PLoS ONE: Karakterisering af prostatakræft knoglemetastaser Ifølge Expression Niveauer af steroidogeniske Enzymer og Androgen receptor Splice Variants

Abstrakt

Baggrund

Intra-tumoral steroidogenese konstituerende androgen receptor (AR) aktivitet har været forbundet med kastrationsresistent prostatacancer (CRPC). Denne undersøgelse havde til formål at undersøge, om CRPC knoglemetastaser udtrykte højere niveauer af steroid-konverterende enzymer end ubehandlede knoglemetastaser. Steroidogene enzym niveauer blev også analyseret i forhold til ekspressionen af ​​konstitutivt aktive AR-varianter (AR-Vs) samt kliniske og patologiske variabler.

Metode /vigtigste resultater

Ubehandlet, hormon-naive (HN , n = 9) og CRPC knoglemetastaser prøver (n = 45) blev opnået fra 54 patienter ved metastase kirurgi. Ikke-maligne og maligne prostata prøver blev erhvervet fra 13 prostatektomi prøver. Transcript og proteinniveauer blev analyseret ved real-time RT-PCR, immunohistokemi og immunblotting. Der blev ikke påvist forskelle i steroidogene enzym niveau mellem CRPC og HN knoglemetastaser. Markant højere niveauer af SRD5A1, AKR1C2, AKR1C3, og HSD17B10 mRNA blev dog fundet i knoglemetastaser end i ikke-maligne og /eller ondartet prostata væv, mens CYP11A1, CYP17A1, HSD3B2, SRD5A2 og HSD17B6 mRNA-niveauer i metastaser var væsentligt lavere . En undergruppe af metastaser udtrykte meget høje niveauer af AKR1C3, hvilket ikke var på grund af gen-forstærkning som undersøgt ved kopi nummer variation assay. Ingen association blev fundet mellem AKR1C3 udtryk og nuklear AR farvning, tumorcelleproliferation eller patient resultat efter metastaser kirurgi. Med kun én undtagelse, blev høj AR-V protein niveauer fundet i knoglemetastaser med lave AKR1C3 niveauer, mens metastaser med høje AKR1C3 niveauer indeholdt primært lave AR-V-niveauer, hvilket indikerer forskellige mekanismer bag kastration-resistens i individuelle knoglemetastaser.

konklusioner /betydning

induceret kapacitet konvertere binyre-kirtel afledt steroider til mere potente androgener blev indikeret i en undergruppe af PC knoglemetastaser. Dette var ikke associeret med CRPC men blot med fremskredent stadium af metastaser. Undergrupper af knoglemetastaser kunne identificeres i henhold til deres ekspressionsniveauer for AKR1C3 og AR-Vs, som kan være relevant for patientens respons på 2

nd line androgen-deprivation terapi

Henvisning:. Jernberg E, Thysell E, Bovinder Ylitalo E, Rudolfsson S, Crnalic S, Widmark A, et al. (2013) Karakterisering af prostatakræft knoglemetastaser Ifølge Expression Niveauer af steroidogeniske Enzymer og Androgen receptor Splice Varianter. PLoS ONE 8 (11): e77407. doi: 10,1371 /journal.pone.0077407

Redaktør: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: Maj 14, 2013; Accepteret: September 2, 2013; Udgivet: November 7, 2013 |

Copyright: © 2013 Jernberg et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den svenske Forskningsråd, den svenske Cancer Society, Cancer Research Foundation i Nordsverige, Løvens Cancer Research Foundation, og Umeå Universitet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den første linje behandling til patienter med fremskreden prostatacancer (PC) er androgen deprivation terapi (ADT). Denne terapi er effektiv i de fleste patienter, men efter en periode med indledende remission tumorer generelt tilbagefald, overvejende i knoglen, og derefter betegnes kastrationsresistent PC (CRPC).

