PLoS ONE: Aerosolized BC-819 inhiberer Primær men ikke Sekundær Lung Cancer Vækst

​​

Abstrakt

På trods af mange anstrengelser, narkotika baserede behandlinger for patienter, der lider af lungekræft er stadig dårlig. Som et lovende alternativ, undersøgte vi det terapeutiske potentiale af BC-819 til behandling af lungekræft i musetumormodeller. BC-819 er et hidtil ukendt plasmid-DNA, som koder for A-fragmentet af difteritoksin og har tidligere vist sig at kunne inhibere tumorvækst i human klinisk undersøgelse med blærecarcinom. I et første sæt eksperimenter undersøgte vi

in vitro

effekten af ​​BC-819 i humane lungecancer-cellelinier NCI-H460, NCI-H358 og A549, som afslørede 90% reduktion af cellevækst.

In vivo

effekt blev undersøgt i en ortotopisk mus xenograft lungekræft model og i en lunge metastase model ved hjælp af selvlysende A549-C8-Luc adenocarcinom celler. Disse celler resulterede i peri- og intra-bronchiolær tumorer upon intrabronkiale ansøgning og parenkymale tumorer upon intravenøs injektion hhv. Mus der lider af disse lungetumorer blev behandlet med BC-819, kompleksbundet til forgrenet polyethylenimin (PEI) og aerosoliseret til musene en gang om ugen i en periode på 10 uger. Ved hjælp af denne behandling, en vækst på intrabronkialt inducerede lungetumorer var signifikant hæmmet (p = 0,01), mens der kunne observeres nogen effekt hos mus, der lider af lunge metastase. Sammenfattende foreslår vi, at aerosoliseret PEI /BC-819 er i stand til at reducere væksten kun i tumorer skyldes den luminale del af luftvejene og er derfor direkte tilgængelige for inhaleret BC-819

Henvisning:. Hasenpusch G, Pfeifer C, Aneja MK, Wagner K, Reinhardt D, Gilon M, et al. (2011) Aerosolized BC-819 Hæmmer Primary men ikke Sekundær Lung Cancer Growth. PLoS ONE 6 (6): e20760. doi: 10,1371 /journal.pone.0020760

Redaktør: Dominik Hartl, Ludwig-Maximilians-Universität München, Tyskland

Modtaget: 1. februar, 2011; Accepteret: 9 maj 2011; Udgivet: 8 juni 2011

Copyright: © 2011 Hasenpusch et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af BMBF BioFuture programmet (FKZ0311898), programmet 13N9182, LMUexcellent (Investitionsfonds), DFG RU 911 /9-1 og Emma Thaler Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ifølge epidemiologiske undersøgelser, lungekræft er stadig den hyppigste årsag til kræftrelaterede dødsfald på verdensplan med kun 15 procent af alle patienter i USA og 10 procent af alle patienter i Europa overlever mere end fem år efter diagnosen af ​​sygdommen [ ,,,0],1]. Denne situation skyldes især sene diagnose af lunge tumorer og manglende terapeutiske effekt af for tiden tilgængelige anticancer-lægemidler, især i fremskredne stadier af sygdommen, når kirurgisk ablation ikke er muligt eller tumorer opstå igen efter operationen.

For at lukke denne terapeutiske hul blev genterapi foreslået som lovende mulighed for at blande sig med kritiske molekylære veje for kræftceller [2]. Nylige strategier forsøgt i kliniske undersøgelser omfattede induktion af tumorcelle apoptose ved erstatning af muteret p53 tumorsuppressorgenet, tumorcelle selvmord gennem induktion af gener, der koder for specifikke enzymer, der er følsomme over for ellers godartede agenter og aktivering af immunsystemet med gener, der koder for cytokiner [3]. Størstedelen af ​​genterapeutiske fremgangsmåder er baseret på virale vektorer, som er meget effektiv, men på grund af udvikling af neutraliserende antistoffer, ugunstige til gentagen anvendelse. Ikke-virale vektorer, skønt egnet til gentagen anvendelse, er relativt mindre effektive, især i luftvejene [4].

