Abstrakt
Laver producere forskellige unikke kemikalier, som kan anvendes til farmaceutiske formål. For at screene for nye lichen sekundære metabolitter udviser hæmmende aktivitet over lungekræft celle motilitet, vi testede acetone ekstrakter af 13 mosser prøver indsamlet i Chile. Physciosporin, isoleret fra
Pseudocyphellaria coriacea Hotel (Hook f . Taylor) D.J. Galloway P. James, blev identificeret som en effektiv forbindelse, og viste signifikant hæmmende aktivitet i migration og invasion assays mod humane lunge kræftceller. Physciosporin behandling reducerede både protein og mRNA-niveauer af N-cadherin med ledsagende fald i niveauerne af epitel-mesenkymale overgang markører såsom snegl og twist. Physciosporin undertrykt også KITENIN (KAI1 C-terminal interagerende tetraspanin) -medieret AP-1-aktivitet i både fravær og nærvær af epidermal vækstfaktor stimulation. Kvantitativ realtids-PCR-analyse viste, at ekspressionen af metastase-genet, KAI1, blev forøget, mens den for metastase enhancer-genet, KITENIN blev dramatisk reduceret med physciosporin. Især blev aktiviteten af 3′-utranslateret region i KITENIN faldt med physciosporin. Desuden blev cdc42 og Rac1 aktiviteter faldt med physciosporin. Disse resultater viste, at lichen sekundære metabolit, physciosporin, hæmmer lungekræft celle motilitet gennem nye virkningsmekanismer
Henvisning:. Yang Y, Park SY, Nguyen TT, Yu YH, Nguyen TV, Sun EG, et al . (2015) Lichen sekundær metabolit, Physciosporin inhiberer Lung Cancer cellemotilitet. PLoS ONE 10 (9): e0137889. doi: 10,1371 /journal.pone.0137889
Redaktør: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institut, KINA
Modtaget: Juni 14, 2015; Accepteret: August 24, 2015; Udgivet: 15 September, 2015
Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Grundforskningsfonden Korea (NRF-2013R1A1A2004677, MRC-2011 til 0.030.132) og af Korea National Research Resource center Program ( NRF-2014M3A9B8002115). Denne undersøgelse har også modtaget støtte fra en forskningsbevilling finansieret af Sunchon Research Center for Natural Medicine. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Forkortelser : DMSO, dimethylsulfoxid; EGF, epidermal vækstfaktor; HPLC, højtydende væskekromatografi; KITENIN, KAI1 C-terminale interagerende tetraspanin; NMR, kernemagnetisk resonans; PBD, p21 bindende domæne; TLC tyndtlagskromatografi
Introduktion
Lungekræft er den mest almindelige kræftform og den førende årsag til kræft dødsfald hos mennesker over hele verden [1, 2]. Der var omkring 1,8 millioner nye tilfælde af lungekræft diagnosticeret i 2012, tegner sig for 12,9% af de samlede kræfttilfælde [1, 2]. På grund af manglen på en effektiv behandling for fremskreden sygdom, prognosen for lungekræft er stadig fattige, med mindre end 15% overlevende 5 år efter diagnosen [3]. Når lungekræft er diagnosticeret ved præsentation med symptomer, det bærer en meget dårlig prognose, med en samlet 5-års overlevelse på 16% i USA og mindre end 10% i Det Forenede Kongerige [4]. I lungekræft, metastase er den førende årsag til død og optrævling mekanismen for tumorprogression og metastase er således af stor betydning [5]. I de indledende trin af lokal invasion, de signalveje, der kontrollerer cytoskeletale dynamik tumorceller, blev omsætningen i celle-matrix og celle-celle kryds aktiveret [6]. Derfor udvikling af nye kemiske midler, der hæmmer kræft cellemigration og invasion ved at målrette det ovennævnte signal er påkrævet i behandling af fremskredne cancere.