På trods af lave cirkulerende niveauer af androgener hos kastrerede mænd størstedelen af ​​CRPC tumorer viser androgen receptor (AR) aktivitet og ekspression af AR regulerede gener [1]. Mulige mekanismer bag AR aktivitet i CRPC omfatter AR genamplifikation og mutationer, intratumoral syntese af androgener, og ekspression af konstitutivt aktive AR splejsningsvarianter [2], [3]. Især nogle CRPC tumorer og individuelle tumorceller i de fleste patienter, viser meget lav eller fravær af nukleare AR immunfarvning, og faktorer ned-stream AR er ikke nødvendigvis opreguleret i de tilfælde [4], [5], [6] [7]. Vi har for nylig karakteriseret en serie af hormon-naive (HN) og CRPC knoglemetastaser hos patienter ifølge AR aktivering og ekspression af AR splejsningsvarianter (AR-Vs) [5], [8]. Niveauer af AR-V7 (også betegnet AR3) [9], [10] og AR-V567es [11] varianter blev forøget i CRPC sammenlignet med HN metastaser og desuden fundet at være stærkt udtrykt i en undergruppe af CRPC patienter med særligt dårlig prognose [8]. AR-V7 og AR-V567es mangler ligandbindingsdomæne (LBD) og besidder konstitutiv aktivitet [9], og patienter, der udtrykker dem, AR-Vs viser sandsynligvis dårlig respons på ADT og anti-AR lægemidler rettet mod LBD. Nogle CRPC patienter imidlertid svare til 2

nd line ADT og dette kan skyldes intratumoral steroidogenese og produktion af testosteron, dihydrotestosteron (DHT), eller andre androgener ved høje nok til AR aktivering, som rapporteret af andre [13 ], [14], [15], [16]. Det er imidlertid ikke kendt, da disse steroidogene enzymer er opreguleret. Er de steg allerede i tidligere ubehandlede HN metastaser, eller som AR-Vs [8] steg som følge af kastration behandling? Et formål med denne undersøgelse var derfor at analysere ekspression af steroidbaserede konverterende enzymer potentielt er involveret i syntesen af ​​testosteron og DHT i et sæt af HN og CRPC knoglemetastaser opnået fra patienter ved metastase kirurgi. Desuden blev enzym ekspressionsniveauerne analyseres i forhold til ekspressionen af ​​AR-Vs, med henblik på at identificere potentielle forskellige mekanismer bag CRPC i individuelle knoglemetastaser.

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af den lokale etik revision bestyrelse Umeå Universitet, og deltagerne gav skriftlig eller mundtlig samtykke. På grund af den akutte situation, når knoglemetastaser operation er udført med henblik på at nødhjælp rygsøjlen symptomer og pareser, behøver logistik ikke altid muligt skriftligt samtykke og den lokale etik review board derfor specifikt godkendte også mundtlige samtykke. Verbal samtykke dokumenteres af lægen i patientens journal.

Patienter

knoglemetastaser væv blev opnået fra serie af friske frosne og formalinfikserede biopsier indsamlet fra patienter med PC drives for metastatisk spinal ledningen kompression eller patologiske frakturer ved Umeå Universitetshospital (2003-2011). Kliniske karakteristika og terapier er opsummeret i tabel 1, og denne patient serie er tidligere blevet beskrevet i Crnalic et al [5], [17], [18]. Undersøgelsen omfatter også 13 patienter, som blev behandlet med radikal prostatektomi ved Umeå Universitetshospital, mellem feb 2005 og september 2006. Median alder for patienterne var 60 år (spændvidde 48-68 år) og median PSA var 6,6 ng /ml (interval 3,5 -24 ng /ml). Elleve af patienterne havde tumorerne klassificeret som Gleason score (GS) 7 og to som GS 8. Fire af tumorerne var i trin T2 og ni i trin T3. Yderligere information om væv håndtering er tidligere blevet beskrevet i Hornberg et al [8].

