændrede hverken tyrosin-phosphoryleret eller total NEDD9. Vores resultater tyder på, at NEDD9 er overudtrykt i livmoderhalskræft væv og celler, og overudtrykt NEDD9 fremmer migration og invasion i cervikale carcinomceller, sandsynligvis via en positiv spiral af tyrosinphosphorylering mellem NEDD9 og FAK eller SRC

Henvisning.: Sima N, Cheng X, Ye F, Ma D, Xie X, Lü W (2013) overekspression af Stilladser Protein NEDD9 Fremmer Migration og invasion i livmoderhalskræft via Tyrosinphosphorylerede FAK og SRC. PLoS ONE 8 (9): e74594. doi: 10,1371 /journal.pone.0074594

Redaktør: Olivier de Wever, Ghent Universitet, Belgien

Modtaget: Februar 19, 2013; Accepteret: August 5, 2013; Udgivet: 18 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Sima et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Den nuværende undersøgelsen blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.801.227;. 81.272.862), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (nr Y2100403;. LY12H16020), National Basic Research Program Kina (nr 2009CB521808), for Grundlæggende Forskning Midler til centrale universiteterne i Kina og Zhejiang Provincial Program til dyrkning af højt niveau Innovative Health talenter. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft hos kvinder over hele verden, især i udviklingslandene. Årligt, omkring 529.800 kvinder støder på denne sygdom, der tegner sig for 9% af de samlede sager nye kræft [1]. Selvom de nuværende behandlingsstrategier som radikal hysterektomi og strålebehandling har gode kliniske resultater er næsten 275.100 dødsfald tilskrives livmoderhalskræft hvert år. Derudover er kirurgi kun egnet til tidlig fase sygdomme og strålebehandling resulterer i uønskede bivirkninger, såsom ovariesvigt, vaginal stenose, radiocystitis og stråling proctitis, som påvirker kvaliteten af ​​patientens liv [2]. Derfor er disse kendsgerninger understreger et presserende behov for at udvikle mere effektive og nye terapeutiske mål.

NEDD9 gen, først identificeret i neuronale precursorceller i 1992, blev nedreguleret under udviklingen af ​​musen centralnervesystemet [ ,,,0],3]. Bagefter blev dette gen også findes i andre arter og væv. Law et al [4] screenede et cDNA-bibliotek for gener, der inducerede filamentøs gær knopskydning af

S. cerevisiae

for at finde kandidatgener, der kan koordinere cellulær signalering og morfologi. En “ny” gen blev identificeret og tildelt som menneskelige Enhancer af filamentering en (HEF1). En anden forskergruppe fandt, at en roman 105 kD p130Cas-relateret protein blev tyrosinphosphoryleret ved ansættelse af p1 integriner i T-lymfocytter og udpeget den som lymfocyt-typen Crk-associeret substrat (Cas-L) [5]. Således NEDD9 havde to andre uafhængige navne i historien. NEDD9 proteiner regulerer proteinkomplekser styrer cellecyklus og apoptose, migration, kemotaxi og differentiering [6]. FAK og SRC blev impliceret som vigtige mål for NEDD9 og de var phosphoryleret og aktiveret gensidigt, der blev betragtet som den “kerne regulering proces” af NEDD9 [7].

I de sidste mange år, ændret ekspression af stilladser protein NEDD9 er opstået som bidrager til kræft metastaser i flere forskellige typer kræft, som brystkræft [6,8], glioblastom [9], melanom [10], lunge [11,12], og hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) [13]. Imidlertid ingen undersøgelse til dato udført for at bestemme, om NEDD9 er associeret med human cervical carcinoma. Nylige rapporter har antydet, at NEDD9 overudtrykkes i visse humane carcinomer, såsom melanom [10] og HNSCC [13]. Her opdaget vi NEDD9 udtryk i humane livmoderhalskræft væv og udforskede rolle NEDD9 i udviklingen af ​​livmoderhalskræft.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøve samling