På grund af sikkerhedsspørgsmål, genterapeutiske midler fortrinsvis lokalt administreret i løbende kliniske forsøg. Faktisk lokal påføring af lægemidler har vist sig at være fordelagtigt i forskellige lungesygdomme, såsom astma, COPD og for nylig i lungekræft [5]. I tilfælde af lungekræft for eksempel anvendelse af kemoterapeutiske lægemidler billede højere pulmonal lægemiddelniveauer og derudover reducerede systemiske bivirkninger [6]. På grund af disse gunstige distributionsomkostninger egenskaber, har aerosoler været betragtet for anvendelse af gen terapeutiske midler. Plasmid-DNA, kompleksbundet med kationiske polymerer, resulterede i vellykket transfektion af bronchiale og alveolær epitel med reportergener [7], [8] og reducerede tumorvækst, når en terapeutisk plasmid koder for p53 blev påført på lungen tumorbærende mus [9].

Endvidere ville det være ønskeligt at begrænse aktiviteten af ​​den anvendte plasmid-DNA til de lungetumorceller kun celler, hvilket giver det sunde væv upåvirket. I denne sammenhæng kunne plasmid BC-819 (også kendt som DTA-H19) være en ideel kandidat. Plasmid BC-819 koder for difteri toksin A fragment under kontrol af H19-promotoren. Ekspression af difteri toksin A fragment uundgåeligt ødelægger celler ved øjeblikkelig afbrydelse af proteinsyntese og H19 promotoren begrænser dets ekspression til tumorceller [10]. H19 er et faderligt præget, maternelt udtrykt, onkoføtalt gen, der har ingen proteinprodukt [11]. Det udtrykkes på betydelige niveauer i flere forskellige humane tumor typer, men er kun marginalt udtrykt eller helt fraværende i normale voksne væv [12]. Nylige data antydede en rolle for H19 i at fremme udviklingen af ​​kræft, angiogenese og metastase [13].

Selvom aerosoliseret genterapi har vist sig at være effektive i musemodeller for lungekræft, vi spørgsmålstegn ved, om lokaliseringen af ​​tumorer kan have en virkning på effektiviteten af ​​tumorspecifikke BC-819-plasmidet. Af denne grund blev plasmid BC-819 anvendes som en aerosol i to grupper af mus, der lider af lungetumorer enten induceret af intrabronchial eller intravenøs injektion af humane lungecancerceller. For at kvalificere og kvantificere tumor udvikling

in vivo

blev selvlysende celler bruges til at generere lunge tumorer.

Materialer og metoder

Kemi

forgrenede polyethylenimin (PEI , gennemsnitlig molekylvægt 25 kDa) opnåedes fra Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Tyskland). PEI blev fortyndet i destilleret vand (vand til injektion, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Tyskland) og indstillet til pH 7 med HCI. D-Luciferin blev opnået fra Synchem (Felsberg /Altenburg, Tyskland).

plasmider

De plasmider pCluc og pUC21 blev indhentet fra plasmid Factory (Bielefeld, Tyskland). De plasmid pCluc koder for reporter enzym luciferase stammer fra

Photinus pyralis

. Plasmidet pUC21 blev anvendt som negativ kontrol. Plasmidet BC-819 koder for A-fragmentet af difteritoxin (DT-A) under kontrol af H19 promotoren og er allerede blevet beskrevet andetsteds [10].

Cellelinjer

Cellen A549 blev afledt fra en human lungetumor og histologisk klassificeret som en adenocarcinom [14]. De cellelinjer NCI-H460 og NCI-H358 blev isoleret fra human prøve så godt og histologisk klassificeret som storcellet udifferentierede karcinom (NCI-H460) og bronchioloalveolar celle carcinom (NCI-H358). A549-C8-luc celler er A549-celler, stabilt transficeret med genet kodende for reporterenzymet luciferase. Alle cellelinier blev opnået fra DSMZ (tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer, Braunschweig, Tyskland) med undtagelse af A549-C8-luc, som blev købt hos Caliper Life Sciences (Alameda, Californien).