Prøveforberedelse

Repræsentative områder af knoglemetastaser, primær PC og ikke-malign prostata væv var cryo -sectioned i udvinding rør og RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol-protokol (Invitrogen, Stockholm, Sverige) eller AllPrep DNA /RNA /Protein Mini Kit (Qiagen, Sollentuna, Sverige). For tilfælde var DNA og protein blev analyseret parallelt med RNA blev nukleinsyrer og protein isoleret fra de samme vævssnit ved hjælp af AllPrep metoden. Procentdelene af tumorceller i prøverne var over 50% i de fleste tilfælde. RNA og DNA-koncentrationer blev kvantificeret ved absorbansmålinger ved anvendelse af et spektrofotometer (ND-1000 spektrofotometer; NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE). Proteinkoncentrationen blev bestemt ved BCA-protein-assayet (Pierce Chemical Co., IL, USA). RNA kvalitet blev analyseret med 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) og verificeret til at have en RNA-integritet nummer ≥6.

Real time RT-PCR

RNA var vendes transkriberet med Superscript II revers transkriptase (Invitrogen) i et totalt volumen på 10 pi. Den efterfølgende PCR-amplifikation blev udført under anvendelse af Biorad iQ5 iCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) eller ABI PRISM 7900HT Instrument (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) i et totalt volumen på 20 pi ved anvendelse af IQ SYBR Grøn Supermix (Bio-Rad Laboratories) eller TaqMan genekspression mastermiksens (Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Stockholm, Sverige) i overensstemmelse med producentens protokoller. Primersekvenser er vist i tabel S1. Hver prøve blev kørt in duplo og korrigeret for de tilsvarende RPL13A mRNA-niveauer. Smeltekurveanalyse bekræftede de amplificerede produkter, som også blev analyseret ved 1% agarosegelelektroforese for at bekræfte den forventede størrelse (data ikke vist).

Immunhistokemi

Prøver blev fikseret i pufret formalin, afkalket i myresyre, og indlejret i paraffin [5]. Fem um paraffinsnit blev deparaffineret ifølge standardprocedurer, kogt i 0,01 M citratpuffer, pH 6,0, og immunfarvet for AKR1C3 (NP6-G6.A6, fortyndet 1:1000, Sigma, Saint Louis, Missouri, USA), AR (PG -21, fortyndet 1:25, Upstate, Lake Placid, NY, USA), PSA (A0562, fortyndet 1:2000, DAKO, Glostrup, Danmark) og Ki67 (MIB1, fortyndet 1:50, DAKO) med Ultraview Universal DAB Detection Kit (Ventana Medical Systems). Nuklear AR og cytoplasmatisk AKR1C3 og PSA farvning i tumor epitelceller blev scoret ifølge intensitet (0 = ingen farvning, 1 = svag, 2 = moderat, 3 = intens farvning) og fraktion af farvede celler (1 = 1-25%, 2 = 26-50%, 3 = 51-75%, 4 = 76-100%). En total score (i området fra 0-12) blev opnået ved at multiplicere farvningsintensiteten og fraktion scores. Ki67 blev scoret af evaluere 300-1000 tumor epitelceller per patient, som tidligere beskrevet [5].

Kopier nummer analyse

Det eksemplar nummer AKR1C3 genet i PC knoglemetastaser blev undersøgt ved hjælp af den Hs03060693_cn og Hs02574521_cn TaqMan kopi nummer analyser (Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Stockholm, Sverige), rettet AKR1C3 exon 2 og exon 7 hhv. Analyserne blev kørt ifølge producentens beskrivelse, med RNaseP som reference gen, og analyseret ved anvendelse af Copy Caller software (Applied Biosystems).