prøver af livmoderhalsen og lymfeknude væv og kliniske parametre fra 67 patienter livmoderhalskræft (38 cervikale planocellulære carcinomer og 29 adenocarcinomer), som gennemgik kirurgi i løbet af 2005-2009 i kvinders Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, blev indsamlet og detaljerede data blev vist i tabel S1. Desuden blev 22 cervikale normale vævsprøver som kontroller afledt fra patienter, som gennemgik hysterektomi på grund af benigne gynækologiske sygdomme. Ingen patienter fik kemoterapi eller strålebehandling, før vævet blev opnået. Undersøgelsen blev revideret og godkendt af Etisk Komité for Kvinders Hospital, School of Medicine, Zhejiang University. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter eller deres værge.

Immunhistokemi

Alle væv blev immunhistokemisk farvet den 4.-um sektioner for at vurdere NEDD9 udtryk i disse prøver. Mus monoklonale antistof 2G9 mod NEDD9 (Abcam, 1: 1000) blev ansat som det primære antistof. EnVision

TM afsløring kit blev brugt i de procedurer og 3,3′-diaminobenzidin (DAB) blev anvendt som chromogen. Hver sektion blev scoret blindt for semikvantitativ bestemmelse af immunhistokemisk farvning intensitet af en patolog. Farvningsintensitet blev scoret som følger: 0, ingen farvning; 1, svag positivitet; 2, moderat positivitet; og 3, stærk positivitet. De sammensatte immunhistokemi scoringer blev afledt som summen af ​​intensitetsværdierne scorer multipliceret med cellens andel af denne intensitet score. For eksempel, hvis prøven udviste moderat farvning (scorede 2) i 20% af cellerne og stærk farvning (scorede 3) i 30% af cellerne, ville de sammensatte immunhistokemi scores være (2 x 0,2) + (3 x 0,3) = 1,3. En gennemsnitlig score blev brugt til statistisk analyse.

Cell kultur

Humane livmoderhalskræft cellelinjer SiHa (HPV16-positive), CaSki (HPV 16-positive), HeLa (HPV18-positive), C33A (HPV-negativ), human ikke-tumor keratinocyt HaCaT og humane embryonale nyre cellelinier HEK293 og HEK293T blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). Cellerne blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium. (DMEM; GIBCO, USA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C

immunofluorescens

Otteogfyrre timer efter udpladning på dækglas, blev cellerne fikseret med 3,7% paraformaldehyd og inkuberet med monoklonalt muse-antistof 2G9 (1: 200) mod NEDD9 som primært antistof. Efter skylning tre gange med PBS blev cellerne inkuberet med gede-anti-muse-antistof konjugeret til Alexa Fluor 647 (Invitrogen) fortyndet 1: 1500 i 2% BSA som sekundært antistof. De kerner blev markeret med Hoechest33342 (Sigma).

siRNA’er Forberedelse og transfektion

Baseret på litteratur [14] og en gratis web-baseret værktøj (https://www.dharmacon.com) , tre par siRNA’er blev designet mod NEDD9 mRNA. siRNA’er mod HPV16 E6 /E7 og E-cadherin blev udformet som tidligere [15] beskrevne. Alle siRNA-duplexerne (tabel S2), blev kemisk syntetiseret af GeneChem Co., Ltd (Shanghai, Kina). Transfektioner blev udført i 6-brønds plader og under anvendelse af lipofectamin ™ 2000 Transfektion Reagent (Invitrogen, USA) ifølge producentens anvisninger.

Lentiviral Production

Den fuldstændige kodende sekvens for NEDD9 blev amplificeret ved PCR fra plasmider indeholdende cDNA klon af NEDD9 (OriGene, USA) og indsat i et lentivirus genoverførselsvektor pLenti6 /V5-DEST (Invitrogen, USA). Den kodende sekvens af korte hårnåle RNA’er (shRNAs) rettet grønt fluorescensprotein (GFP) eller NEDD9 (tabel S2) blev klonet umiddelbart efter en U6 pol III-promotor i et lentivirus genoverførselsvektor (Invitrogen, USA). Vektorerne blev efterfølgende pakket i lentivirale partikler i HEK293T celler. De lentivira blev anvendt til at inficere livmoderhalskræft celle som tidligere [16] beskrevne. Produceret lentivira blev titreret og opbevaret i overensstemmelse med producentens anvisninger.