Dyr

Grundet forskellene i dyrenes tumor modtagelighed, forskellige musestammer skulle anvendes til induktion af primære og sekundære lungetumorer, afhængigt af anvendelsen rute af tumorcellerne. T-celle-deficiente nøgne mus blev beskrevet som gode donorer for intrabronchialt anvendte tumorceller nylig [15] og derfor valgt til induktion af primære lungetumorer. Vellykket generation af lungetumorer ved systemisk administration af tumorceller imidlertid blev rapporteret at kræve donordyr med en høj grad af immundefekt. Derfor T-, B- og naturlige dræberceller celle mangelfuld CB17.Cg-

Prkdc

SCID

Lyst

bg-mus blev anvendt til sekundære tumor model, bare som beskrevet af tidligere forfattere [16].

før eksperimenterne blev dyrene akklimatiseret i mindst 7 dage. Alle yderligere procedurer blev godkendt og kontrolleret af den lokale etiske komité (Regierung von Oberbayern) under godkendelsesnummer 16-08 og blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i den tyske lov om beskyttelse af fauna.

ortotopisk tumor implantation procedure

intrabronchial ansøgning.

NMRI-

Foxn1

nu

mus blev bedøvet gennem intraperitoneal injektion af medetomidin (11,5 mg /kg), midazolam (115 ug /kg ) og fentanyl (1,15 ug /kg) og efterfølgende placeres på en vinkelformet bord for at visualisere glottis under anvendelse af en lyskilde, en otoskop og en modificeret spatel (Hallowell, USA). 1 × 10

6 A549-luc-C8-celler fortyndet i 100 pi PBS blev påført orotracheally med en stumpendet, bøjet 27 G kanyle af rustfrit stål som blev tilpasset til en 1 ml

Injekt-F

plastsprøjte (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Tyskland). Efter implantation procedure, anæstesi blev modvirket gennem subkutan injektion af en modgift bestående af atipamezol (50 ug /kg), flumazenil (10 ug /kg) og naloxon (24 ug /kg). Mus inddrives fra anæstesi inden for 15 minutter.

Intravenøs anvendelse.

Bevidst CB17.Cg-

Prkdc

SCID

Lyst

bg -mice blev anbragt i en mus-harpiksstopperen (Braintree Scientific Inc., USA) og 1 x 10

6 A549-C8-Luc celler fortyndet i 100 pi PBS blev injiceret direkte i den dorsale hale-vene ved anvendelse af en 29G U-100 Insulin sprøjte (BD Consumer Healthcare, Le Pont de Claix, Frankrig).

In vivo imaging

Dyrene blev bedøvet lige som beskrevet før. D-luciferin substrat (3 mg /100 pi PBS pr mus) blev påført ved intraperitoneal injektion i gruppen af ​​mus, der lider af lungetumorer som blev provokeret ved intravenøs injektion af A549-C8-luc celler. Mus, der lider af tumorer, der blev induceret af intrabronchial anvendelse af A549-C8-luc modtog den samme mængde D-Luciferin fortyndet i 50 pi PBS via den intranasale rute [17]. Bioluminescens blev målt 10 minutter senere, ved hjælp af en IVIS 100 Imaging System (Xenogen, Alameda, USA) og kameraindstillinger: synsfelt 10, f1 f-stop, høj opløsning Binning og eksponering-tid på 5 min. Signalet blev kvantificeret og analyseret ved hjælp af Living billede Software version 2.50 (Xenogen, Alameda, USA)

Udarbejdelse af PEI-pDNA polyplekser

forgrenede polyethylenimin. (PEI, gennemsnitlig molekylvægt = 25 kDa) blev opnået fra Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Tyskland), opløst i vand, og justeret til pH 7 ved anvendelse af HCI. Polyplekser til aerosol anvendelse blev formuleret som beskrevet tidligere [7]. Kort fortalt: BC-819-plasmidet og forgrenede PEI blev separat fortyndet i destilleret vand til 4 ml, hvilket resulterer i koncentrationer på 0,25 mg /ml BC-819 og 0,33 mg /ml forgrenet PEI henholdsvis (svarende til en N /P-forhold på 10) . PDNA opløsning pipetteres til PEI-opløsning og blandet ved pipettering op og ned for at opnå en endelig pDNA koncentration på 0,125 mg /ml. Komplekserne blev inkuberet i 20 minutter ved omgivelsestemperatur før brug.