immunblotting

22Rv1 celler blev opretholdt i henhold til producentens anvisninger ( ATCC) og protein blev ekstraheret som ovenfor. Prøver (10 ug protein) blev adskilt ved 7,5% SDS-PAGE under reducerende betingelser og derefter overført til PVDF-membraner (Immobilon-P, Millipore, Billerica, MA). Membraner blev blokeret i 5% mælk efterfulgt af primære antistof inkubering i 4 ° C natten over (N-20-antistof, fortyndet 1:500 i 1% mælk /PBST, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) for at detektere den fulde længde AR og ca. 80 kDa trunkeret AR-vs med intakte N-terminaler. Det sekundære anti-kanin IgG (Dako, Glostrup, Danmark) antistof (fortyndet 1:20 000 i 2,5% mælk) blev påført efter vask i PBST og inkuberet i 1 time i RT. Proteinekspression blev visualiseret efter omfattende vask ved hjælp af ECL Advanced afsløring kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Filtrene blev derefter strippet, ifølge standardprocedurer, og analyseret for actin proteinniveauer ved hjælp af kanin-anti-actin-antistof fra Sigma (Saint Louis. Missouri), fortyndet 1:8000, for at sikre lige prøve loading. ECL signaler blev kvantificeret ved anvendelse af en ChemiDoc scanneren og Mængde One 4 software (Bio-Rad Laboratories). Intensiteten af ​​det 80 kDa store bånd i hver patientprøve blev analyseret og udtrykt i forhold til den tilsvarende fuldlængde AR båndintensitet. Den 22Rv1 celleekstrakt blev kørt som en positiv kontrolprøve på hver gel.

Statistisk analyse

Korrelationer mellem variabler blev analyseret ved anvendelse Spearman rank test. Grupper blev sammenlignet under anvendelse af Mann-Whitney U test for kontinuerlige variable og Chi-square test for kategoriske variable. Kaplan-Meier overlevelse analyse blev udført med død PC som begivenhed og opfølgning tid som tiden mellem metastaser kirurgi og de seneste opfølgende undersøgelse (december 2012). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af statistiske pakke for Social Sciences, SPSS 20,0 software (SPSS, Inc., Chicago, USA). En P-værdi mindre end eller lig med 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Ingen induktion af steroidogene enzymer i kastrationsresistent sammenlignet med hormon-naive knoglemetastaser

genekspressionsniveauer af vigtige enzymer involveret i dannelsen af ​​testosteron og DHT fra cholesterol (figur 1) blev vurderet ved RT-PCR-analyse af HN (n = 9) og CRPC knoglemetastaser (n = 45) sammenlignet med primær yderzone prostata tumor (n = 13) og ikke-malign prostata væv (n = 13).

Enzymer med betydeligt højere mRNA-niveauer observeret i knoglemetastaser end i ikke-malign og /eller malign prostata væv er vist med fed skrift og enzymer med et betydeligt lavere niveau observeret i knoglemetastaser er vist i

kursiv

. Steroider udskilles af binyrerne er fremhævet med gråt.

Ingen af ​​de analyserede enzymer i steroidgenesen pathway (Figur 1 og 2) viste signifikant forskellige mRNA ekspression niveauer mellem HN og CRPC knoglemetastaser (til sammenligning mellem metastaser og prostatavæv se nedenfor). Variabiliteten mellem forskellige CRPC metastaser var dog stor og personer med særlig høj ekspression af specifikke steroidogene enzymer blev observeret i CRPC gruppe (figur 2).

Alle mRNA niveauer blev korrigeret for mRNA niveauer af housekeeping gen RPL13A og normaliseret til medianværdien af ​​de primære tumor prøver. * P 0,05. ** P 0,01, *** P 0,001. Åbne cirkler indikerer outliers og ekstremer. X angiver ekstreme niveauer uden for skalaen.

Prostatakræft knoglemetastaser kan konvertere svage cirkulerende androgener til mere potente dem, men sandsynligvis har lav generel kapacitet til de-novo steroidproduktionen

Udskrift niveauer af enzymer i de tidlige trin i steroidogenese blev reduceret i HN- og CRPC knoglemetastaser sammenlignet med ikke-malign prostata væv (figur 2); median CYP11A1, CYP17A1, og HSD3B2 mRNA-niveauer var 0,15, 0,29, og 0,32 gange i HN og 0,14, 0,32 og 0,31 gange i CRPC knoglemetastaser sammenlignet med niveauerne i ikke-maligne prostata væv (P = 0,004, 0,025 og 0,071, og P = 0,00004, 0,019 og 0,01, henholdsvis). Medianen CYP11A1 mRNA niveau i CRPC metastaser var 0,41 gange sammenlignet med niveauet i den primære tumorvæv (P = 0,011, figur 2), mens CYP17A1 og HSD3B2 mRNA-niveauer i CRPC knoglemetastaser ikke var signifikant forskellig fra niveauet i den primære tumorvæv. Imidlertid blev CYP11A1 mRNA niveauer korreleret til den tilsvarende CYP17A1, HSD3B2, SRD5A1 og SRD5A2 mRNA niveauer i CRPC metastaser (Rs = 0,80, P 0,000001, Rs = 0,740, P 0,000001, Rs = 0,53, P 0,0002, og rs = 0,70, P. 0,000001), hvilket indikerer, at de tidlige trin i steroidgenesen kan være aktiv i individuelle metastaser

