PLoS ONE: Tab af Nek11 Forhindrer G2 /M Arrest og Fremmer celledød i HCT116 Kolorektal Cancer celler udsat for terapeutiske DNA-ødelæggende Agents

Abstrakt

Nek11 kinase er en potentiel mediator af DNA skade responset, hvis udtryk opreguleres i tidlige stadie tarmkræft (CRCs). Her, under anvendelse RNAi-medieret depletion, undersøgte vi rolle Nek11 i HCT116 WT og p53-nul CRC celler udsat for ioniserende stråling (IR) eller kemoterapeutisk lægemiddel, irinotecan. Vi viser, at udtømning af Nek11 forhindrer G2 /M standsning induceret af disse genotoksiske midler og fremmer p53-afhængig apoptose både i nærvær og fravær af DNA-skade. Interessant, Nek11 udtømning førte også til langsigtet tab af cellelevedygtighed, der var uafhængig af p53 og forværret efter IR eksponering. CRC celler udtrykker fire splejsningsvarianter af Nek11 (L /S /C /D). Disse er overvejende cytoplasmatisk, men undergår nucleocytoplasmic shuttling medieret gennem tilstødende nukleare import og eksport-signaler i den C-terminale ikke-katalytiske domæne. I HCT116 celler, Nek11S især har en vigtig rolle i DNA skade responset. Disse data giver stærke beviser for, at Nek11 bidrager til respons CRC celler til genotoksiske stoffer og er afgørende for overlevelse enten med eller uden udsættelse for DNA-skader

Henvisning:. Sabir SR, Sahota NK, Jones GDD, Fry AM (2015) Tab af Nek11 Forhindrer G2 /M Arrest og Fremmer celledød i HCT116 Kolorektal Cancer celler udsat for Therapeutic DNA Skadelige Agenter. PLoS ONE 10 (10): e0140975. doi: 10,1371 /journal.pone.0140975

Redaktør: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Frankrig

Modtaget: August 15, 2014 Accepteret: 3 Oktober 2015; Udgivet: 26 oktober 2015

Copyright: © 2015 Sabir et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af tilskud til AMF fra The Wellcome Trust (082.828, https://www.wellcome.ac.uk), Cancer Research UK (. C1420 /A9363, https://www.cancerresearchuk.org), Association for International Cancer Research (AICR 13-0042, https://www.aicr.org.uk), og en ph.d. studentship fra University of Leicester (http : //www.le.ac.uk). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft i den vestlige verden. Aktuel standard pleje for CRC patienter efter kirurgi indebærer kemoterapi kombinationer, der normalt omfatter DNA-ødelæggende midler. For eksempel har mange patienter får FOLFIRI som første linie terapi, en kombination af folinsyre, 5-fluorouracil (5-FU) og irinotecan [1]. 5-FU er en pyrimidin-analog, der blokerer DNA-syntese gennem inhibering DNA-polymerase, mens folinsyre potenserer virkningen af ​​5-FU ved at hæmme thymidylatsyntase. Irinotecan er en inhibitor af topoisomerase I, der forårsager enkeltstrengede DNA-brud, som normalt derefter konverteres til dobbeltstrengede brud (DSB’er). Disse aktivere DNA damage checkpoints og forårsage standsning af cellecyklussen på G1 /S eller G2 /M.

DNA beskadigelse respons (DDR) er et komplekst netværk af cellulære processer, der fører til flere resultater, herunder DNA-reparation , standsning af cellecyklus, senescens og apoptose [2, 3]. Den specifikke udfald bestemmes af mange faktorer, herunder omfanget og typen af ​​skader, og integriteten af ​​forskellige DDR veje. Succesen med DNA skadelige stoffer i kræftbehandlingen er afhængig af den øgede følsomhed kort cyklustid, kræftceller, der har svækket DDR veje. Disse forskelle i forhold til normale celler giver det terapeutiske vindue kræves for effekt. Imidlertid er det aktuelle valg af disse midler overvejende baseret på tumortype forbundet med signifikant toksicitet og en bedre forståelse af, hvilke faktorer diktere reaktion på disse stoffer ville føre til mere raffineret og personlige behandlinger.

