PLoS ONE: Onkogene aktioner under nukleare receptor co-repressorkomplekset (NCOR1) i en musemodel af skjoldbruskkirtlen Cancer

Abstrakt

Undersøgelser har antydet, at den nukleare receptor co-repressorkomplekset 1 (NCOR1) kunne spille en vigtig rolle i humane kræftformer . de detaljerede molekylære mekanismer, som det fungerer dog

in vivo

at påvirke kræft progression er ikke klare. Den foreliggende undersøgelse belyst

in vivo

handlinger NCOR1 i carcinogenese ved hjælp af en musemodel (

Thrb

PV /PV

mus), spontant udvikler kræft i skjoldbruskkirtlen.

Thrb

PV /PV

mus huser en overvejende negativ thyroidhormonreceptor β (TR) mutant (betegnet som PV). Vi vedtog tab af funktion tilgang ved at krydse

Thrb

PV

mus med mus, der globalt udtrykker en NCOR1 mutant protein (NCOR1ΔID), hvor receptor interaktion domæner er blevet ændret, så det ikke kan interagere med TRp, eller PV, i mus. Bemærkelsesværdigt, ekspressionen af ​​NCOR1ΔID protein reducerede skjoldbruskkirtlen tumorvækst, markant forsinket tumor progression, og forlænget overlevelse af

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus. Tumorcelleproliferation blev inhiberet ved forøget ekspression af cyclin-afhængig kinase inhibitor 1 (p21

WAF1 /CIP1;

Cdkn1A

), og apoptose blev aktiveret ved forhøjet ekspression af pro-apoptotiske Bcl-associeret X (

Bax

). Yderligere analyser viste, at p53 blev rekrutteret til p53-bindingssted på den proksimale promotor af

Cdkn1A

og

Bax

gen som en co-repressor kompleks med PV /NCOR1 /histon deacetylas- 3 (HDAC-3), hvilket fører til undertrykkelse af

Cdkn1A

samt

Bax

gen i skjoldbruskkirtel af

Thrb

PV /PV

mus. I skjoldbruskkirtel af

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus, p53 /PV-komplekset ikke kunne rekruttere NCOR1ΔID og HDAC-3, hvilket fører til at de-undertrykkelse af begge gener til at inhibere cancer progression. De nuværende undersøgelser leveres direkte bevis

in vivo Hoteller, som NCOR1 kunne fungere som et onkogen via transskription regulering i en musemodel af kræft i skjoldbruskkirtlen

Henvisning:. Fozzatti L, Park JW, Zhao L, Willingham MC, Cheng Sy (2013) Onkogene aktioner under nukleare receptor co-repressorkomplekset (NCOR1) i en musemodel for kræft i skjoldbruskkirtlen. PLoS ONE 8 (6): e67954. doi: 10,1371 /journal.pone.0067954

Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: Marts 28, 2013; Accepteret: 23. maj 2013; Udgivet: 26 juni, 2013 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Den nuværende forskning blev støttet af Intramural Research Program på Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

thyroid hormon receptorer (TRS) er kritiske i formidlingen de genomiske handlinger skjoldbruskkirtelhormon (T3) for vækst, udvikling, differentiering, og opretholdelse af metaboliske homeostase. To TR gener, α og β, som ligger på to forskellige kromosomer, indkode tre store T3 bindende TR isoformer (α1, β1, og p2). Undersøgelser ved hjælp af gensplejsede mus viste, at

in vivo

, TR isoformer har fælles funktioner, men kan også udøve isoform-afhængige handlinger i målvæv [1], [2]. Transkriptionsaktiviteten af ​​TR er reguleret på flere niveauer. Ud over reguleringen af ​​T3 og typer af DNA-bindende elementer i initiativtagerne til målgener, transkriptionsaktiviteten af ​​TR er finjusteret af et væld af nukleare coaktivatorer og corepressorer [3], [4]. I fravær af T3, den ikke-ligerede TR rekrutterer den nukleare receptor co-repressorkomplekset 1 (NCOR1) og den nukleare receptor co-repressorkomplekset 2 /silencing mediator for retinoid og thyroideahormonreceptorer (NCOR2 /SMRT) til transkriptionel repression. Binding af T3 fører til en konformationel ændring i TR, der frigiver NCOR1 /NCOR2 kompleks og giver mulighed for at ansætte en multiproteinkompleks coaktivator kompleks for transkriptionel aktivering [5].