Laver producere forskellige sekundære metabolitter, der viser en række biologiske aktiviteter, herunder anti-cancer-aktivitet [7]. Til dato har næsten tusind sekundære metabolitter af lav blevet opdaget, og nogle af disse unikke lichen metabolitter er effektive mod forskellige
in vitro
kræftmodeller [8]. Men selvom laverne er en kilde til screening for anti-cancer aktive forbindelser, har kun et lille antal forbindelser er testet, [9]. Derfor er den aktuelle undersøgelse undersøgte den inhibitoriske aktivitet af 13 chilenske lichen arter mod migration og invasion evne af humane lunge kræftceller og yderligere undersøgt de mulige molekylære mekanismer bag deres anti-metastatisk aktivitet for at identificere potentielle nye anti-metastase agenter.
Materialer og metoder
Udarbejdelse af lichen ekstrakter
thalli af laverne blev indsamlet fra Chile i januar 2009 og 2012 under ekskursioner i nationalparken Torres Del Paine, Patagonia, organiseret af Dr. Pereira på Talca Universitet, Talca, Chile. Tilladelsen til at indsamle lichen prøver fra placering blev udstedt af administrationen af National Forestry Corporation (CONAF) i Punta Arenas og administrationen af nationalparken Torres del Paine, Magallanes region og chilenske Antarktis, som er en del af det nationale system af beskyttede Vilde områder i staten Chile. De feltstudier ikke indebar nogen truede eller beskyttede arter. De dubletter blev deponeret på den koreanske Lichen og Allied Bioresource Center (KOLABIC) i den koreanske Lichen Research Institute (KoLRI), Sunchon National University, Korea.
tyndtlagskromatografi (TLC) analyse af lichen materiale
lichen thalli blev gennemvædet i 1 ml acetone i 5 min i 1,5 ml EP rør, og den koncentrerede opløsning blev spottet på silicagel 60 F254 præcoatede plader (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland) ved anvendelse af en MicroCap flere gange. Opløsningsmiddel A [Toluen: Dioxin: Eddikesyre 180: 45: 5 (v /v /v)], der er beskrevet i Culberson forbedrede standardiseret metode [10], blev anvendt i denne undersøgelse. TLC-pladen spottet med prøver blev lagt i en dobbelt trug kammer pre-mættet med opløsningsmiddel system A og blev fjernet fra kammeret, når væskefronten nåede 14cm fra start baseline. Resultaterne blev visualiseret ved undersøgelse og mærkning i dagslys (for pigmenter), og under UV ved 254 og 350 nm. Herefter blev pladerne sprøjtet med 10% vandig svovlsyre og opvarmet ved 110 ° C for at sikre fuldstændig visualisering. Efter forkulning, de specifikke farver af stoffer, både i dagslys og under UV (350 nm), blev noteret.
To lichen arter
Lethariella cladonioides (carbonyl
.
) Krog
(Atranorin) og
Usnea longissimi
(usnic syre) blev anvendt som standard kontrol. Baseret på den standardiserede metode [10, 11], i forhold R
f værdi blev fastsat til at identificere hver plet [12].
Separation og identifikation af physciosporin
Pseudocyphellaria coriacea
(CL090002) ekstrakt blev separeret ved TLC som beskrevet ovenfor. Stedet identificeret som physciosporin blev ridset fra og elueret med acetone. Supernatanten blev tørret og vejet efter centrifugering. Højtydende væskekromatografi (HPLC) assay blev udført for at bekræfte enkelt top inden den rensede prøve, og derefter, struktur physciosporin blev bekræftet ved kernemagnetisk resonans (NMR) analyse (fig A og B i S1 File).