DDR veje indledes gennem aktivering af ATM eller ATR som svar på DSBs, gået i stå replikationsgafler eller ændringer i kromatinstruktur forbundet med DNA-addukter [2, 3]. For at starte cellecyklusstop, disse kinaser phosphorylerer nedstrøms mål, herunder Chk1, Chk2 og p53. Phosphorylering af p53 fører til dets stabilisering og forøget ekspression af dets transkriptionelle mål, p21. Chk1 og Chk2 phosphorylere og inaktivere Cdc25 phosphatase ved at fremme sin nedbrydning eller cytoplasmatisk beslaglæggelse. Sammen forøget ekspression af p21 og tab af Cdc25 funktion blokerer aktiveringen af ​​Cdk’er nødvendig for G1 /S og G2 /M-overgange. Men dette er en lille øjebliksbillede af, hvad der nu forstås meget komplekse veje, der involverer mange andre enzymatiske, regulatoriske og strukturelle komponenter.

Et sæt af proteiner, der er begyndt at dukke op som vigtige regulatorer af DDR er NIMA-relaterede eller NEK, proteinkinasefamilie [4]. Denne familie består af elleve medlemmer, hvoraf mindst fire, Nek1, Nek8, Nek10 og Nek11, har mistanke om roller i DDR [5-10]. Nek11 var den første af disse at være impliceret når dens kinaseaktivitet blev fundet at være forhøjet i celler udsat for DNA-beskadigende midler og replikations-inhibitorer [9]. Desuden er denne aktivitet tabt ved tilsætning af ATM /ATR-inhibitor, koffein, hvilket antyder, at Nek11 virker nedstrøms for ATM eller ATR. Nyere mekanistiske undersøgelser afslørede, at Nek11 aktiveres via phosphorylering på Ser-273 af Chk1 ved eksponering af celler for ioniserende stråling (IR) [7]. Aktiveret Nek11 er i stand til at phosphorylere Cdc25A på websteder inden for en phosphodegron der fremmer rekruttering af β-TrCP. Dette vil igen fører til ubiquitinmedieret nedbrydning af Cdc25A og cellecyklusstop [11-13]. Andre har imidlertid fremført, at phosphorylering-afhængige nedbrydning af Cdc25 medieres af alternative kinaser, såsom casein kinase 1 [14, 15]. Alligevel Nek11 er også blevet rapporteret at være en potentielt relevant cancer biomarkør forhøjet Nek11 ekspression blev detekteret i et sæt af kolorektale adenomer [16]. Vi har derfor sat sig for at teste, om Nek11 er nødvendig for respons CRC celler til klinisk relevante DNA-ødelæggende midler, samt søge yderligere bevis for en rolle for Nek11 i DDR.

Resultater

Nek11 er nødvendig for IR-induceret G2 /M anholdelse af HCT116 celler

for at undersøge, hvordan Nek11 kunne bidrage til DDR af CRC celler, en protokol blev fastslået, at lov cellecyklusprogression skal overvåges ved flowcytometri følge Nek11 udtømning og IR eksponering (fig 1A). Nek11 blev depleteret ved hjælp af en af ​​to forskellige siRNA’er med effektiviteten af ​​disse oligonukleotider bekræftet efter 72 timer transfektion ved RT-PCR og Western blot (S1A og S1B Fig). Ved hjælp af et dosisområde på IR, blev det bestemt, at HCT116 CRC cellelinje udviste en stor stigning i G2 /M fraktionen 16 timer efter eksponering med 10 Gy IR (S1c Fig). Derfor, i disse eksperimenter blev celler først transficeres med kontrol (GL2 luciferase) eller Nek11 siRNAs og derefter, efter 56 timer, var de enten ubehandlet eller udsættes for 10 Gy IR. Efter yderligere 16 timer blev de opsamlet til analyse ved propidiumiodid (PI) -baseret flowcytometri (fig 1B og 1C, S1D, S1E, S2A og S2B figurerne).