Den vigtige regulerende rolle NCOR1 i receptor handlinger er tydelig i sin afvigende interaktion med receptorer, der ligger til grund humane sygdomme, såsom resistens over for thyroid hormon (RTH) [6], [7] og lipodystrophic svær insulinresistens [8]. RTH er forårsaget af mutationer i

THRB

gen [9], [10]. Mutationer af peroxisomproliferatoraktiverede receptor γ (

PPARy)

medføre lipodystrophic svær insulinresistens [8]. Desuden afvigende interaktion NCOR1 /SMRT med de kondenserede genprodukterne af den retinoinsyrereceptor a-gen (

RARa)

eller med promyelocyt leukæmi-genet (

PML

) (PML-RAR- α) eller med den promyelocyt leukæmi zinkfinger-genet (

PLZF

) (PLZF-RAR-α) resulterer i blokering myeloid differentiering [11]. Inddragelsen af ​​NCOR1 i andre menneskelige kræftformer såsom bryst og blære kræft blev påvist ved en tæt sammenslutning af NCOR1 unormal udtryk med kræft udvikling [12], [13], [14], [15]. Nylige undersøgelser af Cancer Genome Atlas (TCGA) Research Network også afdækket homozygot gendeletion af NCOR1 hos nogle patienter med tyktarm og endetarm adenocarcinom [16], prostata adenocarcinom [17], ovariecancer [18] eller lever hepatocellulært carcinom (upubliceret-Foreløbig i TCGA database). Desuden nonsense mutationer og splejsning varianter af

NCOR1

blev også fundet i patienter med brystkræft [19]. Mens disse associationsstudier rejst muligheden for, at NCOR1 kunne handle for at påvirke udviklingen af ​​kræft, direkte bevis for sine roller i carcinogenese

in vivo

mangler stadig.

Tilgængeligheden af ​​en musemodel, der spontant udvikler metastatisk follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen (FTC) forsynet os med et kraftfuldt værktøj til at vurdere, hvilken rolle NCOR1 i kræft udvikling og progression.

Thrb

PV /PV

mus rummer en Knockin dominant negativ mutation, kendt som PV, i

Thrb

gen locus [20]. PV-mutationen blev identificeret i en patient, der lider resistens mod thyroid hormon [21]. Som

Thrb

PV /PV

mus alder, deres skjoldbruskkirtel undergå patologiske ændringer fra hyperplasi til kapsel og vaskulær invasion, anaplasia, og eventuel metastase til lungen [22]. Den patologiske progression, rute, og hyppigheden af ​​metastaser i

Thrb

PV /PV

mus er den samme som i human FTC. Omfattende molekylære analyser af ændrede signalveje viser, som findes i humant FTC,

Thrb

PV /PV

mus udviser afvigende signalveje, der omfatter konstitutiv aktivering af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt [ ,,,0],23], [24] og integrin-Src-MAPK signalering [25] og afvigende akkumulering af den onkogene hypofysetumor transformerende gen-protein (PTTG) [26], [27] og ß-catenin [28]. Således

Thrb

PV /PV

musemodel trofast rekapitulerer de molekylære afvigelser findes i human cancer i skjoldbruskkirtlen, og er faktisk en præklinisk musemodel af FTC.