Kvantitativ PCR

Totale RNA’er blev fremstillet af de behandlede celler ved hjælp TRIzol reagens (Invitrogen, USA). Real time kvantitativ PCR (qPCR) blev udført under anvendelse af en 7300 real-time PCR-system (Applied Biosystems) og udført af SYBR Green farvestof ifølge producentens anvisninger. Oligonukleotidprimere blev syntetiseret af Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kina). som opregnet i tabel S2. Relativ kvantificering af mRNA-ekspression blev beregnet med 2

-ΔΔCT fremgangsmåde som beskrevet tidligere [17].

Western blots og immunfældning

Western blots blev udført som tidligere beskrevet [18] . Celler blev høstet og resuspenderet i lysisbuffer for protein ekstraktion. Halvtreds mikrogram total protein fra hver prøve blev underkastet en 10% SDS-PAGE-gelelektroforese. For immunopræcipitation blev celler sprængt i 250 pi af immunoprecipitation buffer. Lige store mængder protein (300 ug) blev underkastet immunpræcipitation efterfulgt af Western blot analyse. Kumulativ grå niveau af Western blot bands blev opnået ved anvendelse ImageJ software (NIH, USA) til relativ kvantificering kvantitativ analyse. Primære antistoffer var specifikke for følgende proteiner: NEDD9 (ab18056) fra Abcam, FAK (3285), pFAK (3283), Src (2109), pSRC (2101), Phospho-tyrosin (9411), vimentin (3932) og E-cadherin (3195) formular Cell Signaling, HPV16 E6 (MAB874), E7 (MAB8680) fra Millipore, GAPDH (sc-59.540) og β-actin (sc-1616-R) fra Santa Cruz. Bånd blev visualiseret under anvendelse af en ECL Kit (Pierce, USA).

Scratch sårhelende assay

Scratch sårhelende assay blev udført for at bestemme cellemigrering. Celler blev inficeret med lentivirus, og 72 timer senere vokset til fuld konfluens. Derefter sår (ca. 1 mm brede) blev fremstillet under anvendelse af en mikropipette spids ridset gennem brøndene. Den cellemigrering hastighed blev beregnet ved at måle afstanden migrerede i 24 timer. Fotografier blev taget med fasekontrastmikroskop (Olympus, Japan) på forskellige tidspunkter efter bunden.

Transwell analyser

In vitro celle invasion blev udført i Matrigel-baserede Transwell-plader væsentlige som tidligere beskrevet af Pelletier et al [19] med små ændringer. 5 × 10

4 Celler blev udpladet i de Matrigelcoatede øvre kamre i 24-brønds Transwell-plader (Corning Costar, Cambridge, MA) med en porestørrelse på 8 um. De nedre kamre blev fyldt med medium suppleret med 20% føtalt bovint serum. Efter 24 timers inkubation blev ikke-migrerede celler på den øvre overflade af membranerne forsigtigt skrabet væk med vatpinde og de migrerede celler, der havde invaderet til den nedre overflade blev farvet med krystalviolet og talt. Cellemigration blev udført på en lignende måde, men uden Matrigel.

Statistisk analyse

Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange. Data blev analyseret med softwarepakken SPSS 12.0. En måde ANOVA og t-test blev anvendt til at sammenligne data.

s

Værdi mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant statistisk.