A. Skematisk fremstilling af tidsforløbet for cellebehandlinger. 24 timer efter podning blev celler transficeret med siRNA oligonukleotider. 56 timer senere blev celler enten ubehandlet eller bestrålet (± IR). De blev derefter opsamlet og fikseret til PI-baserede flowcytometri efter yderligere 16 timer. B C. Ved at følge protokollen beskrevet i A, HCT116 WT og p53-nul-celler blev transficeret med siRNA’er som angivet og efterladt ubehandlet (B) eller behandlet med 10 Gy IR (C), før analyse ved flowcytometri. Fordeling af celler ifølge flowcytometri profil vises (2n, G1; 2n-4n, S; 4n, G2 /M). D-G. Histogrammer repræsenterer procentdelen af ​​cykling HCT116 WT (D, E) og p53-nul (F, G) celler på G2 /M. H-K. Histogrammer viser procentdel af alle HCT116 WT (H, I) og p53-nul (J, K) celler med sub-2n DNA. Histogrammer i DK er taget fra data vist i B og C.

s

værdier beregnes i forhold til siGL2.

Brug denne protokol, ingen signifikant ændring blev observeret i den del af cykling celler i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus efter Nek11 udtømning uden IR (~ 30%, fig 1D). Men efter IR eksponering, celler depleteret for Nek11 udviste en væsentlig reduktion i G2 /M fraktionen sammenlignet med celler depleteret med kontrol-oligonukleotider, med siNek11-2 forårsager en tilbagevenden til det basale niveau af G2 /M-celler (Fig 1E). Vi bemærker, at siNek11-2 gav en mere robust knockdown end siNek11-1 ved RT-PCR og Western blot. For at undersøge, hvilken rolle p53 i dette svar, blev den samme eksperimentelle fremgangsmåde anvendes på isogene HCT116 p53-nul (p53

– /-) celler. Udtømning af Nek11 alene igen havde ingen signifikant effekt på cellecyklus distribution i fravær af IR, mens der var en markant reduktion i G2 /M anholdelse i respons på IR behandling efter Nek11 depletion (Fig 1F og 1G). Men i dette tilfælde hverken siRNA forårsagede en fuldstændig tilbagevenden til basale niveauer af G2 /M-celler antyder, at tabet af G2 /M checkpoint kontrollen i fravær af Nek11 er dels p53-afhængig.

I tillæg tillader cellecyklusfordeling skal bestemmes, flowcytometri analyse viste tilstedeværelsen af ​​celledød som angivet af sub-2n højdepunkt. Sammenligning af procentdelen i denne fraktion (i forhold til alle celler i prøven) viste en beskeden stigning i celledød på Nek11 udtømning uden IR, selvom signifikans (p 0,05) kun blev nået med et oligonukleotid (Fig 1 H). Imidlertid celledød øges i højere grad i Nek11 forarmet prøver efter IR eksponering antyder, at kombineret behandling forøget celledød (Fig 1I). Derimod var der kun en lille stigning i sub-2n population af HCT116 p53-nul celler efter Nek11 udtømning før IR eksponering, og selv om der var flere celler i sub-2n fraktion efter IR eksponering, der var ikke en konsekvent stigning upon Nek11 depletion (fig 1J og 1K). Vi konkluderer derfor, at induktion af celledød, at resultaterne fra kombineret Nek11 tab og IR eksponering er i høj grad afhængig af p53.

Nek11 er påkrævet for at forhindre apoptose og fremme en langsigtet celleoverlevelse

Som PI-baseret flowcytometri angivet celledød efter Nek11 udtømning, med eller uden IR eksponering, besluttede vi at specifikt måle apoptose. Til dette blev den samme protokol fulgt som før, bortset fra at flowcytometri blev udført under anvendelse annexin V-baserede farvning til måling af tab af plasmamembran phospholipid asymmetri, der opstår under apoptose. Udtømning af Nek11 uden IR eksponering førte til en ~ 2-3 gange stigning i apoptose i HCT116 WT-celler bekræfter, at Nek11 fremmer overlevelse i fravær af DNA-skader (figur 2A). Desuden mens udsættelse for 10 Gy IR alene ikke øge andelen af ​​HCT116 WT celler undergår apoptose, var der en forbedring i apoptotiske fraktion efter kombineret Nek11 udtømning og IR eksponering i forhold til Nek11 udtømning alene (figur 2B). I HCT116 p53-nul-celler, alene Nek11 udtømning bevirkede ikke en signifikant stigning i apoptose, mens der kun var en lille stigning i apoptose i HCT116 p53-nul-celler, når Nek11 depletering blev kombineret med IR (Fig 2C og 2D). Disse data er i overensstemmelse med dem, der opnås ved anvendelse af PI-baserede farvning og viser, at tabet af Nek11 fører til en p53-afhængig induktion af apoptose, der forværres af IR eksponering.