I de foreliggende undersøgelser, vi vedtaget tab af funktion tilgang ved at krydse

Thrb

PV

med mus, der globalt udtrykker en NCOR1 mutant protein (NCOR1ΔID). I denne NCOR1ΔID mutantprotein, to mest aminoterminale receptor interaktion domæner betegnet RID 3 og RID2, mangler. Denne mutant kan ikke associere med TR, som RID3 er absolut nødvendig for NCOR1-TR interaktion [29], [30], [31]. Konsekvent, viste vi også, at NCOR1ΔID mutant protein ikke kan interagere med TRβPV

in vivo

[32]. Den manglende interaktion mellem TRβPV med NCOR1ΔID resulterer i lindring af symptomer på resistens over for thyroid hormon i

Thrb

PVNcor1

ΔID /ΔID

mus, vejledende, at NCOR1 regulerer den dominerende negative virkning af TR mutanter

in vivo

[32].

de nuværende undersøgelser viser, at ekspressionen af ​​NCOR1ΔID i skjoldbruskkirtlen af ​​

Thrb

PV /PV

mus hæmmede tumorvækst, langvarig overlevelse, og forsinket cancer progression. Tumorcelleproliferation blev inhiberet af den forøgede ekspression af cyclin-afhængig kinase inhibitor 1 (p21 /WAF1;

Cdkn1A

), og apoptose blev induceret ved den aktiverede ekspression af Bcl-2-associeret X protein (

BAX

). Både

Cdkn1A

og

BAX

gener er direkte nedstrøms target gener af tumor suppressor, p53. Detaljerede molekylære analyser viste, at manglen på receptor-interaktionen domæne i NCOR1ΔID førte til en manglende evne af p53 /PV kompleks at rekruttere det NCOR1 /histon deacetylase-3 repressor komplekset til promotorerne for disse målgener, hvilket resulterer i øget undertrykkelse af disse gener til inhibere cancer progression. Nærværende undersøgelse forudsat direkte bevis

in vivo

at vise, at NCOR1 kunne fungere som et onkogen via transskription regulering i skjoldbruskkirtlen carcinogenese i en musemodel.

Materialer og Metoder

mus Stammer

dyret undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med den protokol, der er godkendt af National Cancer Institute Animal Care og brug Udvalg. Mus huser

Thrb

PV

gen (

Thrb

PV

mus) blev fremstillet og genotypet som tidligere beskrevet [20].

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus blev avlet ved først at krydse

Thrb

+ /+ Ncor1

ΔID /+

mus [29] med

Thrb

PV /+

mus og derefter ved at krydse

Thrb

PV /+ Ncor1

ΔID /ΔID

mus med

Thrb

PV /+ Ncor1

ΔID /ΔID

mus [32]. Mus med forskellige genotyper, der anvendes i den foreliggende undersøgelse var intercrossed flere generationer, og søskende med tilsvarende genetisk baggrund blev anvendt i alle eksperimenter. Musene blev overvåget indtil de blev døende og derfor aflives. Skjoldbruskkirtel og andre væv blev indsamlet fra

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus og

Thrb

PVPVNcor1

ΔID /ΔID

mus til vejning, histologiske analyse, og molekylære og biokemiske studier.

RNA-isolering og Quantitative Real-Time RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra thyroids af mus under anvendelse af TRIzol (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Kvantitativ real-time RT-PCR blev udført med en Quantitect SYBR Green RT-PCR-kittet (QIAGEN, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner og anvendelse af en LightCycler thermocycler (Roche Diagnostics). Totalt RNA (200 ng) blev anvendt i RT-PCR-bestemmelser som tidligere [33] beskrevne. De specifikke primere var som følger:

MP21

fremad, 5′-CGCCGCGGTGTCAGAGTC-3 ‘og revers, 5′-GCAGCAGGGCAGAGGAAG-3’;

mBax

fremad, “-CCACCAGCTCTGAACAGATC-3 ‘og omvendt, 5′-CAGCTTCTTGGTGGACGCAT-3’;

mp53

fremad, 5′-AGAGACCGCCGTACAGAAGA-3 ‘og omvendt, 5′-CTGTAGCATGGGCATCCTTT-3’.