Aerosol anvendelse af PEI-pDNA polyplekser Salg

Aerosol ansøgning blev udført som tidligere [18] beskrevne. Kort fortalt en LC STAR Nebulizer (Pari, Starnberg, Tyskland), drevet af højt tryk, som blev genereret fra en BOY®SX kompressor (Pari, Starnberg, Tyskland) var forbundet til et afstandsstykke, fyldt med 500 g Tørring perler Orange (Sigma -Aldrich, Deisenhofen, Tyskland). Afstandsstykket igen blev forbundet til en plastkasse med fire små huller på den modsatte side, for at tillade aerosol flow. For at lette højere aerosol aflejring i lungen blev dyr tilskyndes til accelereret vejrtrækning ved at drive kompressoren med syntetisk luft, beriget med 5% CO

2.

Histologi

Dyr var aflivet ved intraperitoneal injektion af pentobarbital. Efterfølgende lungerne blev fjernet, oppustet med 4% paraformaldehyd gennem luftrøret og viderebehandles til Hæmatoxylin-Eosin-farvning ifølge en standardprotokol.

In situ hybridisering

In situ hybridisering (ISH ) blev udført som beskrevet af Ariel et al [16], under anvendelse af digoxigenin-mærket H19-RNA probe eller ved en modifikation af denne fremgangsmåde under anvendelse af H19-LNA (Locked nucleic acid) Dig-mærket probe syntetiseret hos Exiqon.

Statistik

Resultater er rapporteret som gennemsnit og standardafvigelser. Statistisk signifikans mellem to grupper blev bestemt med en Mann-Whitney-U-Test for

in vitro

resultater og med en Logrank-test for

in vivo

resultater. Sandsynlighed (P) 0,05 blev betragtet som signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af programmet StatView 5.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA).

Resultater

Plasmid PBC-819 hæmmer

in vitro

celledeling af humane lunge kræftceller

In vitro

transfektion eksperimenter blev udført i forskellige menneskelige lungecancer afledte cellelinjer. Stigende mængder af pBC-819 (0, 350 og 700 ng) blev co-transficeret med 100 ng af luciferase kodende plasmid. Den totale mængde af pDNA blev fyldt op til 800 ng for alle de sammenlignede prøver under anvendelse pUC21 plasmid som fyldstof pDNA. Derfor blev effekten af ​​pBC-819 indirekte bestemt ved en reduktion af luciferaseaktivitet, hvilket indikerer destruktion af transficerede tumorceller.

Brug af Lipofectamine 2000 som transfektionsreagens, et tidspunkt og dosisafhængig nedgang af luciferaseaktivitet blev observeret i hver af de anvendte cellelinier. Virkningen af ​​pBC-819 blev tilsyneladende så tidligt som 24 timer efter transfektion med en reduktion i luciferaseaktivitet på mere end 90%, når 350 ng (fig. 1A) og mere end 95% (fig. 1B), når 700 ng BC- 819 blev anvendt. Mere end 98% af luciferaseaktiviteten blev inhiberet 48 timer efter transfektion, når 700 ng BC-819 blev anvendt. Lignende resultat blev også opnået med 350 ng, bortset fra cellelinie NCI-H358.

NCI-H460, NCI-H358 og A549-celler blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 med BC-819 og co-transficeret med et plasmid, der koder for reporterenzymet luciferase. Så tidligt som 24 timer efter transfektion, luciferaseaktivitet (indirekte indikerer cellevækst) blev reduceret med mindst 90%, når 350 ng BC-819 blev anvendt (A). 48 timer senere luciferaseaktivitet blev reduceret med mere end 98%, undtagen for cellelinie NCI-H358. Imidlertid blev en luciferase fald på mere end 98% observeret i alle cellelinier, når mængden af ​​BC-819 blev forøget til 700 ng (B). Indflydelsen af ​​BC-819 på bioluminescerende A549-C8-luc blev undersøgt samt og afslørede nedsat luciferase og derfor reducerede cellevækst (over 50%) så tidligt som efter 24 timer (C). Maksimal hæmning af cellevækst blev nået ved 48 timer efter transfektion, bliver tilsyneladende gennem mere end 75% reduktion i luciferaseaktivitet.