Cell kultur
De humane lunge cancerceller, herunder A549, H1650 og H1975 blev anvendt i denne undersøgelse. Celler blev dyrket i RPMI 1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin-opløsning under en befugtet 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C i en inkubator.
sårheling assay
A549-celler blev udpladet ved en densitet på 2,5 ~ 3 × 10
5 celler /brønd på 6-brønds vævskulturplader (Corning, New York, USA) og dyrket natten over til konfluens. Monolag celler blev ridset med en steril pipettespids for at skabe et sår. Cellerne blev derefter vasket to gange med serumfrit RPMI 1640 til fjernelse af flydende celler og inkuberet i RPMI1640 dyrkningsmedium suppleret med 2% FBS med 5 ug /ml acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
eller physciosporin. Fotografier af celler blev udtaget ved 0, 24, 48 og 72 timer efter sårdannelse at måle bredden af såret. For hver prøve blev et gennemsnit på fem sår analyser taget for at bestemme den gennemsnitlige migration. Forsøg blev gentaget mindst tre gange.
Invasion assay
Invasion assays blev udført i Boyden kamre (Corning, New York, USA). De polycarbonatfiltre (8 um porestørrelse, Corning) præ-belagt med 1% gelatine blev brugt til invasion assays. Celler (2 x 10
6) i 120 pi medium (RPMI 1640 indeholdende 0,2% BSA opløst i PBS) med eller uden 5 pg /ml rå lichen ekstrakter eller physciosporin blev podet i det øvre kammer. Derefter 400 uL medium med 10 ug /ml fibronectin blev tilsat til det nederste kammer for at tjene som et kemotaktisk middel. Efter 24 timers inkubation blev cellerne i det øvre kammer fikseret med Diff Quik kit (Sysmex). Hvorefter cellerne fastgjort i det øvre kammer blev mekanisk fjernet ved vatpind. Cellerne klæber til under-side af filteret blev farvet og talt under opretstående mikroskop (5 felter /kammer). Hver invasion assay blev gentaget i tre uafhængige forsøg.
Western blotting
Celler behandlet med 5 mg /ml acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
eller physciosporin i 24 timer blev vasket to gange med iskold PBS og lyseret i lysebuffer [13]. De anvendte antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (N-cadherin, α-tubulin) og BD Biosciences (E-cadherin). Antistoffer blev påvist med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Thermo) under anvendelse Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Kit (Millipore) og luminescens billeddannelse (Image Quant LAS 4000 mini). Bånd blev målt ved Multi-Gauge 3.0 og deres relative massefylde beregnet på baggrund af tætheden af a-tubulin bånd i hver prøve. Værdier blev udtrykt som arbitrære densitometriske enheder svarende til signalintensitet.
Kvantitativ RT-PCR
kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) blev udført som tidligere beskrevet [14]. Kort beskrevet blev totalt RNA isoleret fra humane lungecancer-celler ved hjælp RNAiso Plus (Takara, Otsu, Shiga Shiga 520-2193, Japan) ifølge producentens instruktioner. Totalt RNA fra hver gruppe af behandlede celler blev omdannet til cDNA under anvendelse af en M-MLV revers transkriptase-kit (Invitrogen, Carlsbad, USA) og SYBR green (Enzynomics, Seoul, Korea). De anvendte primere til real-time PCR var Snail (frem) 5′-tcccgggcaatttaacaatg-3 ‘og (tilbage) 5′-tgggagacacatcggtcga-3′; Twist (frem) 5’-cgggagtccgcagtctta-3 ‘og (tilbage) 5′-tgaatcttgctcagcttgtc-3′; N-cadherin (frem) 5’-ctcctatgagtggaacaggaacg-3 ‘og (tilbage) 5′-ttggatcaatgtcataatcaagtgctgta-3′; KAI1 (frem) 5’-gctcatgggcttgggct-3 ‘og (tilbage) 5′-gagctcagtcacgatgccgc-3′; KITENIN (frem) 5’-cggaataaagacggcagagg-3 ‘og (tilbage) 5′-tgctccgaggtgcctgtgat-3′; GAPDH (frem) 5’-atcaccatcttccaggagcga-3 ‘og (tilbage) 5′-agttgtcatggatgaccttggc-3’. QRT-PCR-reaktioner og analyser blev udført ved anvendelse CFX (Bio-Rad, Hercules, USA).
