PLoS ONE: høj ekspression af Heat Shock Protein 90 er forbundet med Tumor Aggressivitet og dårlig prognose hos patienter med fremskreden Gastrisk Cancer

Abstrakt

varmechokprotein 90 (HSP90) er overudtrykt og meget forbundet med dårlig prognose i mange ondartetheder. Men den rolle HSP90 i mavekræft er ikke blevet grundigt belyst. Formålet med denne undersøgelse er at undersøge forholdet mellem HSP90 udtryk med klinisk-patologiske parametre og prognose i fremskreden mavekræft, og anslå ændring af HSP90 udtryk efter neoadjuverende kemoterapi. HSP90 og matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) antigenekspression blev vurderet ved immunohistokemi i 322 avancerede gastriske carcinoma prøver. Forholdet mellem HSP90 og klinisk-patologiske parametre og prognose blev analyseret. Svaret fra HSP90 niveau blev vurderet i kemoterapeutisk virkning i 54 patienter modtog 1-2 cyklusser af neoadjuverende kemoterapi. Den positive ekspression af HSP90 blev fundet at være 69,6% i 322 avancerede gastriske carcinoma prøver. HSP90 proteinekspression var signifikant associeret med dybde invasion (

P

0,001), lymfeknude metastaser (

P

0,001) og stadium af sygdommen (

P

0,001) og lymfeknude metastaser gruppe (

P

0,001). Desuden HSP90 var signifikant korreleret med MMP-9 blandt 322 mavekræft væv (

P

0,001). I univariate og multivariate analyser, HSP90 var en uafhængig prognostisk faktor for både tilbagefald overlevelse (RFS) og samlet overlevelse (OS). Disse resultater antydede, at HSP90 kan spille en vigtig rolle på tumorinvasion, metastase og prognose, og kan virke som et lovende mål for prognostisk forudsigelse

Henvisning:. Wang J, Cui S, Zhang X, Wu Y, Tang H (2013) høj ekspression af Heat Shock Protein 90 er forbundet med Tumor Aggressivitet og dårlig prognose hos patienter med fremskreden mavekræft. PLoS ONE 8 (4): e62876. doi: 10,1371 /journal.pone.0062876

Redaktør: Yuan-Jia Chen, Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Kina

Modtaget: September 26 2012; Accepteret: 26 marts 2013; Udgivet: 26 april, 2013 |

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde havde ingen specifikke finansieringskilde. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den fjerde mest almindeligt diagnosticeret kræft, og den næststørste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1] – [2]. Fuldstændig resektion af tumoren og tilstødende lymfeknuder er den eneste effektive helbredende behandling [3]. efter en komplet resektion, 5-års overlevelse er dog fortsat lav, rapporteret at være kun 23% [4]. Desuden selv tilsætning af hidtil ukendte, molekylært målrettede behandlinger til standard kemoterapi kun en begrænset overlevelse fordel [5]. Derfor identifikation af nye prognostiske og prædiktive markører er vigtig, for at lette udvælgelsen af ​​patienter, der er mest tilbøjelige til at drage fordel af multimodale behandlingsmetoder.

Heat shock proteiner (HSP’er) er et sæt af evolutionært konserverede proteiner . Pattedyr HSP’er har hovedsageligt været klassificeret i fire familier efter deres molekylvægt: HSP90, HSP70, HSP60 og små HSP’er (15-30 kDa), der omfatter HSP27. Det er kendt, at HSP’er udtrykkes som reaktion på en række spændinger, herunder hypertermi, oxygenafledte frie radikaler, aminosyreanaloger, ethanol og tungmetaller [6]. For nylig er det blevet vist, at HSP’er signifikant var forbundet med cancere [7].

varmechokprotein (HSP) 90 er et vigtigt molekylært chaperone for proteinfoldning, intracellulær disposition og proteolytisk omsætning af centrale regulatorer af celle vækst og overlevelse [8]. Mange undersøgelser har vist, at HSP90 er overekspression i faste tumorer, og har signifikant sammenhæng med prognose [9] – [11]. Det har også rapporteret, at HSP90 udtryk er høj i gastrisk caner cellelinjer [12], men er der ikke foretaget store undersøgelser på udtryk i humane tumorer og foreningen med klinisk-patologiske variabler. Derfor er formålet med vores undersøgelse er at vise forholdet mellem HSP90 udtryk med klinisk-patologiske parametre og prognose i fremskreden mavekræft, og undersøge reaktion HSP90 udtryk til neoadjuverende kemoterapi.