A-D. Ifølge protokollen beskrevet i fig 1A, HCT116 WT (A, B) og p53-nul (C, D) -celler blev transficeret med siRNA’er som angivet, før bestråling og analyse ved annexin V-baserede flowcytometri. Histogrammer repræsenterer procentdelen af ​​alle celler i apoptose.

s

værdier er i forhold til siGL2. E. HCT116 WT og p53-nul-celler blev transficeret med siRNA’er som angivet og efter 56 timer behandlet ± 2 Gy IR. Celler blev opsamlet efter yderligere 16 timer og udpladet for klonogene assays (50 celler per plade for siGL2, 500 celler per plade for andre behandlinger). Kolonier blev farvet med krystalviolet. F. Kolonier fra E blev talt og% overlevelse bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. G. HCT116 p53-nul-celler blev transficeret med enten siGL2 eller siNek11-2 og efter 56 timer enten venstre ubehandlet eller bestrålet. Celler blev fikseret 48 timer efter IR og farvet med α-tubulin-antistof (grøn). DNA blev farvet med Hoechst for at observere cellekernemorfologi. Scale barer, 10 um. H. Histogram repræsenterer procentdelen af ​​celler, der udviser flere kerner efter de behandlinger, der er angivet som beskrevet i G. 500 celler blev talt per prøve og den gennemsnitlige procentdel af multinucleare celler blev bestemt på tværs af to uafhængige forsøg.

Til undersøge langsigtede overlevelse, blev klonogene assays udført, hvor celler blev depleteret med kontrol eller Nek11 siRNAs i 56 timer og derefter udsat for en lavere dosis (2 Gy) IR før udpladning 16 timer senere. Efter to uger blev kolonierne fikseret og talt (fig 2E og 2F). Først og fremmest, dette viste, at selv i kontrol- forarmet prøver, denne dosis af IR var tilstrækkelig til at forårsage væsentligt reduceret (~ 3-fold) koloni nummer ikke kun i HCT116 WT celler, men også den HCT116 p53-nul-celler. Så selvom IR ikke inducerer væsentlig celledød eller apoptose med korte tidspunkter efter eksponering, betyder det forårsage langsigtede tab af overlevelse, der forekommer i en p53-uafhængig måde. Interessant, udtømning af Nek11 alene havde også en stærkt skadelig virkning på overlevelse med en 5 gange reduktion i antallet af kolonier i HCT116 WT celler. Igen blev en lignende nedgang i antallet af kolonier set med HCT116 p53-nul-celler. Kombinationen af ​​Nek11 udtømning og IR eksponering førte til det største tab af levedygtighed med ~ 10 gange reduktion i antallet af kolonier i både HCT116 WT og p53-nul-celler. Vi konkluderer derfor, at overlevelsen af ​​HCT116 celler langsigtede drastisk reduceres i afhængighed af IR eksponering, Nek11 udtømning eller en kombination af begge. Desuden er disse reaktioner er ikke afhængige af p53, hvilket indikerer, at p53-uafhængig død veje er aktiveret.

For at undersøge, om den langsigtede tab af celle overlevelse efter disse behandlinger kan skyldes mitotisk katastrofe, mock eller Nek11- udtømte HCT116 celler var enten ubehandlet eller udsættes for IR og derefter fastsat for mikroskopisk analyse efter yderligere 48 timer. Tilstedeværelsen af ​​store flerkernede celler indikative mislykkede mitotiske divisioner (dvs. mitotisk katastrofe) blev set i respons på enten Nek11 udtømning eller IR eksponering (Fig 2G). kvantificering af flerkernede celler afslørede imidlertid, at udtømningen af ​​Nek11 alene førte til et relativt lille hyppighed af mitotisk katastrofe, hvorimod en væsentlig højere frekvens blev observeret som respons på IR-behandling alene (fig 2H). Lignende resultater blev observeret i både WT og p53-nul celler, bortset fra at mitotisk katastrofe som reaktion på IR var endnu mere udtalt i p53-nul celler er i overensstemmelse med tidligere rapporter [17, 18]. De høje niveauer af mitotisk katastrofe induceret af IR alene tyder på, at dette er en væsentlig årsag til den reducerede levedygtigheden ses i klonogene assays. Men de lavere niveauer af mitotisk katastrofe induceret ved udtømning af Nek11 alene snarere argumentere for alternative mekanismer reduceret kolonidannelse, såsom skader fremkaldt ældning.