Reporter Assay
I AP-1 reporter assay blev HEK293T celler transficeret med KITENIN ekspressionsplasmid og AP1 reporterplasmid. Efter 12 timer transfektion blev celler behandlet med 5 ug /ml acetone ekstrakter af
P
.
coriacea
eller physciosporin i 48 timer med eller uden EGF og derefter analyseret ved anvendelse af en dobbelt-Luciferase® reporter assaysystem (Promega, Madison, WI, USA). The Renilla luciferase reporter plasmid (pRL-TK) blev anvendt som en intern kontrol for transfektionseffektivitet. Aktiviteten for TOPFLASH reporter, NF-KB og STAT reporter blev også testet i vores studie.
I KITENIN promoter reporter assay, human KITENIN promotor (-2344 til + 536) blev amplificeret ved PCR fra genomisk DNA fra HEK293T celler under anvendelse af primere designet fra den genomiske sekvens af KITENIN locus (1p13.1). PCR-produkterne blev fordøjet med
Kpnl
I /
Bgl
II og klonet ind i pGL3basic plasmidet (Promega, Madison, WI, USA) opstrøms for luciferasereportergenet. Byggeri blev bekræftet ved sekventering. Den KITENIN 3′-untranlated region (3′-UTR) assay blev udført som tidligere beskrevet [15]. Forsøgene blev udført tredobbelt, og mindst tre resultater fra uafhængige eksperimenter blev inkluderet i en analyse. Fold ændringer blev beregnet ved hjælp af værdier normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet.
Affinity-udfældning af cellulære GTPaser
De cellulære Rac1 og cdc42 aktiviteter blev bestemt ved anvendelse af GST-RBD /PBD som tidligere beskrevet [16] . Kort fortalt blev cellerne lyseret i lysisbuffer. Lysaterne blev inkuberet med GST RBD /PBD perler ved stuetemperatur i 1 time. Perlerne blev derefter vasket fire gange med vaskebuffer. De bundne Rac1 og Cdc42 proteiner blev påvist ved immunoblotting under anvendelse af et monoklonalt antistof mod Rac1 (Millipore 05-389) og Cdc42 (Santa Cruz SC-87). Den relative aktivitet af hver GTPase blev bestemt ved kvantificering hvert bånd af GTP-bundne GTPase og den totale mængde af GTPase metoden Multi-Gauge 3,0 og værdierne af GTP-bundne bånd blev normaliseret til den for det samlede beløb. Alle resultater blev bestemt ved hjælp af tre forskellige eksponeringer fra mindst tre uafhængige forsøg.
Resultater
Acetone ekstrakter af lav indsamlet i Chile hæmme A549 celle motilitet
Invasion og migration spiller en afgørende rolle i metastase af cancerceller. For at finde en inhiberende stof fra lichen sekundære metabolitter, sårheling assays blev udført i A549 humane lungecancer-celler som en indledende screening for acetone ekstrakter af 13 chilenske laver (tabel 1) [17-20]. Som vist i figur 1A,
Rhizoplaca melanophthalma
,
Hypotrachyna sinuosa
,
Pseudocyphellaria coriacea
,
Pseudocyphellaria glabra
og
Nephroma sp
. inhiberede migration af A549-celler ved en koncentration på 5 ug /ml. Denne koncentration blev anvendt som ingen cytotoksicitet blev observeret ved denne koncentration (data ikke vist). Afstandene mellem kanterne af sårene for celler behandlet med de fem lichen ekstrakter bredere end for DMSO-behandlede celler (fig 1B).