Resultater

NEDD9 er overudtrykt i menneskelig livmoderhalskræft væv og cellelinjer

For at finde et fingerpeg af forholdet mellem NEDD9 protein og human cervical carcinoma, vi anvendte immunhistokemisk analyse for at bestemme ekspressionen af ​​NEDD9 protein i humane cervikale carcinomceller væv og analyseret associering NEDD9 ekspression med human cervical carcinoma progression. Vi fandt, at NEDD9 protein blev overudtrykt i de fleste cervikale carcinomceller væv men dårligt udtrykt i normal cervikale epitel væv (figur 1A). Desuden blev NEDD9 protein overeksprimeres i metastatiske lymfeknuder (figur 1b). Desuden blev NEDD9 overekspression korreleret med histologisk klasse, metastase, og FIGO stadium (figur 1C). Som vist i figur 1 D, blev NEDD9 mRNA overudtrykt i fire almindelige cervikale cancercellelinier (SiHa, HeLa, C33A og CaSki) uanset HPV-positive eller -negative men relativt dårligt udtrykt i human keratinocyt HaCaT og humane embryonale nyre celle line HEK293. Western blot analyse viste, at NEDD9 blev højt udtrykt i de cervikale cancercellelinier, i lighed med dem af qPCR. Immunofluorescens viste, at proteinet ifølge NEDD9 blev overudtrykt i cervikale cancercellelinier og distribueres hovedsageligt i cytoplasmaet (figur 1E).

(A) immunhistokemisk farvning af NEDD9 i pladecarcinom i cervix (SCC), adenocarcinom cervix (AC) og normalt væv af livmoderhalsen. Original forstørrelse, × 400. (B) Immunhistokemisk farvning af NEDD9 i metastatiske venstre eksterne iliaca lymfeknuder fra SCC og metastatiske højre obturator lymfeknuder AC. Original forstørrelse, × 400. (C) Statistisk analyse viste NEDD9 overekspression var korreleret med FIGO stadie, histologiske sortering og metastase. (D) Ekspression af NEDD9 mRNA og protein i adskillige cellelinjer blev vurderet ved kvantitativ PCR og Western blot-analyse. (E) NEDD9 (rød) lokalisering og udtryk blev vurderet ved immunfluorescent analyse i cervical carcinoma SiHa, CaSki, HeLa, C33A celler og menneskelige HaCaT keratinocytter. Cellerne blev counter-farvet med Hoechest33342 (blå) og visualiseret ved 60 × forstørrelse.

Ændret udtryk for NEDD9 påvirkninger migration og invasion i cervicale cancerceller

For at identificere NEDD9 funktion i livmoderhalskræft celler, vi bankede ned NEDD9 i SiHa og HeLa-celler ved hjælp af en specifik siRNA (S: 5 ‘GAG ACA CCA UCU ACC AAG U [dT] [dT] 3’, AS: 5 ‘ACU UGG UAG august GUG UCU C [ ,,,0],dT] [dT] 3 ‘), der blev valgt fra tre kandidater ved qPCR. Som vist i figur 2A, 2B og 2C viste siRNA kraftig interferens virkninger mod NEDD9 mRNA og protein af livmoderhalskræft SiHa og HeLa-celler. Endvidere forsøgte vi at beslutte, om migration og invasion af livmoderhalskræft celler ville blive svækket ved reduktion af NEDD9 udtryk via lentivirus-gennemført shRNA. Resultaterne af transwell analyser viste, at NEDD9 shRNA skære ned invasive og vandrende evne livmoderhalskræft SiHa og HeLa-celler (figur 2D og 2E). Desuden er resultaterne af sårhelende analyser viste signifikant langsom sår lukning i NEDD9 shRNA-behandlede versus kontrol SiHa og HeLa-celler ved 24 timer efter bunden (figur 2F, 2G og 2H). Vi yderligere bestemmes virkningerne af øget NEDD9 på celle migration og invasion. Lentivirus-vektorer blev anvendt til at overudtrykke NEDD9 i HaCaT-celler (figur 3A). TGFp (5 ng /ml) forøgede også ekspressionen af ​​NEDD9 i HaCaT-celler (figur 3B). Resultaterne af Transwell assay viste, at eksogen overekspression af NEDD9 resulterede i øget celle invasion og migration i HaCaT celler uden TGF stimulering (figur 3C og 3D).