Disse studier inspirerede os til at screene dette plasmid med cellelinje A549-C8 luc, som var blevet stabilt transficeret med luciferase. Måling af luciferase på forskellige tidspunkter efter transfektion viste, at BC-819 var effektivt til A549-C8-luc celler så tidligt som 24 timer efter transfektion (fig. 1C). Den lavere koncentration (400 ng) af BC-819 viste sig at være stand til at reducere luciferaseaktivitet med mere end 50%. Brug af 800 ng BC-819, var det muligt at formindske luciferaseaktiviteten med mere end 75%. Tilsammen disse undersøgelser viste en klar effekt af plasmid BC-819 på celle levedygtighed humane lunge kræftceller

in vitro

.

Vækst af lungetumorer afhænger af anvendelsen stedet af tumorceller

for at vurdere effektiviteten af ​​pBC-819 aerosolterapi

in vivo

, ortotopisk lungetumorer blev genereret i immun mangelfuld mus ved intrabronchial eller intravenøs anvendelse af A549-C8-Luc celler. Vi fandt, at valget af ansøgningen rute vid udstrækning påvirket vækstmønstre af de resulterende lungetumorer og påvirket dyr overlevelse. Intrabronkial anvendelse af A549-C8-Luc celler gav anledning til luminescerende tumorer, der oprindeligt lokaliseret i den jugulare region, med 10 dage efter transplantation og derefter udbrede kaudalt til venstre eller højre lunge inden for 66 dage (fig. 2A). Men tumorer, som blev induceret ved intravenøs injektion af A549-C8-Luc tumorceller, blev karakteriseret ved disseminerede bioluminescens signaler i begge lunger efter 10 dage, som derefter uafbrudt (fig. 2B).

Vækst af ortotopisk lunge tumorer blev målt ved definerede tidspunkter ved hjælp af bioluminescens billeddannelse. Intrabronkialt inducerede tumorer (A) optrådte oprindeligt i jugularis region og formidles til de dybere lungerne på senere tidspunkter, mens intravenøst ​​inducerede tumorer (B) var begrænset til lungerne regionen alene.

Histopatologisk post mortem undersøgelse af intrabronkialt inducerede lungetumorer afslørede første tegn på tumor væv i peribronchiolar region efter 10 dage (fig. 3A). Undersøgelser på senere tidspunkter afslørede flere tumorknuder, lokaliseret i parenkymet, den peribronchiolar region og inden bronkierne (fig. 3 B-C). Lunger, berøres fra intravenøst ​​inducerede tumorer blev dog karakteriseret ved dissemineret tumorvæv kun i parenkym af organet (fig. 3 D).

Tumorer var påviselige så tidligt som 10 dage efter intrabronkial implantation i peribronchiolar region af lungerne (A). End stadier af intrabronchialt induceret lunge tumorer blev præget af flere, peribronchiolar og parenkymale lokaliserede tumorer (B) og ved tumorvæv inden for de luminale lunge regioner samt (C). Intravenøs injektion af A549-C8-luc resulterede imidlertid i tumorer overvejende vokser i parenkym af lungerne, men ikke peribronchiolar eller inden bronkier (D). Figur D viser parenchymale tumorvæv tæt på en bronkie, men ikke peribronchiolar. Alveolær væv lokaliseret mellem tumor og bronkier dog kondenseres af den tilsvarende tumor knude.

A549-C8-Luc baserede lunge tumorer er stærkt positiv for H19 onkogen

Fordi tilstedeværelsen af ​​den ikke-kodende RNA H19 er afgørende for effektiviteten af ​​BC-819, undersøgte vi tumorvæv for tilstedeværelse af ikke-kodende H19 RNA. In-situ-hybridisering afslørede et stærkt udtryk for H19 i A549-C8-Luc baseret lungetumorer, angivet med brunlig farvning af det undersøgte væv (fig. 4).

En intrabronchialt induceret lunge tumor blev farvet for H.E. (A) og screenet for H19-aktivitet under anvendelse ISH (B). I den givne prøve blev fundet en stærk udtryk for H19, angivet med en brunlig farvning af det undersøgte væv.