(A) Kvantitativ analyse af migration assays af A549-celler behandlet med 5 ug /ml acetone ekstrakter af
Pseudocyphellaria glabra
,
Pseudocyphellaria coriacea
,
Nephroma
sp.,
Physcia
sp.,
Flavoparmelia caperata
,
Hypotrachyna sinuosa
,
Rhizoplaca melanophthalma
,
Rhizoplaca melanophthalma
,
Pseudocyphellaria argyracea
,
Pseudocyphellaria verrucosa
,
Xanthoparmelia
sp.,
Protousnea sp
. og
Xanthoparmelia
sp .. (B) Repræsentative billeder af migration analyser af A549 celler behandlet med ekstrakter af
R
.
melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
P
.
coriacea
,
P
.
glabra
og
Nephroma
sp. (C-D) Invasion assays af A549-celler behandlet med 5 ug /ml acetone ekstrakter af
R
.
melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
P
.
coriacea
,
P
.
glabra og Nephroma sp
. (C) og kvantitativ analyse af invaderede celletal i hver behandling (D). Kvantitative data blev indhentet fra tre uafhængige forsøg, n = 3. Data repræsenterer gennemsnit ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi). *** P. 0,001 sammenlignet med DMSO-behandlede A549 celler
For yderligere at kontrollere, om de ovennævnte lichen ekstrakter havde inhibitorisk aktivitet mod invasion af A549 celler, blev invasion analyser udført ved hjælp af gelatine-belagt to- godt kamre. Som vist i fig 1C, celler behandlet med acetone ekstrakter af de fem laver viste færre antal invaderede celler sammenlignet med DMSO-behandlet kontrol. Kvantitativ analyse af dataene afslørede, at forskellene var signifikant (Fig 1D). Disse resultater indikerer, at acetone ekstrakter af
R
.
melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
P
.
coriacea
,
P
.
glabra
og
Nephroma sp
. udviser hæmmende aktivitet mod A549 celle motilitet.
Physciosporin blev identificeret som en aktiv lichen sekundær metabolit fra
P
.
coriacea
i hæmning af lungekræft celle motilitet
For at undersøge den vigtigste forbindelse af disse fem ansøgerlande lav, blev fem lichen acetone ekstrakter individuelt analyseret ved TLC (Fig 2A). Baseret på den relative R
f værdier [12],
R
.
melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
og Nephroma sp
. deler den samme større komponent, usnic syre (øje på en, Fig 2A), mens
P
.
glabra
og
P
.
coriacea
har distinkte vigtigste forbindelser (spot c, Fig 2A). Som usnic syre er den mest omfattende undersøgt lichen metabolit for anti-cancer aktivitet, valgte vi ‘spot c’ til yderligere undersøgelse. “Spot c ‘blev tydeligt observeret inden
P
.
glabra
og
P
.
coriacea
blandt andet
Pseudocyphellaria
slægten, der besidder tenuiorin (spot d) og andre ukendte metabolitter som den vigtigste forbindelse (venstre panel, Fig 2B). Som ‘spot c’ i
P
.
glabra
og
P
.
coriacea
delte en identisk TLC
f værdi med physciosporin i
P
.
granulata
og var bleg eller mørk grå i dagslys og blev sort og tættere under UV (venstre og højre panel, Fig 2B), identificerede vi ‘spot c’ som physciosporin [21-23].
P
.
faveolata
og
P
.
valdiviana
også besidder physciosporin som deres vigtigste forbindelse (højre panel, Fig 2B). Den physciosporin anvendt i denne undersøgelse, blev isoleret fra
P
.
coriacea
som mængder af andre physciosporin indeholder laver var begrænset. Renhed og struktur physciosporin blev bekræftet ved HPLC og NMR-analyse (figur 2C, S1 File)
(AB) tyndtlagschromatografi (TLC) -analyse under anvendelse af (toluen:. Dioxin: eddikesyre = 180: 45: 5 , vol /vol /vol) opløsningsmiddelsystem for lichen ekstrakter med inhiberende aktivitet i A549 cellemotilitet (A), laverne i
Pseudocyphellaria
slægten (B). »A« angiver placeringen af sted for usnic syre; “B”, for atranorin; ‘C’, for physciosporin; ‘D’, for tenuiorin. Lichen arter
L
.
cladonioides
og
U
.