NEDD9 blev slået ned af siRNA’er eller shRNAs i cervical carcinoma SiHa og HeLa-celler. (A) De interferensvirkninger blev bekræftet ved kvantitativ PCR i SiHa og HeLa-celler. Ekspression af NEDD9 blev undersøgt ved Western blotting i SiHa (B) og HeLa-celler (C). Celler blev inficeret med lentivirale vektorer, der koder shRNA mod NEDD9. Resultaterne af Transwell assay viste, at lentiviral levering af shRNA målretning NEDD9 resulterede i reduceret celleinvasion (D) og migration (E) i SiHa og HeLa-celler. Resultaterne af Scratch sårhelende assay verificeres yderligere at silencing NEDD9 resulterede i reduceret cellemigration (F, G og H). Scale bar, 100 pm. *

P

0.05.

lentivirus vektorer blev ansat til at overekspression NEDD9 i humane HaCaT keratinocytter (A). TGF (5 ng /ml) også øget ekspression af NEDD9 i humane HaCaT keratinocytter (B). Resultater af Transwell assay viste, at lentiviral levering af NEDD9 resulterede i øget celle invasion (C) og migration (D) i HaCaT celler uden TGF stimulering. Scale bar, 100 um.

Gensidig regulering mellem NEDD9 og FAK eller SRC

Desuden udtryk for FAK og SRC, to NEDD9-associerede proteiner [4], i inficerede SiHa og HeLa-celler blev bestemt ved Western blot. Resultaterne viste, at udtrykkene for phospho-FAK (Tyr397) og phospho-Src (Tyr416), men ikke alt FAK og total SRC-protein, blev signifikant reduceret efter knockdown af NEDD9 (figur 4A og 4B). I overekspression eksperimenter, tyrosin-phosphoryleret FAK og SRC, snarere end den samlede FAK og total SRC, sås signifikant opreguleret mens NEDD9 eksogent blev overudtrykt i HaCaT celler (figur 4C og 4D). Endvidere immunopræcipitation blev anvendt til at bestemme, om FAK inhibitoren PF-228 (Sigma, 10 uM) eller SRC inhibitor PP2 (Sigma, 10 uM) reguleres ekspressionen af ​​NEDD9. Resultaterne viste, at ekspressionen af ​​tyrosin-phosphoryleret NEDD9, snarere end den samlede NEDD9, blev signifikant reduceret, mens FAK eller SRC blev undertrykt af PF-228 eller PP2 i SiHa og TGFp-stimulerende HaCaT celler (figur 4E og 4F). Derudover PF-228 (10 uM) eller PP2 (10 uM) reducerede phosphorylering af FAK eller SRC i TGFp-stimulerende HaCaT celler (Figur S1). PF-228 eller PP2 undertrykt invasion og migration af SiHa og TGF-stimulerende HaCaT celler (Figur S2). Tilsvarende resultater af Transwell assay viste, at begge inhibitorer undertrykt celleinvasion og migration øget med exogent overekspression af NEDD9 i HaCaT celler (figur 4G).

(A og B) Ekspression af NEDD9-associerede onkoproteiner, FAK og SRC, blev undersøgt ved Western blotting. Tyrosin-phosphoryleret FAK og SRC, snarere end FAK og SRC, var signifikant nedreguleret mens NEDD9 blev stille i SiHa og HeLa-celler. (C og D) Desuden tyrosin-phosphoryleret FAK og SRC var signifikant opreguleret mens NEDD9 eksogent blev overudtrykt i HaCaT celler. (E og F) Resultater af immunpræcipitering viste, at tyrosin-phosphoryleret NEDD9, snarere end NEDD9, var betydeligt nedreguleret mens FAK eller SRC blev undertrykt af FAK inhibitoren PF-228 eller SRC inhibitor PP2 i SiHa og TGFp-stimulerende HaCaT celler. (G) Resultater af Transwell assay viste, at øget celle invasion og migration ved eksogen overekspression af NEDD9 blev undertrykt af FAK-inhibitor PF-228 eller SRC-hæmmer PP2 i HaCaT celler. Scale bar, 100 um.