Nek11 medierer G2 /M anholdelse i HCT116 celler behandlet med irinotecan

CRC patienter ofte får irinotecan, en topoisomerase i-inhibitor, som en del af deres behandling med kemoterapi. PI-baserede flowcytometri bekræftet, at HCT116-celler udviser en dosis respons på dette DNA-ødelæggende middel, med en ophobning af celler i G2 /M følgende 24 timers behandling (S3A Fig). En protokol blev derfor anvendt, tilladt os at sammenligne responset af HCT116 WT og p53-nul-celler for irinotecan den, der ses for IR. I dette tilfælde blev celler udtømt for Nek11 i 52 timer før tilsætning af irinotecan ved 5 uM. Efter yderligere 20 timer blev celler opsamlet til analyse ved flowcytometri (fig 3A-3C og S2C og S2D Fig). For det første viste dette, at, som med IR, ophobning af HCT116 WT celler i G2 /M i afhængighed irinotecan blev undertrykt efter Nek11 depletion (Fig 3D og 3E og S3B Fig). Tilsvarende irinotecan inducerede en G2 /M anholdelse i HCT116 p53-nul celler, der blev delvist undertrykt af Nek11 udtømning (Fig 3F og 3G og S3C Fig). Som for IR eksponering, observerede vi, at Nek11 depletering alene inducerede et beskedent niveau af celledød, men dette var forøget i kombination med irinotecan i HCT116 WT-celler (fig 3h til 3i). I modsætning hertil blev en lavere og mindre ensartet celledød observeret i HCT116 p53-nul-celler efter Nek11 udtømning enten med eller uden irinotecan (Fig 3J og 3K). Vi konkluderer derfor, at irinotecan inducerer også en Nek11-afhængig G2 /M arrest, der er delvist afhængig p53 status i HCT116-celler, og at irinotecan stigninger celledød, når det kombineres med Nek11 depletion på en måde, der er p53-afhængig. Derfor Nek11 sandsynligvis spille en lignende rolle i svaret fra HCT116 celler til IR og irinotecan.

A. Skematisk fremstilling af tidsforløbet for cellebehandlinger. 24 timer efter podning blev celler transficeret med siRNA oligonukleotider. 52 timer senere blev celler enten ubehandlet eller behandlet med 5 pM irinotecan. De blev derefter opsamlet og fikseret til PI-baserede flowcytometri efter yderligere 20 timer. B C. Ved at følge protokollen beskrevet i A, HCT116 WT og p53-nul-celler blev transficeret med siRNA’er som angivet og efterladt ubehandlet (B) eller behandlet med irinotecan (C), før analyse ved flowcytometri. Fordeling af celler ifølge flowcytometri profil vises (2n, G1; 2n-4n, S; 4n, G2 /M). D-G. Histogrammer repræsenterer procentdelen af ​​cykling HCT116 WT (D, E) og p53-nul (F, G) celler på G2 /M. H-K. Histogrammer viser procentdelen af ​​HCT116 WT (H, I) og p53-nul (J, K) celler med sub-2n DNA. Histogrammer i DK er baseret på data i B og C.

s

værdier er i forhold til siGL2.

Identifikation af fire Nek11 splejsningsvarianter der undergår nucleocytoplasmic shuttling

den første karakterisering af human Nek11 beskrevet to splejsningsvarianter, en lang version af 74 kDa, betegnet Nek11L, og en kort version af 54 kDa, betegnet Nek11S [9]. Gennem analyse af genekspression databaser, vi identificeret yderligere to formodede splejsningsvarianter som vi betegnes Nek11C og Nek11D, med forudsagte størrelser på 56 og 69 kDa. Alle fire varianter har en identisk N-terminal sekvens af 466 rester, som omfatter det katalytiske domæne og to forudsagte coiled-coils. Nek11S og Nek11C opsige snart efter, om end med forskellige sekvenser. Nek11L og Nek11D har mere udvidet C-termini, i første omgang at dele en ekstra identisk ~ 50 rester før slutter med alternative sekvenser (Fig 4A). For at bestemme, om disse varianter havde distinkte egenskaber, vi først genereres U2OS celler, der stabilt udtrykte GFP-mærkede versioner af hver Nek11 variant. Disse celler blev anvendt med henblik på subcellulære lokalisering undersøgelser, mens det er påvist, at Nek11 udtømning forstyrrer DDR i disse celler [7]. Vi genererede også en U2OS cellelinie udtrykker en “kinase-døde” (KD) version af Nek11L med mutation i to essentielle katalytiske rester (K61R /D158A) at afgøre, om lokalisering kunne være aktivitet-afhængig.