transkriptniveauer af mange enzymer involveret i senere trin af androgen syntese blev forøget i metastaser i sammenligning med ikke-malign prostata og primær tumorvæv (figur 2). Median AKR1C3 og AKR1C2 mRNA niveauer var 5,5 og 5,4 gange højere i HN (P = 0,03, P = 0,007) og 3,7 og 5,8 gange højere i CRPC knoglemetastaser (P = 0,0006, P = 0,00008), henholdsvis i forhold til primær prostatatumorer. Vi observerede et skift fra SRD5A2 til SRD5A1 mRNA-ekspression med progression fra ikke-malign prostata til PC og PC metastase (figur 2), hvilket er i overensstemmelse med resultaterne i tidligere undersøgelser [14], [15], [19]. En lignende skift fra primært HSD17B6 ekspression i ikke-maligne og primær prostata tumorvæv til hovedsagelig HSD17B10 ekspression i PC metastaser blev endvidere bemærket (figur 2). De AKR1C3 mRNA niveauer var signifikant korreleret til AKR1C2 og UGT2B15 mRNA-niveauer (Rs = 0.39, P = 0,008 og Rs = 0,49, P = 0,001).

Tilsammen disse resultater viser, at pc-knoglemetastaser hos patienter kan have induceret kapacitet til at konvertere androgener med lav AR affinitet til mere potente androgener, mens

de novo

syntese af androgener fra kolesterol er mindre sandsynligt.

Nogle knoglemetastaser udtrykker meget høje niveauer af AKR1C3

Selv om ingen af ​​de undersøgte steroidogene enzymer udviste signifikant forøget ekspressionsniveauer i CRPC sammenlignet med HN knoglemetastaser blev individuelle CRPC metastaser bemærkes at udtrykke meget høje transkriptniveauer (figur 2). Et enzym, der viser særligt høje mRNA-niveauer i en undergruppe af CRPC metastaser var AKR1C3. Da dette enzym har kapacitet til at konvertere cirkulerende DHEA og androstendion (syntetiseres i binyrerne) i 5-androstendiol og testosteron, blev det anset for at være af særlig interesse.

For at afgøre, om AKR1C3 mRNA-niveauer i metastaser blev afspejlet i de tilsvarende proteinniveauer, vurderede vi AKR1C3 proteinekspression ved immunhistokemi og ved anvendelse af et pointsystem, der tog både farvning intensitet og fordeling i betragtning (figur 3). Cytoplasmisk AKR1C3 immunfarvning blev påvist i de fleste tumor epitelceller mens nuklear farvning var heterogent observerede og ikke scoret. Alle metastaser udviste kraftig positiv farvning i endotelcellerne, hvorimod variabel farvning blev observeret i fibroblaster og hæmatopoietiske celler i knoglemarven. Den AKR1C3 immunfarvning samlede score var stærkt korreleret til AKR1C3 mRNA-niveauer i de tilsvarende metastaser (Rs = 0,73, P 0,000001, n = 51). Høj AKR1C3 ekspression ikke skyldtes AKR1C3 genamplifikation, ifølge AKR1C3 genkopiantallet analyse af 6 metastaser prøver (3 prøver med ekstreme AKR1C3 mRNA-niveauer og totale Immunofarvning score på 12 og 3 prøver med lav AKR1C3 ekspression) i forhold til 2 ikke- maligne prostata prøver (data ikke vist).