NEDD9 regulerer Vimentin og E-cadherin i livmoderhalskræft celler

Vimentin og E-cadherin var vigtige proteiner i forhold til celle invasion og migration. Western blot analyse viste, at vimentin blev nedreguleret og E-cadherin blev opreguleret mens NEDD9 blev undertrykt af shRNA i SiHa og HeLa-celler (figur 5A). Desuden vimentin blev opreguleret og E-cadherin blev nedreguleret mens NEDD9 blev overudtrykt i HaCaT-celler (figur 5B). Resultaterne tyder på, at vimentin og E-cadherin er involveret i regulerende rolle NEDD9 på celle migration og invasion i livmoderhalskræft celler. Resultaterne af Transwell assay viste, at faldet celleinvasion og migration induceret af shRNA specifikt for NEDD9 blev forøget ved transfektion af siRNA mod E-cadherin (figur 5C og 5D). Resultaterne yderligere bekræftet, at E-cadherin var en undertrykkende regulatorisk protein i NEDD9 fremme celle migration og invasion i livmoderhalskræft celler. Desuden blev nedreguleret E-cadherin via overekspression af NEDD9 markant opreguleret i kraft af PF-228 eller PP2 i HaCaT celler, i mellemtiden, den opreguleret vimentin udtryk var signifikant nedreguleret (figur 5E). I det omvendte eksperiment, hverken tyrosin-phosphoryleret eller total NEDD9 blev ændret væsentligt, mens E-cadherin blev undertrykt af siRNA i HaCaT celler (Figur 5F).

Angivelse af EMT markører, vimentin og E-cadherin, blev undersøgt ved Western blotting. (A) Vimentin blev nedreguleret og E-cadherin blev opreguleret mens NEDD9 blev stille i SiHa og HeLa-celler. (B) Vimentin blev opreguleret og E-cadherin blev nedreguleret mens NEDD9 blev overudtrykt i HaCaT celler. Resultater af Transwell assay viste, at faldet celleinvasion (C) og migration (D) ved shRNA af NEDD9 blev forhøjet med siRNA mod E-cadherin i SiHa og HeLa-celler. Scale bar, 100 pm. (E) E-cadherin blev opreguleret og vimentin blev nedreguleret i kraft af FAK-inhibitor PF-228 eller SRC-hæmmer PP2 i HaCaT celler med eksogen NEDD9. (F) Resultater af immunpræcipitering viste, at tyrosin-phosphorylerede NEDD9 og total NEDD9 ikke var signifikant reguleret, mens E-cadherin blev undertrykt af siRNA i HaCaT celler.

E6 /E7 oncoproteinet regulerer ikke NEDD9 i livmoderhalskræft cancerceller

det er kendt, at HPV E6- og E7-gener er vigtige onkogener i initiere udviklingen af ​​livmoderhalskræft, men effekten af ​​E6 og E7 på værten gener associeret med cancer progression fortsat usikker. Således har vi observeret mulige forbindelser mellem E6 /E7 og NEDD9 i livmoderhalskræft celler. Men berøvelse af HPV16 E6 /E7 af siRNA ikke ændre ekspressionen af ​​NEDD9 i HPV16-positive SiHa og CaSki-celler (figur 6A og 6B), omvendt, har nedregulering af NEDD9 ikke påvirke ekspression af E6 /E7 (figur 6C og 6D). Vores resultater antyder, at NEDD9 er en sen molekylær begivenhed, der deltager hovedsageligt i progression eller metastase af livmoderhalskræft.

(A og B) Resultatet af qPCR og western blots viste, at berøvelse af E6 /E7 med siRNA didn ‘t ændre ekspressionen af ​​NEDD9 i HPV-positive SiHa og CaSki-celler. (C og D) Interferens med NEDD9 påvirkede ikke udtryk for E6 /E7 i SiHa og CaSki celler.

Diskussion

Selvom NEDD9 blev oprindeligt først identificeret som en af ​​ny gener udtrykkes af neurale precursorceller men nedreguleret efter fostrets udvikling [3], en række igangværende undersøgelser vist, at NEDD9 overekspression, som onkogene signalering abnormiteter, var forbundet med kræft metastase i brystkræft [6,20,21], glioblastom [9] , melanom [10] og hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) [13], samt forbundet med lægemiddelresistens i gastrointestinal stromal tumor (GIST) [22]. Nylige undersøgelser har vist, at NEDD9 regulerer TGF vej i brystkræft [23,24] og hepatocellulær cancer [25] og Wnt signalering i kolorektal cancer [26]. Desuden TGFp er en potent inhibitor af cellecyklus i human keratinocyt HaCaT celler, men det har også vist sig at fremme invasion og migration i HaCaT celler [27,28]. Således vi ansat HaCaT celler som en model til at studere en induceret migrering /invasion fænotype.