Western Blot Analyse og Co-immunopræcipitation

nukleare ekstrakter af skjoldbruskkirtel blev fremstillet som tidligere beskrevet [32]. Protein- prøver (25 ug) blev analyseret ved Western blot som tidligere [28] beskrevne. Anti-phosphoryleret retinoblastoma protein (pRb) (Ser780, # 9307) og PUMA (# 7467) var fra cellesignalering Technologies (Beverly, MA) (1:500 fortynding), anti-cyclin D1 (sc-450), BAX (sc -7480), Rb (sc-50), p21 (sc-6246) og p27 (sc-1641) antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) og anvendt ved en 1:200 fortynding. Anti-p53 antistoffer (OP03) var fra Calbiochem (1:500 fortynding). Band intensiteter blev kvantificeret ved hjælp af NIH IMAGE software (ImageJ 1,34 s, Wayne Rasband, NIH).

For co-immunpræcipitering at vise den fysiske interaktion af p53 med PV, 0,5 mg af den samlede skjoldbruskkirtlen ekstrakter blev først inkuberet natten over med kanin-anti-TR (kode 600-401-A96, Rockland) i Tris-bufret saltvand-0,6% NP-40 med proteaseinhibitorer (Roche) ved 4 ° C. Prøverne blev derefter blandet med 20 pi protein A-agarose (Roche) ved 4 ° C i 2 timer, og perlerne blev vasket fem gange med TBS-0,6% NP-40, der indeholder proteaseinhibitorer. Bundne proteiner blev analyseret ved Western blot-analyse under anvendelse af antistoffer til p53 (OP03, Millipore, Inc.,) ved en 1:500 fortynding og anti-NCOR1 (PHQQ; 2 pg /ml). [32]

Histologisk analyse

skjoldbruskkirtlen, lunge og hjerte blev dissekeret, fikseret i 10% neutral bufret formalin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), og efterfølgende indlejret i paraffin. Sektioner af 5-um tykkelse blev fremstillet og farvet med hematoxylin og eosin (H SK-4100), og efter farvning udvikling, de blev modfarvet i Gills hematoxylin, skyllet og monteret i Permount (Fisher Scientific , Pittsburgh, PA). Den proliferative indeks blev beregnet som procentdelen af ​​Ki-67-positive kerner til det samlede antal af kerner på afsnittet skjoldbruskkirtlen. Counting blev udført ved hjælp af National Institutes of Health (NIH) IMAGE software (ImageJ 1,34 s, Wayne Rasband, NIH, Bethesda, MD).

chromatin Immunfældning (chip) Indhold

Chippen assay var udføres ved hjælp af kromatin DNA fremstillet af skjoldbruskkirtlen tumorer (50 mg /analyse) af

Thrb1

PV /PVNcor1

+ /+

mus og

Thrb1

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus, som beskrevet tidligere [34]. Den immunpræcipiteret-DNA i 50 ul TE og kvantitativ PCR blev udført med 7900HT Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystems) under anvendelse QuantiFast SYBR Green RT-PCR-kittet (204.154, QIAGEN). Berigelsen i signaler blev beregnet som immunpræcipitation signaler versus helcellelysat indgange. Ændringerne i skjoldbruskkirtlen tumorer i

Thrb1

PV /PVNcor1

+ /+

eller

Thrb1

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

chip blev normaliseret ved fold negativ kontrol (muse IgG). Chippen anvendte primere var

Cdkn1A

fremad, 5’TTTCTATCAGCCCCAGAGGA-3 ‘; og omvendt, 5’TCACCCCACAGCTGGTAGTT-3 ‘og

Bax

fremad, 5’GGGGCGCGCGGATCCATTCC-3′; og omvendt, 5’GCTTCTGATGGACAGGGGGC-3 ‘.