Materialer og metoder

Patienter og kliniske data

undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board og menneskelige etiske komité af Affiliated Oncologic Hospital i Guangzhou Medical College. Skriftligt samtykke til at bruge prøverne til forskningsformål blev opnået fra alle patienter forud for operation.

Vi analyserede væv fra 322 patienter (197 mænd og 125 kvinder) med fremskreden gastrisk karcinom, der blev behandlet på Tilknyttede Oncologic Hospital i Guangzhou Medical College (Guangzhou, Kina) mellem 2005 og 2011. aldersfordelingen var fra 22 til 84 år, og den gennemsnitlige alder var 56,11 ± 11,42 år. Ifølge den anaplastisk klasse, 15 tumorer var godt differentieret, 102 var moderat differentieret, og 205 var dårligt differentieret. Alle de avancerede gastric kræftpatienter indskrevet i undersøgelsen havde en histologisk bekræftet diagnose, at svulsten har invaderet gastrisk muskuløs eller serøse lag, som var patologisk bekræftet efter operationen. Relevante kliniske patologiske træk (tabel 1) blev alle fremstillet af patienternes filer. Tumor etape blev klassificeret i henhold til det 7. Union International Cancer Kontrol (UICC) TNM [13]. Sagerne blev udvalgt efter hinanden på grundlag af tilgængeligheden af ​​resektion væv og opfølgende data. Et hundrede og halvtreds-syv i 322 patienter, som blev fulgt i mindst 36 måneder havde komplette opfølgende data, som blev brugt til vurdering af prognosen. Endvidere 54 tilfælde i 322 patienter gennemgik neoadjuverende kemoterapi, mens de andre ikke modtog radio- eller kemoterapi før gastrektomi. Disse 54 patienter alle underkastet en diagnostisk biopsi før neoadjuverende kemoterapi, og matchede tumor prøver blev opnået under kirurgisk resektion. Alle prøver fra 54 patienter havde nok resterende tumorvæv at evaluere. I alt 322 avancerede gastrisk karcinom prøver blev anvendt i immunhistokemisk (IHC) analyse.

Præoperativ kemoterapi

Den første diagnose af 54 patienter blev gjort efter januar 2010. Patienter med stadium III-IV (M0) mavekræft blev tilmeldt neoadjuverende kemoterapi. Forbehandling tumor iscenesættelse blev udført i overensstemmelse med en ensartet protokol, inkluderet endoskopi med endosonography, en CT-scanning af brystet og maven, og diagnostisk laparoskopi.

Alle 54 patienter blev behandlet med FOLFOX regime (leucovorin, 5-fluorouracil og oxaliplatin) [14] og gennemgik gastrektomi med D2 lymphadenectomy efter kemoterapi. Neoadjuverende kemoterapi bestod af intravenøs infusion af oxaliplatin (85 mg /m

2, 2 h) og leucovorin (200 mg /m

2, 2 h), efterfulgt af 5-fluoruracil 2600 mg /m

2 som en 24 timers kontinuerlig infusion. Cyklusser blev gentaget ved 2-ugers intervaller til en eller to cykler. Kirurgisk tumorresektion var planlagt 2 uger efter afslutningen af ​​kemoterapi. Der var 16 patienter, som fik en cyklus af FOLFOX regime, mens andre modtog to cyklusser af neoadjuverende kemoterapi.

IHC Farvning

Vi anvendte en tidligere beskrevet IHC procedure [15]. Kort fortalt blev formalinfikserede, paraffinindlejrede vævsprøver fra samtykkende patienter skåret i 4-um snit og anbragt på polylysin-coated objektglas, deparaffinerede i xylen og rehydreret i en serie af graduerede alkoholer. De væv Objektglassene blev derefter behandlet med 3% hydrogenperoxid i methanol i 10 min for at standse endogen peroxidaseaktivitet, og antigenerne blev hentet i 0,01 M natriumcitratbuffer (pH 6,0) ved anvendelse af en mikrobølgeovn. Efter 30 minutters præinkubation i 10% normalt gedeserum til at forhindre ikke-specifik farvning blev prøverne inkuberet natten over under anvendelse et primært antistof, enten anti-HSP90 (Abcam, # ab13495, UK, fortynding 1:200) eller anti-MMP-9 ( Abcam, # ab38898, UK, fortynding 1:200), i en fugtig beholder ved 4 ° C. Vævet Objektglassene blev behandlet med en ikke-biotin peberrodsperoxidasekonjugeret påvisningssystem i overensstemmelse med fabrikantens instruktioner (Gene Tech). IHC Resultaterne blev evalueret af to uafhængige forskere blindet til patientens identitet og klinisk status. I afvigende tilfælde, en patolog revideret sagerne, og en blev opnået enighed