longissimi
blev brugt som standard kontrol for atranorin og usnic syre henholdsvis. (C) Kemisk struktur physciosporin. (D-E) Migration assay af A549-celler behandlet med 5 ug /ml acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
eller 5 mg /ml physciosporin (D), og kvantitativ analyse af sår længde (E). (F-G) Invasion assays af A549-celler behandlet med 5 ug /ml acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
eller physciosporin (F), og kvantitativ analyse af invaderede celletal i hver behandling (G). Kvantitative data blev indhentet fra tre uafhængige forsøg, n = 3. Data repræsenterer gennemsnit ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi). *** P. 0,001 sammenlignet med DMSO-behandlede A549 celler
For at kontrollere, om physciosporin er det aktive stof hæmmer A549 celle motilitet blev physciosporin testet sårheling assays og invasion assays. Sammenlignet med acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
viste physciosporin lignende hæmmende aktivitet over migration og invasion af A549-celler (Fig 2D-2G). Især physciosporin inhiberede A549 celleinvasion på en dosis-afhængig måde (Fig 2F og 2G). Interessant inhiberingen af den oprensede forbindelse var højere end for råekstrakter i invasionen assay men lidt lavere i migration assay (fig 2E og 2G). Hæmmende aktivitet acetone ekstrakt af
P
.
coriaea
physciosporin på lungekræft celle motilitet blev også observeret i H1650, H1975 celler (Fig 3). Cellelevedygtighed blev ikke ændret ved den givne koncentration af physciosporin (data ikke vist). Frem for alt disse resultater viste, at physciosporin er en aktiv lichen sekundær metabolit fra
P
.
coriacea
i hæmning af lungekræft celle motilitet.
(AB) Invasion analyser af H1650 og H1975 lungekræft celler behandlet med 5 mg /ml acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
eller 5 mg /ml physciosporin (A), og kvantitativ analyse af invaderede celle nummer i hver behandling (B). Kvantitative data blev indhentet fra tre uafhængige forsøg, n = 3. Data repræsenterer gennemsnit ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi). *** P. 0,001 sammenlignet med DMSO-behandlede A549 celler
Acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin faldt niveauet af epitelial-mesenkymale overgang markør
For at undersøge virkningsmekanismen for den inhibitoriske aktivitet af physciosporin mod lungekræft celle motilitet, virkningerne af acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin blev undersøgt i flere signalveje. Først blev ændringer i niveauerne af epitel-mesenkymale (EMT) markør målt i behandlede celler (Fig 4). I vores undersøgelse fald i ekspressionen af N-cadherin var fremtrædende i A549-celler behandlet med acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
eller physciosporin på både protein og mRNA-niveauer (Fig 4B og 4C), mens de af E-cadherin forblev marginal (Fig 4A og data ikke vist for E-cadherin mRNA). Desuden blev de udtryk for Sneglen og Twist dosisafhængigt faldet med acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
eller physciosporin behandling (Fig 4C). Tilsammen disse resultater tyder på, at acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
og physciosporin have inhiberende aktivitet over lungekræft cellemotilitet dels gennem inhibition af EMT.
(AB) Western blot-analyse af E-cadherin (A) og N-cadherin (B) i A549-celler behandlet med 5 ug /ml acetone ekstrakter af
P
.
coriacea
eller physciosporin. (C) Kvantitativ analyse af mRNA-niveauer af N-cadherin, Sneglen og Twist i A549 celler behandlet med 5 ug /ml acetone ekstrakter af
P
.