Statistisk analyse

Alle data er udtrykt som middelværdi ± SEM. Forskelle mellem grupper blev undersøgt for statistisk signifikans ved hjælp af Students

t

test med brug af GraphPad Prism 4.0A (GraphPad Software); p 0,05 anses statistisk signifikant

Resultater

NCOR1ΔID Forlænger Survival og Forsinkelser Thyroid Carcinogenese af

Thrb

PV /PV

Mus

Vi. har tidligere vist, at

Thrb

PV /PV

mus har høj dødelighed forårsaget af FTC [22]. Vi overvågede virkningerne af ekspressionen af ​​NCOR1ΔID på skjoldbruskkirtlen carcinogenese ved først at sammenligne overlevelsen af ​​

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus med den,

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus. Musene blev overvåget indtil de blev døende med tegn på tydelige tumorer, hurtigt vægttab, optrukne stillinger, og besværet vejrtrækning. Figur 1A viser, at

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus overlevede signifikant længere (p 0,01; 50% overlevelse alder: 11,3 måneder, n = 29) end gjorde

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus (50% overlevelse alder: 9,3 måneder, n = 58) i 15-måneders observationsperiode. Figur 1B viser, at ekspressionen af ​​NCOR1ΔID førte til en betydelig reduktion på 35% i skjoldbruskkirtlen vægt i

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus (datasæt 2 vs. 1; p 0,0001 ).

(A) Kaplan-Meier-overlevelseskurver for

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus op 15 måneders alderen.

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

(n = 29) overlevede betydeligt længere end

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus (n = 58) (

s

0,0001). (B) skjoldbruskkirtel af

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus i alderen 5 -15 måneder blev dissekeret og vejet. Dataene er præsenteret som forholdet mellem skjoldbruskkirtlen og kropsvægt. Forskellene mellem vægten af ​​skjoldbruskkirtlen

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus var signifikante (

s

0,0001), som bestemt af Students

t

-test analyse

effekten af ​​NCOR1ΔID på den patologiske progression blev vurderet ved histopatologisk analyse som.

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus alderen. Figur 2A viser repræsentative patologiske funktioner i skjoldbruskkirtel og lunger fra 3- til 15-måneder gamle

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus (venstre og højre kolonner, henholdsvis). I skjoldbruskkirtel af

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus i en alder af 7 måneder, avanceret vaskulær invasion og fokal anaplasia blev ofte observeret (pile i figur 2AA og 2AC henholdsvis) . Desuden lungemetastaser (Figur 2AE, pile) var hyppige i

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus. I

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus, dog blev vaskulær invasion sjældent observeret (figur 2AB), men uden påviselig anaplasia (figur 2AD) og en markant reduktion i forekomsten af lunge metastase (fig 2AF). Disse Pathohistologisk observationer er opsummeret i figur 2B. På den yngre alder af 3-5 måneder, blev der observeret en lavere forekomst af kapselskrumpning invasion (-20%) for

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus end for

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus (figur 2Ba), men en lignende hændelse hyppighed af kapselskrumpning invasion blev påvist både mutant mus ved ældre alder ( 7 måneder). Ingen vaskulær invasion, anaplasia eller lungemetastaser blev fundet i

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus (figur 2BB, c og d) ved yngre alderen 3-5 måneder. For mus ældre end 7 måneder, forekomsten hyppigheden af ​​vaskulær invasion, anaplasia og lunge metastase var 80%, 15% og 60%, henholdsvis for

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus (figur 2BB, c og d). Men forekomsten af ​​vaskulær invasion og lunge metastase var 14% og 10%, henholdsvis for

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus, uden forekomst af anaplasia. Taget sammen indikerer disse resultater, at ekspressionen af ​​NCOR1ΔID forsinket thyreoideacancer progression og blokeret tab af differentiering (anaplasia) i

Thrb

PV /PV

mus.