HSP90 og MMP-9 farvningsintensiteter blev bedømt på en skala fra 0-3 efter procentdelen af ​​positive tumor (0, 5% positive celler; 1, 5-20%, 2, 20-50%, eller 3, 50%). Udtrykket er meget lav i 0, lav i 1, moderat for 2 og høj for 3 (fig. 1). HSP90 og MMP-9-ekspression blev klassificeret som negative for scoringer ≤1 og positiv for scoringer ≥2.

Målestokken repræsenterer 100 um.

Opfølgning

Patienterne havde opfølgende udnævnelser hver 3. måned i de første 3 år efter operationen, hver 6 måneder for de næste 2 år, og årligt derefter. Den mediane opfølgningsperiode var 27 måneder (interval, 4-82 måneder) i 322 patienter, mens der var 33 måneder i 157 patienter, hvis prognose blev analyseret. Gentagelse blev bekræftet af tumormarkører niveauer, herunder CEA, AFP, CA199, CA125 og CA724, B-typen ultralyd inspektion hver 3 møl, og computertomografi (CT) eller magnetisk resonans imaging (MRI) hver 6. måned efter gastrektomi. De væsentligste dødsårsager var mavekræft tilbagefald. Samlet overlevelse (OS) blev beregnet fra tidspunktet for kirurgi til datoen for død eller sidste opfølgning. Gentagelse overlevelse (RFS) blev defineret som fra tidspunktet for operationen frem til datoen for tilbagefald eller fra den periode resektion til datoen for den sidste observation taget.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS-software (version 16.0, Chicago, IL, USA). Sammenhængen mellem HSP90 udtryk og kliniske data blev beregnet ved anvendelse af chi-square test, og vises på tværs af tabeller. Gruppe forskelle blev undersøgt ved hjælp af Students

t

-test. Overlevelseskurver blev afbildet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og analyseret under anvendelse af log-rank test. Væsentlige prognostiske faktorer fundet af univariat analyse blev indgået en multivariat analyse ved hjælp af Cox proportional hazard model. Multiple sammenligninger blev korrigeret ved hjælp af Bonferroni-metoden. To-tailed

P

værdier blev beregnet. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant, når

P

. 0,05

Resultater

Sammenslutningen af ​​HSP90 med klinisk-patologisk variabler

Der var 322 tilfælde af fremskreden gastrisk cancer, som blev undersøgt ved immunhistokemi. HSP90 farvning hovedsageligt placeret i cytoplasma af tumorceller. Overekspression af HSP90 blev observeret i 224 322 (69,6%) af gastrisk cancer prøver.

Ifølge resultaterne af immunhistokemi, vi korreleret HSP90 status i 322 gastrisk cancer prøver med otte andre bredt anerkendte clinicopathologic parametre (tabel 1 ). Vores analyser viser, at HSP90 positivt udtryk niveauer signifikant højere i mavecancerpatienter med øget tumorstørrelse (

P

= 0,001), tumor (

P

0,001), dybde invasion (

P

0,001), tilstedeværelse af lymfeknude metastaser (

P

0,001) og stadium af sygdommen (

P

0,001) (tabel 1). blev ikke observeret nogen signifikant sammenhæng mellem køn, alder og kvalitet af differentiering med HSP90 udtryk.

Virkningen af ​​HSP90 Overekspression på Invasion og metastase i Gastric Cancer

Især korrelationen af ​​fremtrædende serøse invasion og lymfeknudemetastase med HSP90 positivitet foreslog en potentiel rolle HSP90 i øget invasion og metastase af mavekræft. Derfor undersøgte vi forholdet mellem HSP90 og MMP-9-protein ekspression i gastrisk cancer.