coriacea
eller physciosporin. Kvantitative data blev opnået fra mindst to uafhængige forsøg. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi). * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001 sammenlignet med DMSO-behandlede A549 celler
Acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin undertrykte KITENIN-medieret AP-1-aktivitet og påvirkede udtryk for KAI1 og KITENIN
Næste, ændringer i transkriptionelle aktiviteter af β-catenin /LEF-1 (TOPFLASH), AP -1 (AP-1-luc), NF-KB (NF-KB-luc) og STAT (STAT-luc) blev målt i behandlede celler. I en indledende test blev kun AP-1-aktivitet faldt med acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
eller physciosporin behandling i en dosisafhængig måde i fravær af co-aktivator (data ikke vist). I vores tidligere undersøgelse viste vi, at KITENIN (KAI1 C-terminal interagerende tetraspanin) fremmer tumorigene potentiale af cancere, og epidermal vækstfaktor (EGF) stimulerer KITENIN-medieret AP-1-aktivering [24]. For yderligere at teste effekten af acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
eller physciosporin på KITENIN-medieret AP-1-aktivitet, AP-1 reporter assays blev udført i celler co-transficeret med KITENIN. Som vist i fig 5A, KITENIN-medieret AP-1-aktivitet blev reduceret med acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
eller physciosporin behandling på en dosis-afhængig måde, både med og uden EGF-stimulering. For at undersøge, hvordan acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin undertrykte KITENIN-medieret AP1 aktivitet vi testede KITENIN niveauer i behandlede celler. KITENIN mRNA-niveauer blev reduceret ved behandling (Fig 5B). Den metastatiske suppressorgen, KAI1, ofte nedreguleres i metastatiske tumorceller [25, 26]. Som KITENIN har et omvendt forhold med KAI1 eller andre metastase-gener [27], testede vi mRNA-niveauet af KAI1 i behandlede celler og fandt en lignende omvendt forhold mellem KITENIN og KAI1 (Fig 5C). Tilsammen disse resultater tyder på, at acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin hæmme A549 celle motilitet dels gennem undertrykkelse af KITENIN-medieret AP-1-aktivitet ved at regulere KITENIN og KAI1 udtryk. At kontrollere, hvordan mRNA niveau af KITENIN kan ændres ved behandlingen blev luciferase assays for KITENIN promotor og 3′-UTR udført. Som et resultat blev aktiviteten af KITENIN 3′-UTR dramatisk formindsket ved behandlingen (fig 5E), mens den for KITENIN promotoren forblev konstant (Fig 5D).
(A) AP-1 luciferase assay of HEK293T celler transficeret med KITENIN og behandlet med 5 ug /ml acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
eller physciosporin i fravær eller tilstedeværelse af epidermal vækstfaktor stimulation. (B-C) Kvantitativ analyse af mRNA-niveauet af KITENIN (B) og KAI1 (C) i A549-celler behandlet med 5 ug /ml acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
eller physciosporin. (D-E) KITENIN promotor (D) og 3′-UTR (E) luciferaseassays af HEK293T celler behandlet med 5 mg /ml acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
eller physciosporin. Kvantitative data blev opnået fra mindst tre uafhængige forsøg. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi). * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001 sammenlignet med DMSO-behandlede celler
Acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin reduceret RhoGTPase aktivitet
Næste, ændringer i aktiviteterne i RhoGTPases blev målt i behandlede celler (figur 6). For at undersøge effekten af acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin om aktiviteterne i Cdc42 og Rac1 blev GST pull-down-analyser udført ved hjælp af GST-PBD (p21-bindende domæne). Resultaterne viste, at aktiviteterne i Cdc42 og Rac1 blev nedsat med henholdsvis 20% og 33%, henholdsvis i tilstedeværelse af physciosporin (Fig 6A og 6B). RhoA aktivitet blev også reduceret med acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin (data ikke vist). Tilsammen disse resultater tyder på, at acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin hæmme A549 celle motilitet dels gennem reduktion af RhoGTPase aktivitet. Resultaterne viser, at lav sekundære metabolit, physciosporin, hæmmer kræft celle motilitet med specifikke virkningsmekanismer.
