PLoS ONE: Lithium Modulerer Autophagy i Esophageal og Kolorektal Cancer Cells og Forbedrer Effekten af ​​terapeutiske midler in vitro og in Vivo

Abstrakt

Mange epitelial kræft, især gastrointestinale tarmkanalen kræft, forbliver dårlig prognose sygdomme, på grund af imod cytotoksisk terapi og lokal eller metastatisk recidiv. Vi har tidligere vist, at apoptose inkompetente øsofageale cancerceller inducerer autophagy som reaktion på kemoterapeutiske midler og dette kan lette deres udvinding. Imidlertid kunne kendte farmakologiske inhibitorer af autofagi ikke øge cytotoksicitet. I denne undersøgelse har vi undersøgt to godt kendte, klinisk godkendte autofagi induktorer, rapamycin og lithium, for deres virkninger på kemosensitivitet i apoptose inkompetente kræftceller. Både lithium og rapamycin blev vist at inducere autophagosomes i esophageal og colorektale cancerceller ved Western blot-analyse af LC3 isoformer, morfologi og FACS kvantificering af Cyto-id eller mCherry-GFP-LC3. Analyse af autophagic flux indikerer ineffektiv autophagosome forarbejdning i lithium behandlede celler, hvorimod rapamycin behandlede celler viste effektiv flux. Levedygtighed og inddrivelse blev vurderet ved klonogene assays. Når det kombineres med det kemoterapeutiske middel 5-fluoruracil, rapamycin var beskyttende. I modsætning hertil udviste lithium stærk forøgelse af ikke-apoptotisk celledød. Kombinationen af ​​lithium med 5-fluorouracil eller oxaliplatin blev derefter testet i syngene mus (BALB /c) kolorektal cancer model-CT26. Når enten kemoterapeutiske middel kombineredes med lithium en signifikant reduktion i tumorvolumen blev opnået. Desuden blev overlevelse dramatisk forøget i kombinationen (p 0,0001), med 50% af dyrene opnår langsigtet kur uden re-forekomst ( 1 år tumor gratis). Således kan kombinationsbehandling med lithium væsentligt forbedrer effektiviteten af ​​kemoterapeutiske midler i apoptose deficiente cancerceller. Induktion af kompromitteret autofagi kan bidrage til denne cytotoksicitet

Henvisning:. O’Donovan TR, Rajendran S, O’Reilly S, O’Sullivan GC, McKenna SL (2015) Lithium modulerer autofagi i spiserøret og Kolorektal Cancer Cells og Forbedrer Effekten af ​​terapeutiske midler

In vitro

In Vivo

. PLoS ONE 10 (8): e0134676. doi: 10,1371 /journal.pone.0134676

Redaktør: Ilya Ulasov, svensk Neuroscience Institute, UNITED STATES

Modtaget: April 28, 2015; Accepteret: 13 Juli 2015; Udgivet: 6 August, 2015

Copyright: © 2015 O’Donovan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:.. Finansieringen blev leveret af Health Research Board HRA_POR /2011/55

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Makro-autofagi er en evolutionær bevaret kataboliske proces, hvorigennem en celle genbruger sine egne makromolekyler og organeller. Intra-cellemateriale bliver indarbejdet i dobbelt membraned vesikler betegnes autophagosomes, der efterfølgende smugles til lysosomet for nedbrydning. Autophagy fremtræder nu som en central proces, som kan modulere tumorigenese og respons på behandling. Det kan være tumor undertrykkende da det åbner beskadigede organeller og opretholder integriteten af ​​en celle under stress. Men når en tumor er etableret, er autophagy vist, at være en vigtig overlevelse vej som den beskytter mod en række spændinger, herunder, hypoksi, metabolisk stress, anoikis og kemoterapi [1]. Desuden har overdreven autofagi blevet rapporteret at inducere type II celledød som er en kritisk celledød pathway og et mål for terapeutisk intervention, især i tumorer, som har mistet apoptose kompetence [2] [3]. Autophagy er derfor et adaptivt respons, som udviser en høj grad af plasticitet og har kontekstafhængig roller i tumor cellebiologi. Det er fortsat uklart, hvordan man bedst til at modulere det for terapeutisk gevinst.