Det var blevet bevist af immunhistokemisk analyse, som NEDD9 blev udtrykt i human bronchiolær epitel [29], humane lymfocytter i leddegigt synovium [30 ], rotte cerebral cortex og hippocampus neuroner [31], menneskelig nævi og melanom [10], murine embryonale encephalic og bagagerum neuralrøret [32], human sent debuterende Alzheimers sygdom [33], mus og chick embryonale neurale våbenskjold [34] , menneskelige hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) [13]. Desuden har immunhistokemisk analyse også afsløret, at NEDD9 overekspression er korreleret med HNSCC og melanom progression [10,13]. Cervikal cancer har en klinisk karakteristisk, at metastase til lymfeknuder normalt opstår på et tidligt tidspunkt og præsenterer dårlig prognose. Således har vi opdaget og sammenlignede NEDD9 ekspression ved immunohistokemisk analyse i 67 livmoderhalskræft og 22 cervikale normale væv, samt cervikale cancercellelinier og ikke-tumor keratinocytlinie. Vores resultater viste, at NEDD9 protein blev overudtrykt i de fleste cervikale carcinomceller væv og celler sammenlignet med normalt epitel væv og ikke-tumor keratinocytter. Endvidere fandt vi, at NEDD9 overekspression var korreleret med lymfeknudemetastaser, histologisk klassificering, og FIGO fase af cervikal carcinoma patienter. Vores resultater lignede dem rapporteret af Lucas JT, Jr. et al [13] i HNSCC og af Kim M et al [10] i melanom og foreslå, at NEDD9 overekspression kan inddrage i progression og metastaser af livmoderhalskræft.

NEDD9 protein bevarer en NH2-terminal Src homologi 3 (SH3) domæne, som binder sig til proteinholdige polyprolin motiver såsom FAK. FAK er en af ​​de vigtigste associerede proteiner af NEDD9 især i den fokale adhæsion [4]. Natarajan M et al [9] mente, at NEDD9 fungerede som specifikke nedstrømseffektorer af FAK, der fremmes glioblastom celle migration og invasion. Vi fandt i undersøgelsen, at NEDD9 og FAK ligeledes fordelt i cytoplasmaet af HPV16-positive cervikale carcinoma SiHa-celler (data ikke vist), hvilket antyder at der måske er nogle specielle forbindelser mellem NEDD9 og FAK. RNA-interferens (RNAi) er et kraftfuldt værktøj til at lukke munden på specifikke gener. Adskillige undersøgelser [9,10,14,25,34-38] har vist, at specifikke siRNA’er rettet mod mRNA af NEDD9 genet er i stand til at nedregulere ekspression af NEDD9. Her har vi ansat RNAi som et værktøj til at undersøge den rolle, NEDD9 i udviklingen af ​​livmoderhalskræft. Desuden blev et lentivirus genoverførselsvektor anvendes til eksogent overudtrykke NEDD9 i undersøgelsen. I vores eksperimenter, siRNA’er rettet mod NEDD9 gen effektivt hæmmede både mRNA og protein udtryk for NEDD9. FAK og SRC blev impliceret som vigtige mål for NEDD9 og de var phosphoryleret og aktiveret gensidigt, der blev betragtet som den “kerne regulering proces” af NEDD9 [7]. Faktisk funktioner af FAK og SRC-proteiner afhænger af deres tyrosinphosphorylering i nogle specifikke aminosyrerester i proteinerne (f.eks Tyr416 af SRC og Tyr397 af FAK). Således har vi opdaget tyrosinphosphorylering af FAK og SRC protein efter nedregulering eller opregulering af NEDD9 og fandt, at lukke munden af ​​NEDD9 resulterede i tyrosindephosphorylering, snarere end reduceret udtryk for både FAK og SRC. Interessant overekspression af NEDD9 førte til tyrosinphosphorylering af FAK og SRC. Desuden har vi også fundet tyrosin-phosphorylering snarere end ekspression af NEDD9 blev inhiberet mens tyrosin-phosphorylering af FAK eller SRC blev undertrykt af selektive inhibitorer, såsom PF-228 og PP2. Mange grupper har fundet NEDD9 er en nedstrøms molekyle af FAK og SRC som fremmer migration og invasion-signalering [39,40]. Imidlertid har flere undersøgelser for nylig vist, at NEDD9 formentlig fungeret som opstrøms signal af FAK og SRC [6,41]. Vedvarende reduceret FAK [6] og SRC [41] aktivering blev vist i celler afledt fra NEDD9 knockout-stammen. Vores resultater tyder på, at der kan være en positiv spiral af tyrosinphosphorylering mellem NEDD9 og FAK eller SRC. Derfor tyrosinphosphorylering var kontinuerlig styrkes via den såkaldte “core regulering proces”, og i sidste ende danne signaler om invasion og metastase.