En total score (i området fra 0-12) blev opnået ved at gange farvningsintensitet score (0-3) i tumoren epitelceller med den positive fraktion score (1 -4). (A) Histogram ifølge samlede AKR1C3 farvning score i hormon-naive (grå) og kastrationsresistent (sort) knoglemetastaser. (B) repræsentativt udsnit af knoglemetastaser med AKR1C3 samlet score 0. (c) repræsentativt udsnit af knoglemetastaser med AKR1C3 samlede score 12. Bar indikerer 100 uM.

I de CRPC knoglemetastaser, den AKR1C3 samlede farvning point er korreleret til UGT2B15 mRNA-niveauer (Rs = 0,39, P = 0,009, n = 43), hvilket kunne tyde på DHT produktion i metastaser med høj AKR1C3 proteinekspression. Det var dog tydeligt, at høj AKR1C3 proteinekspression ikke var direkte forbundet med høj AR aktivitet i CRPC metastaser; 14 ud af 18 (78%) prøver med høj AKR1C3 farvning scoringer, defineret som en AKR1C3 immunfarvning score over median (6), og 15/25 (60%) prøver med lav AKR1C3 farvning scores (≤6) viste høj nukleare AR farvning scores (≥8 frem median, som defineret i [5], P = 0,22). I overensstemmelse med tidligere resultater [5], blev høj AR immunofarvning i metastaserne associeret med kortere cancer-specifik overlevelse efter metastase kirurgi (log-rank = 8,1, P = 0,004, n = 45). I modsætning hertil var der ingen korrelation mellem AKR1C3 immunfarvning og cancer-specifik overlevelse CRPC patienter efter metastase kirurgi (data ikke vist). Der var også nogen association observeret mellem AKR1C3 immunfarvning score og PSA-farvning score (data ikke vist) eller tumorcelleproliferation indeks (Ki67-farvning score, data ikke vist).

Ekspression af steroidogene enzymer i forhold til niveauer af androgen receptor splejsning varianter

AR protein niveauer blev undersøgt ved immunoblotanalyse af 29 CRPC knoglemetastaser udvalgte baseret på AR immunhistokemi resultater til at omfatte AR lav til AR høj score metastaser, og hvor passende væv forblev at tillade immunoblot analyse. Den fulde længde AR omtrentlig 110 kDa blev påvist i de fleste tilfælde, mens trunkeret AR-Vs på ca. 80 kDa, hypotese at repræsentere AR splejsningsvarianter som mangler LBD C-terminale domæne, blev påvist i nogle tilfælde (figur 4). Intensiteten af ​​80 kDa-bånd blev stærkt korreleret til tilsvarende AR-V7 mRNA-niveau (Rs = 0,76, P 0,000002, data ikke vist), i overensstemmelse med egne tidligere resultater [8]. I Hornberg et al [8] patienter med høje niveauer af metastase AR-V7-mRNA, defineret til at have mRNA niveauer i den øvre kvartil, viste sig at have ekstremt dårlig prognose. Baseret på denne viden, og ved hjælp af en lignende tilgang, blev 7 prøver analyseret ved immunblotting defineret til at udtrykke høje niveauer af AR-Vs som forholdet mellem intensiteterne af de 80 og kDa båndene 110 blev fundet i 75

percentil af dataene (≥0.5).

Analyse blev udført under anvendelse af et antistof rettet mod det N-terminale domæne af AR. Den 22Rv1 celleekstrakt var inkluderet som en positiv kontrol.

Interessant kun en ud af 13 (7,8%) CRPC metastaser med høj AKR1C3 ekspression (immunfarvning score over medianen) viste også høj AR-V-protein niveauer. Dette var en væsentlig lavere fraktion end findes blandt metastaser med lave AKR1C3 niveauer (6/15, 40%, P = 0,049). Vi hypotese endvidere, at tumorceller udtryk for AKR1C3 og konstitutivt aktive AR varianter kunne være relevant for individuelle tumor respons på 2

nd line ADT og klinisk progression [8], og de 28 knoglemetastaser evalueret for både AKR1C3 og AR-V udtryk blev derfor opdelt i henhold til deres AR-V og AKR1C3 proteinekspressionsniveauer, som vist i figur 5, for at vise undergrupper af mulig klinisk relevans.