A. Skematisk fremstilling af de fire Nek11 proteinisoformer. De forskellige C-terminale ender er angivet og stiplede linjer angiver positionerne, hvor proteinerne divergerer. Positionerne af kinasedomæne, coiled-coils, tal restkoncentrationer og forudsagte molekylvægte er angivet. B. Lysater fra U2OS: GFP-Nek11 stabile cellelinier eller U2OS parentale celler blev analyseret ved SDS-PAGE og Western blotting med antistoffer mod Nek11, GFP og α-tubulin. C. U2OS celler blev transficeret med konstruktioner angivet, og efter 20 timer, behandledes ± MG132 i 4 timer. Lysater blev analyseret ved Western blot med antistoffer angivet. M.wts. (KDa) er angivet til venstre i B og kun C. D. GFP og GFP-Nek11 cellelinier som angivet blev behandlet ± LMB i 3 timer før fiksering og farvning med GFP-antistoffer. Målestokke 5 um.

Western blot-analyse viste, at GFP-Nek11D variant blev udtrykt ved meget reducerede niveauer sammenlignet med de andre varianter i stabile cellelinjer (Fig 4B). Inkubering med proteasominhibitor, MG132, førte til selektiv opregulering af denne isoform tyder på, at Nek11D variant er unik blandt disse fire varianter i besiddelse sekvenser, der er målrettet det til ubiquitinmedieret nedbrydning, formentlig i sin unikke C-terminalen (fig 4C). Immunfluorescensmikroskopi afslørede, at mens Nek11L og Nek11D isoformer var begrænset til cytoplasmaet, blev Nek11S og Nek11C påvist i både cytoplasmaet og kernen (figur 4D). Kinase-dead Nek11L var begrænset til cytoplasmaet som vildtype-proteinet. Som Nek11 blev rapporteret at lokalisere til nukleoler [19], vi vurderet, om varianter kunne shuttle mellem cytoplasmaet og kernen. Hæmning af nuklear eksport med Crm1 inhibitor, leptomycin B (LMB), forårsagede alle fire Nek11 varianter at akkumulere i kernen, men uden indlysende koncentration i nucleoli. Kinase-døde Nek11L undergik også nucleocytoplasmic shuttling indikerer, at dette ikke er afhængig af dens enzymatiske aktivitet.

Identifikation af sekvenser, der regulerer nucleocytoplasmic shuttling af Nek11

For at kortlægge områder af proteinet, der kræves for kerneimport og eksport, analyserede vi lokaliseringen af ​​en række Nek11 afstumpningsmutanter (fig 5A). Den N-terminale katalytiske domæne alene (resterne 1-287) lokaliseret til cytoplasmaet og ikke shuttle. I modsætning hertil C-terminale ikke-katalytiske domæne af Nek11L (resterne 288-645) blev cytoplasmatisk i fravær af LMB men koncentreret i kernen med LMB. Dette indikerer, at det indeholder motiver nødvendige for nucleocytoplasmic shuttling (Fig 5B og 5C). Som kanoniske nukleare lokalisering og eksport sekvenser var ikke til stede, genereret vi yderligere fem konstruktioner, der repræsenterer C-terminale trunkeringer af Nek11L (Fig 5A og 5D). En konstruktion, der omfatter det katalytiske domæne og begge coiled-coil-motiver (resterne 1-388) blev nukleare uanset LMB behandling, hvorimod en udvidet konstrukt omfattende resterne 1-541 opførte sig som fuld-længde protein er cytoplasmatisk i ubehandlede celler og nuklear med LMB ( fig 5E). En konstruktion, der repræsenterede området bevaret mellem alle fire Nek11 varianter, 1-466, udstillet en mere lige nuklear-cytoplasma fordeling minder om S og C-varianter at opsige snart efter dette punkt. Svarende til de varianter, dette konstrukt koncentreret i kernen efter LMB behandling. Derfor foreslår vi, at de coiled-coil regioner indeholder sekvenser, der er nødvendige for nuklear import, mens regionen mellem resterne 388 og 465 indeholder sekvenser, der er nødvendige for nuklear eksport.