Indånding af PEI /pBC-819 aerosol hæmmer primær, men ikke sekundær tumorvækst

Baseret på resultaterne fra

in vitro

eksperimenter, effektiviteten af ​​pBC-819 blev undersøgt

in vivo

gennem anvendelse af aerosoliseret pBC-819-plasmid til lunge tumorbærende mus. Disse forsøg blev udført på mus, der lider af enten intrabronchialt eller intravenøst ​​inducerede lungetumorer for at efterligne pBC-819 indvirkning på primære og sekundære lunge tumorer.

Til efterfølgende aerosol ansøgning pBC-819 blev kompleks til forgrenet PEI og administreres i en modificeret hele kroppen inhalation kammer. Behandling af lunge tumor bærer mus blev startet på 21 dage efter tumor celle transplantation, så snart tegn på lunge tumorer var blevet kontrolleret ved hjælp af

in vivo

bioluminescerende billeddannelse. Behandlingen protokol omfattede en procedure indånding om ugen i en samlet periode på 10 uger.

Disse eksperimenter afsløret enten helt afskaffet eller ramt af alvorlige svækket tumor progression i mus, der lider af intrabronchialt inducerede lungetumorer når de behandles med PEI /PBC- 819 aerosol (fig. 5A-B). En bioluminescens aktivitet på mere end 2 × 10

5 fotoner per sekund var forbundet med et hurtigt fald i dyrets almentilstand (angivet med hurtigt vægttab og dyspnø), og derfor defineres som endpoint-kriterier. Baseret på denne proceduremæssig metode blev en median overlevelse på 66 dage beregnes for dyr af den ubehandlede kontrolgruppe. I modsætning hertil behandlede mus overlevede mere end 200 dage, selvom aerosol anvendelse af PEI /pBC-819 aerosol blev afsluttet mere end 100 dage tidligere, på dag 91. Med undtagelse af en mus, alle behandlede mus (n = 5) overlevede mere end 200 dage, enten fri for lungetumorer eller viser reduktion af tumorvækst og ingen forringelse af den generelle tilstand. En mus havde ingen tegn på tumor bevismateriale i lungerne på dag 200, men faktisk en fjernt metastase i hjernen (data ikke vist).

Vækst af lungetumorer i ubehandlede mus var karakteriseret ved initial tumor udseende i halsregionen og efterfølgende kontinuerlig udbredelse i lungerne (A). Dette vækstmønster afveg i mus, der blev behandlet med BC-819, hvor tumorer enten faldt i størrelse eller i helt forsvundet under behandlingen.

Endelig dag 200 blev valgt til at være den endpoint. Statistisk analyse af resultaterne viste en stærkt statistisk signifikant forskel (p = 0,01) mellem behandling og kontrolgruppen med hensyn til tid, der var nødvendig for at nå endpoint (fig. 6A).

Mus bærende intrabronchialt induceret lungetumorer viste en signifikant overlevelsesfordel (p = 0,01), når de behandles med BC-819 sammenlignet med dyr, der modtog ingen behandling (a). Ingen overlevelse fordel blev observeret hos mus, der lider af intravenøst ​​induceret lunge tumorer, uafhængig af behandling med BC-819 (B).

Behandling med PEI /pBC-819-aerosol viste sig at være mindre effektiv i mus lider lungetumorer, som blev genereret gennem den intravenøse injektion af A549-C8-luc tumorceller. Som nævnt før, tumorceller trængt ned i lungerne gennem blodcirkulationen dermed påvirke lokaliserings- og vækstmønstre af lungetumorer, hvilket resulterer i tumorer vokser i parenchym, men ikke i bronkier. Under denne betingelse, behandling med PEI /pBC-819-aerosol resulterede ikke i nogen statistisk signifikant forskel mellem behandlede og ubehandlede dyr. Selvom intravenøst ​​inducerede tumorer voksede hurtigere, blev forringelse af den generelle tilstand er anerkendt, så snart en luciferaseaktiviteten oversteg 1 × 10

6 fotoner per sekund, som derfor blev valgt som et slutpunkt for mus, der lider af intravenøst ​​inducerede lunge tumorer. Den mediane tid til at nå dette endpoint var 43 dage for de ubehandlede dyr og 36 dage for de behandlede dyr. Endvidere statistisk analyse af disse resultater viste ingen signifikant forskel (p = 0,3) mellem behandlede og ubehandlede mus (fig. 6B).