(A) hematoxylin og eosin (H 2). Desuden er den reducerede cyklin D1 førte til en lavere protein overflod af phosphoryleret retinoblastoma protein (pRb) (Figur 3B.I, panel B, sammenligne banerne 1 2 med bane 3 og 4.) uden at den samlede Rb protein niveauer (panel c). Reduktionen i den phosphorylerede Rb hæmmet progression af cellecyklussen fra G1 til S-fasen. Konsekvent, protein overflod af cyklin-afhængige kinase inhibitor p21 og p27 (figur 3B.I, paneler d og e, henholdsvis) var også lavere i skjoldbruskkirtel af

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus end i

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus (sammenlign banerne 3-4 til banerne 1-2). De kvantitative data for de båndintensiteter er vist i figur 3B.II. Tilsammen indikerer disse resultater, at ekspressionen af ​​NCOR1ΔID førte til inhibering af tumorcelleproliferation, delvis ved at forsinke G1-S cellecyklusprogression.

Om apoptose bidrog også til nedsat skjoldbruskkirtel tumorvækst er vist i figur 1B blev også vurderet ved at undersøge de centrale regulatorer af apoptose. Proteinet overflod af Bcl-2-associeret X protein (BAX), som fremmer apoptose, var højere i skjoldbruskkirtel af

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus end i

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus (figur 4AA, sammenligne banerne 3 4 med 1 2). PUMA, som er en BH3 (Bcl-2 homologi domæne 3) -Kun protein, der inducerer apoptose gennem mitokondrier vej, var også højere i skjoldbruskkirtel af

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus end i

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus (figur 4AB, sammenligne banerne 3 4 med 1 2). De kvantitative båndintensiteter er vist i figur 4BA, hvilket indikerer en 2 gange stigning i BAX og PUMA proteinniveauet. Endvidere øgede spaltet caspase 3 (figur 4A, panel B, bane 3 og 4.) og reduceret total poly ADP-ribose polymerase (PARP), men steg spaltet PARP (panel c, øvre bånd og det nedre bånd i henholdsvis banerne 3 4) i

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus sammenlignet med

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus betegnende for den forhøjede apoptotiske aktivitet i skjoldbruskkirtlen tumorceller af

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus (se også kvantitative data i figur 4BB). Disse resultater viser, at ud over at forsinke G1-S cellecyklusprogression, den forøgede apoptotiske aktivitet i skjoldbruskkirtel af

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID Salg mus også bidraget til lavere skjoldbruskkirtlen vækst.

(A) Nuclear proteinekstrakter blev fremstillet ud fra skjoldbruskkirtlen tumorer i

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

(bane 1 og 2) eller

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID Salg (bane 3 og 4) mus. Vist er Western blot-analyser af BAX (panel a), PUMA (panel b), spaltet caspase 3 (panel c), PARP og spaltes PARP (panel d), og actin ladningskontrol (panel e). (B) Kvantificering af intensiteterne band vist i (A). * P 0,05 Protein overflod af BAX og PUMA (panel a), kløvet caspase 3 og kløvet PARP (panel b) var signifikant højere og total PARP (panel b) var lavere i skjoldbruskkirtel af

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus.

Hæmning af tumorvækst ved aktivering af p53-signalvejen i skjoldbruskkirtel af

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

Mus

resultaterne at protein mængderne af p21 og BAX blev ændret som vist ovenfor fik os til at undersøge, om deres udtryk på mRNA niveau også blev påvirket. Faktisk fandt vi, at

Cdkn1A

(

p21

WAF1

) mRNA-niveauer var signifikant højere i skjoldbruskkirtlen af ​​

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus end i

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus (figur 5A, bar 2 vs. bar 1). Tilsvarende

Bax

mRNA niveau var højere i skjoldbruskkirtlen af ​​

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus end i

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus (figur 5B, bar 4 vs. bar 3). Disse to gener er direkte reguleret af p53 [35], [36]. Vi hypotese derfor, at ændre aktiviteten af ​​p53 i skjoldbruskkirtel af