A. Skematisk fremstilling af GFP-Nek11L konstruktioner, der anvendes til at undersøge subcellulære lokalisering. Fremherskende lokalisering til cytoplasmaet (C), nucleus (N) eller lige fordeling (C /N) ± LMB behandling er indiceret. B. Western blots med GFP og a-tubulin antistoffer af lysater fremstillet fra U2OS celler transient transficeret i 24 timer med de Nek11L konstruktioner angivet. Kinasedomæne omfatter resterne 1-287 og C-terminale domæne omfatter resterne 288-645. M. wts (kDa) er angivet til venstre. C. U2OS celler blev transficeret med konstruktioner angivet og, efter 24 timer, behandlet ± LMB i 3 timer før fiksering og farvning med GFP-antistoffer. D E. Western blots og immunfluorescensfarvning blev udført som i B og C med henholdsvis konstrukterne angivet. Scale barer, 5 um.

Nek11S spiller en central rolle i DNA-skade-induceret G2 /M anholdelse i HCT116 celler

For at afgøre, om alle fire Nek11 splejsningsvarianter udtrykkes i HCT116 celler, samt tre andre CRC cellelinier (HT29, SW480 og SW620), kvantitativ RT-PCR blev udført med isoform-specifikke primere (S4A og s4b fig). Disse identificerede mRNA for hver variant i alle fire cellelinjer, med Nek11L og Nek11C konsekvent at være den mest og mindst rigelige, henholdsvis (S4C Fig). Vi derefter sammenlignet deres overflod i disse CRC cellelinier i forhold til, at der i den immortaliserede humane colonocyte linje, HCEC. Dette indikerede bemærkelsesværdig variation med øgede Nek11S i HT29 og øget Nek11C i SW620 (S4D Fig). Ellers niveauerne af hver variant var enten ligner eller reduceret i forhold til HCEC celler.

For at teste det bidrag af disse splejsning varianter til DDR i HCT116 celler, to sæt siRNAs blev valideret, en, der co-udtømning både de længere isoformer, Nek11L og Nek11D, og ​​en, der selektivt udtømmer Nek11S (S4E fig). Disse blev derefter påført HCT116 WT og p53-nul-celler under anvendelse af de protokoller, der er beskrevet tidligere til analyse reaktioner på IR og irinotecan af PI-baseret flowcytometri (S5 Fig). I HCT116 WT celler, der var en beskeden reduktion i G2 /M population ved udtømning af Nek11L /D som respons på IR, men ikke som reaktion på irinotecan. I modsætning hertil var der en væsentlig reduktion i G2 /M befolkning som reaktion på begge behandlinger ved udtømning af Nek11S (Fig 6A-6C, S2E og S2F Fig). I HCT116 p53-nul celler, en lille, men signifikant reduktion i G2 /M befolkning blev set på Nek11L /D udtømning som reaktion på irinotecan men ikke IR, mens Nek11S udtømning ført til en betydelig reduktion i respons på begge behandlinger (fig 6D -6F). Som for udtømning af total Nek11, var det bemærkelsesværdigt, at den del af G2 /M-celler vendte tilbage til basale niveauer ved udtømning af Nek11S i WT, men ikke p53-nul-celler. Derfor selvom den relative depletion effektivitet kan variere, indikerer disse data, at Nek11S mindst spiller en vigtig rolle i mediering DNA-skader induceret G2 /M standsning i HCT116-celler, men bekræftede, at denne reaktion er delvist p53-afhængig.

AL. Ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet i figur 1A for bestråling og Fig 3A for irinotecan behandling, HCT116 WT (AC, GI) og HCT116 p53-null (DF, JL) celler blev transficeret med siRNA oligonukleotider til at co-nedbryder Nek11L og Nek11D (L /D ), eller nedbryder Nek11S eller luciferase (siGL2). Histogrammer viser procentdelen af ​​cykling celler ved G2 /M (A-F) og af totale celler med sub-2n DNA (G-l).

s

værdier er i forhold til siGL2 for hver behandling.