Sammenfattende resultaterne af disse forsøg viser, at aerosoliseret PEI /pBC-819 er stand til at inhibere lunge tumorvækst i mus, der lider af intrabronchialt inducerede lungetumorer. Desuden er de foreliggende resultater viser, at en sammenlignelig effekt ikke kunne observeres i mus, der led af parenkymatisk lungetumorer, efter intravenøs anvendelse af tumorceller.

Diskussion

Genterapi anses for at lette behandlingsmuligheder for uhelbredelige lungesygdomme herunder monogenetiske defekter som cystisk fibrose, alpha

1-antitrypsin-mangel og kompleks sygdom som astma og lungekræft [19]. I denne henseende har lokal anvendelse af genterapeutiske medikamenter som aerosoler blevet anset for at være fordelagtig til målretning af lungerne, fordi i) den ønskede medikament kunne indgives i en stor mængde direkte på stedet for sygdom og ii) alvorlige bivirkninger, som kunne fremprovokeres ved systemisk anvendelse af nukleinsyrer og /eller genterapeutiske vektorer ville blive minimeret. Begrebet aerosol baseret genterapi blev yderligere undersøgt i det foreliggende arbejde gennem anvendelse af plasmidet BC-819 i en ortotopisk xenograft model af human lungekræft. I denne henseende undersøgte vi, hvis tumor cellespecifikke plasmider var i stand til at ødelægge kun primære tumorer i luminale luftveje eller hvis de var også i stand til at vise en virkning mod sekundære tumorer placeret i parenchymale væv. For at løse dette spørgsmål, blev lungetumorer fremkaldt ved hjælp af to forskellige anvendelsesområder ruter af lungekræft celler. Tumorer vokser fra den luminale side af lungerne blev opnået, når cellerne blev anvendt intrabronchialt og tumorer vokser fra blodkarrene-siden blev opnået ved at anvende cellerne intravenøst. Histologi af intrabronkialt inducerede tumorer afslørede tegn på tumorer i parenkym af orglet og i de bronchiale vægge. Disse resultater svarer til resultaterne, som blev rapporteret af andre forfattere [15]. Intravenøs injektion af tumorceller resulterede imidlertid i carcinomer kun vokser i parenkym af lungerne, men ikke i de bronchiale vægge. Tumor vækst overvågning ved hjælp af selvlysende billeddannelse fremmet opnåede resultater fra histologi, afslører forskellige vækstmønstre af tumorer, som blev induceret intrabronchialt og intravenøst. Interessant fandt vi, at intrabronchialt inducerede lungetumorer skyldes den peribronchiolar region, der tyder på, at intrabronchialt anvendte celler skal være i stand til at invadere og erobre bronchiale epitel for at kolonisere peribronchiolar væv. Dette fund er opmuntrende med hensyn til resultaterne af andre grupper, der demonstrerede kolonisering af lunge epitel med mærkede gensplejsede mesenchymstamceller, når de påføres gennem intrabronkial rute [20]. Baseret på den antagelse, at intrabronchialt anvendt tumorceller oprindeligt invadere epitel lag i de bronchiale regionen til efterfølgende spredt peribronchiolar, vi foreslog, at behandling med aerosoliseret BC-819 bør være effektive i at ødelægge tumorcellerne som vi og andre tidligere har vist, at forstøvet luciferase kodning plasmid-DNA overvejende transfects de bronchiale og alveolære epithel når kompleks til forgrenet PEI [7], [8].