Høje niveauer AKR1C3 var dybest set findes i metastaser med lav niveauer af AR-vs og omvendt (P = 0.049, ifølge Chi-square test).

Navnlig ingen af ​​metastaser med homogen AKR1C3 farvning, dvs. del af positivt farvede celler på over 75% viste høje AR-V-niveauer i forhold til 7/15 metastaser med 75% positivt farvede celler (P = 0,004). Denne observation fortjener at blive undersøgt yderligere, da det kan indikere, at høj AR-V niveauer induceret foretrække i tumorer celler uden endogene steroidgenesen. Desværre var vi ikke i stand til at studere denne hypotese heterogenitet blandt tumorceller som antistoffer til immunhistokemisk evaluering af AR-Vs ikke var til rådighed.

Diskussion

intratumoral syntese af testosteron og DHT har været foreslået at bidrage til CRPC vækst. I denne undersøgelse sammenlignet vi ekspressionsniveauerne af steroidogene enzymer i CRPC knoglemetastaser med niveauer i metastaser opnået fra un-behandlede patienter og, overraskende fundet nogen induktion af de undersøgte enzymer i CRPC forhold til HN metastaser. Vi imidlertid fundet høje ekspressionsniveauer af visse steroidogene enzymer; SRD5A1, AKR1C2, AKR1C3, og HSD17B10, i knoglemetastaser sammenlignet med ikke-malign prostata og primær prostata tumorvæv. Desuden var vi i stand til at vise tydelige forskelle i ekspressionsniveauer af AKR1C3 og niveauer af AR splejsningsvarianter i individuelle tilfælde af CRPC knoglemetastaser, som vi har hypoteser kunne være relevant for patientens respons på 2

nd line behandlingsformer.

Tissue androgener kan være afledt af

de novo

syntese af kolesterol [20], [21] eller ved konvertering af adrenal forstadier til mere potente steroider [22]. Vores resultater viser generelt høje niveauer af AKR1C3 og SRD5A1 i metastaser er i overensstemmelse med tidligere rapporter [14], [15], [16] og kan indikere syntese af testosteron og DHT i et og to trin henholdsvis fra binyre-afledte androstendion . Ved aktiviteten af ​​SRD5A1 kunne DHT også syntetiseres via 5α-reduktion af androstendion til androstandion og derefter ved yderligere reduktion af androstandion til DHT ved AKR1C3. Denne rute for DHT syntese, der omgår testosteron, blev for nylig vist ved Chang og medarbejdere til at dominere i CRPC cellelinier såvel som i patientens metastaser eksemplarer stimuleret med androstendion [23]. Derudover de høje niveauer af AKR1C2 og HSD17B10 gøre DHT syntese via androstenon og androstanediol mulig i enkelte tilfælde, svarende til hvad der er blevet observeret i PC cellelinier såvel som i kastrationsresistent CWR22R xenografter hos mus [24]. Intratumoral syntese af androstenon og androstanediol kunne stimulere tumorvækst ikke kun som mellemliggende steroider i DHT syntese, men også som potente AR aktivatorer i tilfælde med muterede AR’er [25]. Ligeledes kunne androstenediol, presumingly fremstillet af DHEA i metastaser med AKR1C3 aktivitet aktivere Ars med specifikke mutationer [26]. I modsætning til tidlige rapporter [14], [15], men i tråd med Hofland og medarbejdere [16], fandt vi lave ekspressionsniveauer af CYP11A1, CYP17A1 og HSD3B2 i både ubehandlede og CRPC metastaser. Høj CYP11A1, CYP17A1 og HSD3B2 mRNA niveauer blev i stedet fundet i ikke-maligne prostata væv, sandsynligvis på grund af høj syntese af disse enzymer i normale prostata stromale celler, og det samme var tilfældet for SRD5A2 og HSD17B6 [27], [28], [ ,,,0],29], [30]. Fra denne vil vi gerne konkludere, at adrenale-afledte androgener sandsynligvis bidrage til vækst i CRPC knoglemetastaser ved deres intra-metastatisk omdannelse til mere potente androgener, mens

de novo

syntese af androgener fra kolesterol inden metastaser er mindre sandsynligt , undtagen måske i enkelte tilfælde med korreleret udtryk for CYP11A1, CYP17A1, og HSD3B2.