(AB) Niveauerne af GTP-bundne Cdc42 (A) og Rac1 (B) blev målt i A549 celler behandlet med 5 mg /ml acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
eller physciosporin. GTP-Cdc42 og -Rac1 blev målt under anvendelse GST-PBD. De samlede mængder af Cdc42 og Rac1 viste sig at måle relativ aktivitet. Kvantitative data blev opnået fra tre uafhængige forsøg, n = 3. Data repræsenterer middelværdien ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi). *** P. 0,001 sammenlignet med DMSO-behandlede A549 celler
Diskussion
En masse unikke kemikalier er blevet isoleret fra lichen anvendes til farmaceutisk formål. I denne undersøgelse har en effektiv kemisk forbindelse physciosporin blevet isoleret fra Chile lichen
Pseudocyphellaria coriacea
for deres hæmmende aktivitet over lungekræft celle motilitet. Physciosporin, en chloreret depsidone, blev først isoleret i 1977 fra lav
Pseudocyphellaria physciospora
og identificeret som methyl-2-chlor-4-formyl-3,8-dihydroxy-l, 6,9-trimethyl-11- oxo-11
H
dibenzo [b, e] [l, 4] dioxepin-7-carboxylat (methyl 5-chlorovirensate) [22], men deres biologiske aktivitet er ikke blevet rapporteret til dato. I denne undersøgelse fandt vi følgende: 1) acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
og dens delkomponent, physciosporin, hæmmer motilitet lungekræft celler; 2) ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin undertrykke EMT; 3) ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin sænke KITENIN-medieret AP-1-aktivitet og påvirke ekspressionen af KAI1 og KITENIN; og 4) ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin reducere RhoGTPase aktivitet.
EMT, en væsentlig fænotypisk konvertering under fosterudviklingen, væv remodellering og sårheling, spiller en uundværlig rolle i tumor invasion og metastase [28-30]. Stigninger i N-cadherinekspression og fald i E-cadherin niveau (kaldet “cadherin kobling”) er afgørende i EMT og opstår i løbet af kræft progression [31]. Især er niveauet af N-cadherin synes at repræsentere mesenkymale fænotype af cellerne og en gruppe af transkriptionsfaktorer, herunder snail, Slug, ZEB og Twist har en afgørende rolle i kontrollen af EMT [32]. Snail, en zink-finger transskription faktor først identificeret i Drosophila, er et centralt EMT regulator [33]. Twist har også en vigtig rolle i cancer metastaser. For eksempel, hæmning af Twist udtryk af korte-forstyrrende RNA påvirker metastatisk vigør [34], og regulering af Twist-1 kan bidrage til resistens over for paclitaxel og antimikrotubulus narkotika i kræftpatienter [35]. Vores Resultatet viste, at niveauerne af N-cadherin, sneglen, og Twist blev nedsat med acetone ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin behandling, mens de af E-cadherin forblev marginal (figur 4). Det skal bemærkes, at i nogle tilfælde, ændringer i E-cadherin niveau er ikke afgørende for EMT [36] eller metastatisk aktivitet af tumor [37].
KITENIN er en metastase-forøgende gen. For nylig har vi identificeret, at KITENIN /ErbB4-Dvl2-c-Jun-aksen er en utraditionel EGFR-uafhængig nedstrøms signal af EGF og medierer invasiv og tumorigenese af kræftceller [24]. I vores resultater blev KITENIN-medieret AP-1-aktivitet faldt med ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin. Især blev ekspressionen af KITENIN faldet med behandlingen, og for dette, blev 3′-UTR aktivitet KITENIN dramatisk formindsket (figur 5). Få KITENIN målretning microRNA undertrykke migration og invasion af cellerne via modulerende KITENIN udtryk blev rapporteret og miR-27a, miR-30b, og miR-124 er blandt de eksempler [15]. I øjeblikket ved vi ikke, om physciosporin sandsynligvis fungerer som microRNA til at undertrykke 3′-UTR aktivitet KITENIN. Men som ukonventionelle KITENIN /ErbB4-medieret nedstrøms signal om EGF spiller en af den molekylære basis for giver resistens over for anti-EGFR agenter, ekstrakt af
P
.
coriacea
physciosporin kan have potentiale til gavn aktivitet overvinde den begrænsede kliniske effekt af anti-EGFR-behandling.
Rho GTPaser, medlemmer af Ras superfamilien af små GTPaser såsom Rac1, Cdc42, og
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.