Siden sin oprindelige funktionel analyse i 1996 [4,5], blev NEDD9 forbundet med migration , invasion, og metastase i forskellige undersøgelser. Law et al. først opdaget NEDD9 kunne regulere celle polarisering [4], som var et nødvendigt skridt i processen med celle migration. Cellemigrering er grundlaget for cancercelleinvasion og metastase. Hidtil blev NEDD9 fundet at deltage i cancermetastase i glioblastom [9], melanom [10], og brystcancer. I øjeblikket menes det, at NEDD9 protein er forbundet med migration, invasion og metastase af cancerceller [7,42]. Vores resultater viste, at NEDD9 protein blev overudtrykt i livmoderhalskræft væv med metastaser. Desuden hæmmer NEDD9 udtryk af RNAi svækket migration og invasion af livmoderhalskræft celler. Celler undergår epitel-mesenkymale overgang (EMT) mister deres epitelial morfologi og erhverve et motile fænotype, som spiller en central rolle i cancer invasion og metastase [43]. Vimentin og E-cadherin var vigtige biomarkører for epitelial-mesenkymale overgang (EMT). Western blot analyse viste, at shRNA mod NEDD9 reduceret ekspression af vimentin og forøget ekspression af E-cadherin og NEDD9 overekspression opreguleres vimentin og ned-reguleret E-cadherin, som ligner dem, der rapporteres af Tikhmyanova N [21]. Endvidere blev nedreguleret E-cadherin via overekspression af NEDD9 signifikant opreguleret i kraft af inhibitor af FAK eller SRC. Hverken tyrosin-phosphoryleret eller total NEDD9 var signifikant reguleret mens E-cadherin blev undertrykt. Vores resultater antyder, at NEDD9 overekspression fremmer migration og invasion af livmoderhalskræft celler sandsynligvis via i det mindste delvis, epithelial-mesenchymal overgang (EMT) pathway. E-cadherin er en downstream protein ifølge NEDD9 og kan være en central modulator af NEDD9-medieret cancer cellemigration og invasion.

Det er velkendt, at human papillomavirus (HPV) -infektion er den vigtigste ætiologiske faktor i cervikal cancer [44]. Infektion med høj risiko HPV (hr-HPV), især HPV type 16 og 18, er kausalt forbundet med udviklingen af ​​livmoderhalskræft. Talrige rapporter har konstateret, at høj-risiko HPV (hr-HPV) især stammer HPV type 16 og 18 er onkogen, som afhænger af de virale E6 og E7 onkogener, der er målrettet p53 og pRb tumor suppressor proteiner [45]. I betragtning af betydningen af ​​E6 /E7, vi den hypotese, at der var nogle forbindelser mellem E6 /E7 og NEDD9 i begyndelsen af ​​undersøgelsen. Men vi ikke oprette en forbindelse mellem E6 /E7 og NEDD9.