De positive satser af HSP90-ekspression var 89,9% og 92,3% i den mere fremtrædende serosale invasion gruppe (T3 /T4) og mere hyppig lymfeknude involvering gruppe (N1-3), mens der kun var 44,4% og 19,0% i T2 og n0 (

P

0,001 og

P

0,001 henholdsvis) ( tabel 1). Niveauet af HSP90 i T3 viste ingen forskel med dem i T4, og i mellemtiden, ekspressionen af ​​HSP90 havde nogen signifikante forskelle mellem N1, N2 og N3 (datas ikke vist). Derudover blev HSP90-protein-ekspression signifikant associeret med MMP-9-ekspression i 322 gastriske carcinoma væv. Af 98 patienter med lav HSP90 udtryk, 86 patienter (87,8%) havde lavt MMP-9 udtryk, mens 134 af 224 patienter (59,8%) med høj HSP90 udtryk også havde høj MMP-9-ekspression (

P

0,001 og

P

. 0,001 henholdsvis) (figur 3). Den postoperative median RFS og OS var 27,0 måneder og 33,0 måneder. Den postoperative median RFS og OS af patienter med positiv farvning af HSP90 var 15,0 måneder og 20,0 måneder, mens de af patienter med negativ farvning af HSP90 var 60,5 måneder og 64,0 måneder. De 3-årige og 5-årige kumulative overlevelsesrater for patienter med HSP90 negative udtryk var 83,1% og 75,7% sammenlignet med 39,4% og 30,1% af patienterne med HSP90 positivt udtryk, henholdsvis (Tabel 2).

RFS (A) og OS (B) kurver blev genereret baseret på HSP90 protein udtryk statusser i 157 gastrisk carcinoma prøver.

for at undersøge virkningen af ​​HSP90 overekspression på RFS og OS, udførte vi univariate analyse af traditionelle clinicopathologic variabler for prognose. Resultaterne af univariat analyse viste, at signifikante variabler i RFS og OS analyse omfattede HSP90 overekspression (

P

0,001 og

P

0,001 henholdsvis), større tumor størrelse (

P

= 0,002 og

P

= 0,002, henholdsvis), fremtrædende serøse invasion (

P

0,001 og

P

0,001 henholdsvis) og lymfeknude metastaser (

P

0,001 og

P

0,001 henholdsvis) var positive prognostiske faktorer for RFS og OS i mavecancerpatienter (tabel 2). Men køn, alder, tumor eller differentiering status havde nogen prognose værdi på RFS og OS for patienter med mavekræft.

Desuden at evaluere den uafhængige effekt af HSP90 overekspression på RFS og OS, en multivariat Cox proportional farer model blev justeret for tumorstørrelse, dybde af invasion, lymfeknudemetastase og HSP90-ekspression. Vores resultater viste, at HSP90 udtryk var en uafhængig prognostisk faktor for både RFS (HR = 2,158, 95% CI: 1,165-3,999;

P

= 0,015) og OS (HR = 1,888, 95% CI: 1.022- 3,486;

P

= 0,042) hos patienter med mavekræft. Tumor størrelse, dybde invasion og lymfeknude metastaser alle havde selvstændig prognostisk værdi i den multivariate analyse (tabel 3).

Respons af HSP90 i Neoadjuverende Kemoterapi

Forskellen i overlevelse observeret hos patienter med mavekræft fik os til at sætte spørgsmålstegn ved, om HSP90 udtryk var relateret til administration af kemoterapi. Vi har detekteret HSP90 udtryk i diagnostiske biopsi materiale og matchede kirurgiske prøver fra 54 patienter med mavekræft.

HSP90 blev udtrykt i 66,7% (36/54) af biopsier og 57,4% (31/54) af resektion prøver. Neoadjuverende kemoterapi ændrede ikke HSP90 udtrykket mellem biopsi og tumor prøver (

P

= 0,321) (fig. 4). I 24 (44,4%) tilfælde, HSP90 udtryk var identisk i biopsi og de matchede prøver. 13 (24,1%) tilfælde viste opregulering af HSP90 udtryk og 17 (31,5%) tilfælde viste nedregulering af HSP90 udtryk i de kirurgiske prøver sammenlignet med den biopsi materiale.

(A) Udtrykket af HSP90 ændrede ikke mellem de biopsi og tumor prøver (

P

= 0,321). (B) HSP90 farvning i diagnostisk biopsi materiale sammenlignet med matchede tumor kerner. Skalaen søjle repræsenterer 100 um.