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus ville føre til aktivering af transskription af

Cdkn1A

Bax

gener. Vi undersøgte først, om ekspression af p53 mRNA og protein blev ændret, og derved ændre aktivitet i skjoldbruskkirtlen af ​​

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus. Vi fandt, at ekspressionen af ​​NCOR1ΔID havde nogen virkninger af ekspressionen af ​​p53 på mRNA-niveauet (søjler 5 og 6, figur 5A). Desuden fandt vi, at proteinet overflod af p53 var ligeledes lav i skjoldbruskkirtlen af ​​

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus (figur 5B, øvre panel, bane 3 og 4, henholdsvis). Desto større

Cdkn1A

Bax

mRNA-niveauer var ikke skyldes aktivering af p53 transkription aktivitet ved den forhøjede p53-protein-ekspression. Fordi det tidligere er blevet vist, at vildtype-TR’er fysisk interagerer med p53 og negativt regulerer den transskriptionelle aktivitet af p53 [37], [38], vi næste undersøgt muligheden for, at aktiviteten af ​​p53 kunne ændres via interaktion med PV i thyroids af mutante mus. Co-immunoprecipitation analyse viste, at PV var forbundet med p53 i skjoldbruskkirtlen hos

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus (figur 5B, øvre panel, bane 1). PV blev også tilsvarende forbundet med p53 i skjoldbruskkirtlen af ​​

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus (figur 5B, øvre panel, bane 2). Vigtigere, co-immunpræcipitering viste desuden, at PV også var forbundet med NCOR1 i skjoldbruskkirtlen nukleare ekstrakter af

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus (figur 5B, nederste panel, bane 1) , men ikke interagere med NCOR1ΔID i skjoldbruskkirtlen nukleare ekstrakter af

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus (bane 2). Bane 3 og 4 viser, at en tilsvarende mængde NCOR1 og NCOR1ΔID henholdsvis blev påvist ved direkte Western blot-analyse (figur 5B, nedre panel). Disse data indikerer, at PV interageret med p53 og NCOR1 i et ternært kompleks (p53 /PV /NCOR1) i skjoldbruskkirtlen hos

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus, men kun en dannet p53 /PV kompleks i skjoldbruskkirtlen af ​​

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus.

(A) Aktiveret udtryk for

Cdkn1A

Bax

gener i skjoldbruskkirtlen af ​​

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus. Kvantitativ real-time RT-PCR blev udført som beskrevet i Fremgangsmåder og materialer. Hver skjoldbruskkirtlen prøve blev kørt tredobbelt med samlede mus antal 3-5. Forskellene i udtrykket er betydelige i udtryk for de

Cdkn1A

(bane 1 og 2) og

Bax

gener (bane 3 og 4) mellem

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus (bane 5 og 6). (B) Co-immunfældning af PV med p53 og NCOR1 i skjoldbruskkirtlen af ​​

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

mus (bane 1), men ikke med NCOR1ΔID i skjoldbruskkirtlen ekstrakter af

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus (bane 2). Bane 3 og 4 viser p53-båndet (øverste panel) og NCOR1 og NCOR1ΔID fra direkte Western blot-analyse fra skjoldbruskkirtlen nukleare ekstrakter af

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mus hhv. (C og D) Rekruttering af PV og NCOR1 til p53 /DNA bindende sites på promotoren af ​​

Cdkn1A

gen (C) og

Bax

gen (D). Chip assay blev udført under anvendelse af IgG (søjler 1 og 6) eller anti-p53 (barer 2 og 7) eller anti-PV (barer 3 og 8) eller anti-NCOR1 (barer 4 og 9) eller anti-HDAC-3 ( stænger 5 og 10) antistoffer som beskrevet i

Metoder og Materialer

. Binding blev udtrykt som fold af ændringer i henvisning til den negative kontrol, hvor muse IgG blev anvendt i immunopræcipitation * p. 0,05, og *** p 0,001.