Undersøgelse af sub-2n befolkning via PI-baseret flowcytometri afslørede, at udtømning af Nek11S, men ikke Nek11L /D, resulterede i en signifikant stigning i celledød i HCT116 WT celler udsat for IR eller irinotecan (fig 6G-6I). Udtømning af Nek11S, men ikke Nek11L /D, også medført betydelige niveauer af celledød i p53-nul celler udsat for IR eller irinotecan (Fig 6J-6L). Sidstnævnte resultat var uventet i betragtning af de tidligere observationer, at celledød i Nek11-udtømte celler udsat for disse behandlinger er p53-afhængig. Men udtømning af Nek11S også ført til en betydelig stigning i celledød i fravær af genotoksisk behandling i p53-nul celler tyder på, at dette ikke var et specifikt svar på eksogent DNA skader.

Diskussion

Tidligere undersøgelser afslørede, at kinaseaktiviteten af ​​Nek11 stimuleres i HeLa celler udsat for DNA-beskadigende midler og replikations-inhibitorer [9]. Desuden Nek11 blev identificeret i en skærm til gener, der er nødvendige for G2 /M anholdelse i U2OS celler udsat for IR, med Nek11 fremme Cdc25A nedbrydning nedstrøms Chk1 [7]. Her viser vi, at tabet af Nek11 ophæver G2 /M standsning og reducerer celleoverlevelse i HCT116 CRC celler udsat for enten IR- eller det kemoterapeutiske middel, irinotecan. Desuden viser vi, at Nek11 gennemgår nucleocytoplasmic shuttling på en måde, der minder om andre DDR proteiner. Disse indsigter give yderligere bevis på, at Nek11 er en vigtig formidler af G2 /M-DNA skade responset samt at der kræves for overlevelse af CRC celler.

Normale celler udsat for DNA-skader anholdelse primært ved G1 /S overgang . Imidlertid er dette kontrolpunkt ofte mangler i cancerceller, der har mistet enten p53 eller Rb. Disse celler er derfor mere afhængige af G2 /M checkpoint når de udsættes for DNA-beskadigende midler. Vore undersøgelser viste, at mens eksponering af HCT116 celler til både IR- og irinotecan førte til en større stigning i G2 /M fraktionen, i overensstemmelse med aktivering af G2 /M checkpoint, blev denne fraktion væsentligt reduceret ved fjernelse af Nek11. I WT celler, Nek11 udtømning reducerede G2 /M fraktionen til baseline niveau til stede i en cykel befolkning støtter en potentiel rolle for Nek11 i G2 /M checkpoint i HCT116 celler. Men i p53-nul-celler, G2 /M fraktionen, selv om betydeligt reduceret, forblev over baseline. Dette antyder, at Nek11 ikke blot indeholder et p53-uafhængig G2 /M arrest efter DNA beskadigelse men derudover forhindrer en p53-afhængig tab af G2 /M-celler (Fig 7).

Denne skematiske model illustrerer foreslåede roller Nek11 i svaret fra CRC celler til midler, der forstyrrer DNA integritet enten gennem direkte DNA-skader eller gået i stå replikation. Tidligere undersøgelser har indikeret, at Nek11 ligger neden for ATM /ATR og Chk1 og virker til at forhindre mitotisk progression ved at fremme nedbrydning af Cdc25A. Vores resultater viser, at i CRC-celler, er Nek11 kræves ikke blot at sikre G2 /M arrest men også at beskytte mod p53-afhængig apoptose. Svigt i G2 /M checkpoint kan føre til celledød i en p53-uafhængig måde dels gennem mitotisk katastrofe.

I overensstemmelse hermed observerede vi en beskeden stigning i antallet af celler i sub -2N fraktion, der indikerer døende celler, i Nek11-depleterede WT celler udsat for IR eller irinotecan, der ikke var set med p53-nul-celler. Ligeledes specifik analyse af den apoptotiske fraktion ved annexin V-assay viste, at en lille brøkdel af Nek11-depleteret WT, men ikke p53-null, celler udsat for IR eller irinotecan indtastede apoptose. Derfor, i mangel af Nek11, nogle HCT116 celler udsat for eksogent DNA beskadigelse undergår en p53-afhængig apoptose, mens andre formentlig igen ind i cellecyklen i en p53-uafhængig måde.