Diskussion

Heat shock proteiner (HSP’er) er fundet at være steget i mange solide tumorer og blodkræftsygdomme. Deres ekspression kan spille en vigtig rolle i opretholdelsen af ​​protein homøostase af maligne celler selv i fjendtlige hypoxiske og acidotisk mikromiljø af tumoren. I mellemtiden HSP’er tillader tumorceller at tolerere genetiske ændringer, som ellers ville være dødelige [16]. Det er blevet rapporteret, at overekspression af HSP’er er forbundet med dårlig prognose, såsom HSP27 i rektal cancer [17], HSP70 i pancreas adenocarcinom [18] og HSP90 i gastrointestinale stromale tumorer [19]. Ikke desto mindre rolle HSP90 i mavekræft er ikke blevet grundigt belyst.

I den foreliggende undersøgelse, vi beskrev den prognostiske værdi af HSP90 proteinekspression i fremskreden mavekræft, og bestemmes forholdet mellem HSP90 udtryk med invasion, metastase, og kemoterapeutisk respons mavecancerpatienter. Immunhistokemi blev anvendt til at analysere sammenhængen af ​​HSP90-protein-ekspression med klinisk patologiske faktorer og prognostisk effekt af 322 mavecancerpatienter. Resultatet viste, at HSP90 proteinniveauer var signifikant associeret med tumorstørrelse, tumorstedet, dybde invasion, lymfeknudemetastase og kliniske faser. Desuden viste Kaplan-Meier analyse, der i almindelighed, HSP90-positive patienter havde dårligere prognose end gjorde HSP90-negative patienter med både RFS og OS. Desuden multivariat Cox model analyse viste, at HSP90 udtryk status blev identificeret som en selvstændig risikofaktor for både RFS og OS. Vore data antydede, at HSP90 kan spille en vigtig rolle i tumor prognose og at HSP90 kunne være en potentiel prognostisk faktor af gastrisk cancer.

Det er kendt, at nedbrydningen af ​​ekstracellulær matrix (ECM) var et signal for begyndelsen af invasion og metastase, og MMP’er er vigtige molekyler involveret i ECM nedbrydning under invasion og metastase [20]. Chu et al. [21] rapporterede, at cancer MMP-9 blev signifikant korreleret med dybden af ​​invasion og lymfeknudemetastase og at MMP-9-positive mavekræft patienter havde dårligere resultater end dem med MMP-9-negative tumorer. Endvidere er det blevet rapporteret, at HSP90 og MMP-9 kan udgøre som et kompleks i anaplastisk store celle lymfomer, og MMP-9 kan aktiveres af HSP90 at fremme celleinvasion. [22] Vores resultater viste, at ekspressionen af ​​HSP90 og MMP-9 blev korreleret med hinanden, hvilket indebærer højere invasive og metastaserende aktivitet i HSP90 høj ekspression cancerceller. HSP90 kan være et centralt molekyle for progression i mavekræft. Desuden blev HSP90 stærkt udtrykt i dybden af ​​invasion, især i T3 og T4 carcinomer. Så vidt lymfeknude status angik, patienter med lymfeknudemetastaser tendens til at vise forhøjede HSP90-ekspression, mens der ikke var nogen statistisk forskel mellem N1, N2 og N3. Kollektivt, HSP90-ekspression i mavekræft fremmer tumor aggressivitet antyder, at HSP90 kan være et muligt mål ved cancerterapi.

Desuden undersøgte vi responset af HSP90 i neoadjuvant kemoterapi, og fandt, at neoadjuverende kemoterapi ikke ændrede HSP90-ekspression mellem biopsi og tumorprøver af mavekræft. Det foreslog os at HSP90 niveauerne forbliver stort set uændret i kemoterapeutiske effekt, hvilket gav os mulighed for at gøre en vigtig observation, at ekspressionen af ​​HSP90 niveauer i tumorerne var stabil, uanset om det har modtaget neoadjuverende kemoterapi eller ej. Det er blevet rapporteret, at HSP90 bibringer resistens over for kemoterapi ved cancer [23] – [24]. Desuden kunne inhibition af HSP90-ekspression reducere angiogenese og gastrisk cancer celleproliferation, og overvinde modstanden mod kemoterapi [12]; [25]. Tilsammen målretning HSP90 med kemiske inhibitorer kan overvejes ved behandling af gastrisk cancer, især når HSP90 blev højt udtrykt i gastrisk cancer.

Sammenfattende demonstrerer vi overekspression af HSP90 kan spille en vigtig rolle i tumorinvasion , metastaser og prognose, og kan arbejde som en lovende mål for prognostisk forudsigelse i mavekræft.

Tak

Vi takker de kliniske data fra patologi afdelingen.