for at underbygge vores antagelse, vi behandlede tumor-bærende mus med plasmidet BC-819, som har for nylig vist sig at være terapeutisk effektive i BCG-resistente blærecarcinomer hos patienter [21]. Plasmid BC-819 koder for A-fragmentet af difteritoksin og drives af H19 promotoren. Som H19 promotoren er kun aktiv i maligne celler og under embryogenese, er tumorvæv ødelægges, mens sundt væv forbliver uskadt [10]. Forud for

in vivo

eksperimenter effekten af ​​BC-819 blev konstateret i lungekræft cellelinjer NCI-H460, NCI-H358 og A549

in vitro

, afslører en betydelig hæmmende effekt på celle vækst. Det er tidligere blevet vist, at den ikke-kodende H19 mRNA udtrykkes stærkt, hvilket indikerer aktiv H19 promotoren, i lungekræft cellelinier, især i A549 [22]. Derfor blev lungecancer hos mus induceret ved hjælp af luciferase udtrykkende cellelinie A549-C8-luc som også havde vist sig at være modtagelige for plasmidet BC-819. Desuden blev lungerne undersøgt post mortem for H19-ekspression ved In-situ-hybridisering som afslørede stærke beviser for H19 udtryk i A549-C8-Luc lungetumorer.

Dette eksperiment viste, at ugentlig aerosol behandling med PEI /BC-819 giver en signifikant (p = 0,01) overlevelsesfordel for mus, der lider af intrabronchialt inducerede lungetumorer men ikke til mus, der lider af intravenøst ​​inducerede lungetumorer (p = 0,36). Baseret på disse resultater, vi spekulere, at PEI /BC-819 aerosol behandling er kun effektiv i primære lungetumorer, der er tilgængelige ved indånding, fordi den maligne vækst overvejende skyldes den luminale del af luftvejene. I modsætning hertil, tumorvækst af intravenøst ​​inducerede lungetumorer udvikler sig primært fra blodkarrene, efterfølgende invaderer parenkym af lungen. Som nævnt før, er aerosol baseret genoverførsel overvejende begrænset til de bronchiale epitel. Bestemt dette betyder ikke, at terapeutiske virkninger ikke kunne opnås for hele organet. Faktisk lykkedes flere undersøgelser vist effekter af forstøvet pDNA i sekundære modeller af lungekræft [23]. Der blev imidlertid andre plasmidkonstruktioner anvendt i disse undersøgelser, uden cancer cellespecifikke promotorer og herunder gener for mindre celle toksiske proteiner, f.eks tumor suppressor protein p53. Endvidere vil et apoptotisk protein, såsom p53 sandsynligvis ikke føre til øjeblikkelig ødelæggelse af den transficerede celle, derfor øge muligheden at overdreven p53 kunne frigives fra den transficerede celle eller mere sandsynligt, parakrin eller interleukin-medieret signalering kunne aktiveres i det omgivende væv.

selvom aerosol ansøgning virker lovende for fremtidige behandlinger af alvorlige lungesygdomme, bør det holdes for øje, at denne form for terapi synes også meget gerne en balancegang gåtur. Faktisk vil sandsynligheden for alvorlige bivirkninger, såsom inflammation eller allergiske reaktioner, øges med toksicitet og irritabilitet af de anvendte stoffer, som derfor begrænser fordel af inhalationsvejen. Bekymringer som disse kan have været overvejet især til aerosol anvendelse af cytotoksiske stoffer, såsom paclitaxel [6] eller doxorubicin [5], men kan også være relevant for anvendelsen af ​​nukleinsyrer. Faktisk en potent immunsystem ikke kun virker på fremmede patogener, men også på ikke-virale vektorer og nukleinsyrer. Imidlertid har kun en svag stigning af cytokiner blevet beskrevet for aerosol anvendelse af forgrenede PEI til lungerne [24], [25], [26]. Udover inflammation grundet immunreaktioner, kan alvorlige bivirkninger udvikle sig fra ødelagte væv. I denne forbindelse bør det overvejes den særlige arkitektur af lungerne. Den høje forekomst af blodkar hæver modtagelighed for livstruende lunge blødninger (hæmoptyse), der kunne fremkaldes ved celle-toksiske stoffer [27]. Under denne overvejelse forekommer det sandsynligt, at tumor cellespecifikke plasmider, såsom BC-819, der kun ødelægger tumor, men ikke sundt væv kunne bringe lovende fordele for aerosol behandling af lungekræft.