Vi fandt høje ekspressionsniveauer af AKR1C3 i en undergruppe af pc knoglemetastaser, som bekræfter resultater tidligere rapporteret i kastrationsresistent primær prostata tumorer [16], [31] og CRPC væv af forskellige metastatisk oprindelse [14], [15], [32]. En stigning i AKR1C3 aktivitet kunne naturligvis bidrage til omdannelsen af ​​adrenale-afledte steroider i mere potente AR ligander, som beskrevet ovenfor, og at AR aktivering i CRPC. Ligeledes Hamid og medarbejdere demonstrerede AKR1C3 afhængig syntese af testosteron i CRPC celler stimuleret med DHEA [31]. Gavnlige virkninger af høje AKR1C3 niveauer i HN metastaser eller i metastaser med lav nukleare AR immunfarvning som påvist i nogle tilfælde i denne undersøgelse, er mindre klar, men kan afhænge af andre reaktioner, der drives af dette enzym. Ud over 17β-hydroxysteroid dehydrogenase (17β-HSD) aktivitet AKR1C3 også besidder prostaglandin F (PGF) syntase-aktivitet, som ville føre til proliferation i PC celler er uafhængige af androgen og AR status på grund af dannelsen af ​​PGF epimerer og aktivering af FP receptor og også ved at forebygge PGJ2 dannelse og dens pro-differentierende og anti-proliferative virkninger [33].

Afslutningsvis ønsker vi at understrege, at øget tumor udtryk for steroidogene enzymer i individuelle patienter er ikke klart forbundet med CRPC men blot associeret med fremskreden tumor stadium, som det kan ses ikke blot i CRPC væv af forskellig oprindelse [14], [15], [16], [31], [32], men også hos tidligere ubehandlet, HN, knoglemetastaser (denne undersøgelse). Desuden er denne undersøgelse sammen med tidligere undersøgelser viser, at CRPC tumorer kunne klassificeres efter distinkte ekspressionsmønstre af steroidogene enzymer, og dermed sandsynligvis forskellige mekanismer bag kastration-modstand (denne undersøgelse, og [16], [32], [34]). Vi viser desuden, at undergruppen af ​​CRPC knoglemetastaser udtrykker høje niveauer af AKR1C3 er stort set forskellig fra undergruppen udtrykker høje niveauer af LBD-afkortet, konstitutivt aktiv AR-Vs. Den mulige kliniske relevans af dette er, at patienter med højt AKR1C3 udtryk og lav AR-V udtryk kan være patienter, der viser god respons på behandling med abirateronacetat (CYP17 hæmning, [35]) og /eller vil have gavn af medicin rettet mod AKR1C3 [36] , mens patienter med høj ekspression af konstitutivt aktiv AR-vs sandsynligvis reagerer ikke på abirateronacetat eller enhver terapi rettet mod androgen syntese eller LBD af AR.

En begrænsning til dette arbejde er begrænset antal knogle metastaser, og desuden den eneste metastaser prøve undersøgt fra hver patienter, hvilket naturligvis gør konklusioner om denne heterogene sygdom og overordnede patient status usikker. Vi er også klar over, at ekspressionsniveauerne ikke nødvendigvis afspejler biologiske aktiviteter og vores hypotese, at tumor udtryk mønster af steroidogene AKR1C3 og konstitutivt aktive AR varianter ville forudsige respons på 2

nd line behandlinger af CRPC skal testes på forhånd i kliniske studier.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Primer sekvenser anvendes til real-time RT-PCR-analyse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0077407.s001

(DOC)

Tak

Dygtig teknisk bistand blev leveret af fru Pernilla Andersson, Elisabeth Dahlberg, Birgitta Ekblom, og Inger Lindström.