Vi har tidligere vist, hvor vigtigt det autophagy i terapeutisk modstand i kræft i spiserøret. Vi undersøgte cellulære responser i uselekterede øsofageale cancercellelinjer behandlet med kemoterapeutiske midler (5-fluoruracil og cisplatin). Drug sensitive celler er apoptose kompetent og ikke komme efter tilbagetrækning af lægemidlet. I modsætning hertil mere resistente celler inducerede ikke apoptose, men udviste autofagi. Nogle af disse celler undergik en type II-lignende dødsproces men mange inddrives efter tilbagetrækning af lægemidlet. Knockdown af autophagy regulatorer bekræftede vigtigheden af ​​autophagy for dette opsving [4]. Dette bidrag af autophagy til kræftcelle overlevelse er en stor udfordring i kemoterapi. I betragtning af at mange primære kræftformer og sandsynligvis mest tilbagevendende kræftformer er mangelfuld i apoptose signalering, er vi nødt til at undersøge nye strategier til begrænsning autophagic overlevelse og /eller inducere alternative celle død mekanismer.

Som autofagi er blevet rapporteret at have potentielt modsatrettede roller i tumorudvikling, er to terapeutiske strategier øjeblikket testet i kliniske forsøg. Én strategi er at inhibere cytobeskyttende rolle autophagy, kombineret med konventionelle anticancerlægemidler at sensibilisere de kemoresistent tumorceller til narkotika; den anden er at aktivere autophagic veje og drive apoptose-defekte tumorceller til at gennemgå et alternativ eller “autophagic ‘celledød [5]. Autophagy inducere i kliniske forsøg omfatter; mTOR-hæmmere (herunder rapamycin analoger, everolimus, teserolimus) og autophagy hæmning primært bliver målrettet med lysosomale hæmmere chloroquin eller hydroxychloroquin [1]. Et stort problem med begge strategier er, at autophagy veje stadig dårligt forstået, som er den måde, hvorpå specifikke kræftformer bruge dem. Vi har først for nylig begyndt at forstå den høje grad af selektivitet i de forskellige typer af autofagi og involverede signalering. For mange af de nuværende forsøg, vil det være vanskeligt at fastlægge den rolle autophagy i succes eller fiasko af regimet, som pålidelige molekylære markører for autophagic svar ikke er blevet etableret. Hertil kommer, inden for det begrænsede repertoire af hæmmere og induktorer, der er agenter med tydelige forskelle i deres virkningsmekanismer (med de fleste at være indirekte inhibitorer /aktivatorer) og data er usandsynligt, at kunne overføres fra én autophagy inhibitor og /eller inducer til en anden. Yderligere undersøgelser skal derfor bedre at forstå de handlinger autofagi modulatorer i kræftceller.

I vores tidligere undersøgelse, vi testede autofagi hæmmere (3-MA og bafilomycin) til chemosentizing effekter i esophageal kræftceller. Ingen af ​​disse midler var effektive som kemosensibilisatorer [4]. Her har vi undersøge virkningerne af to velkendte, men mekanistisk forskellige autofagi induktorer, rapamycin og lithium, om kemosensitivitet i kræftceller. Begge disse midler (eller deres analoger) er licenseret til klinisk brug. Vi viser, at begge midler inducerer autofagi i kræftceller. Rapamycin ikke øge narkotika følsomhed, mens lithium viser stærk forøgelse af toksicitet med

in vitro

in vivo

modeller af gastrointestinale kræftformer.

Materialer og Metoder

Cell Kultur og reagenser

Etablerede humane kræft i spiserøret cellelinjer OE19, OE21 og OE33 blev opnået direkte fra European Collection of Cell Cultures. KYSE450 celler var fra DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH). Murin coloncarcinomcellelinie CT26 blev opnået direkte fra American Type Culture Collection (ATCC). OE19, OE21 og OE33 cellelinier blev opretholdt i RPMI 1640-medium (Sigma R8758), blev KYSE450 celler holdt i 50:50 RPMI 1640: F-12 HAMS medium (Sigma N6658), og CT26-celler blev holdt i DMEM-medium (Sigma D6429 ). Alle kulturer blev suppleret med 1% penicillin /streptomycin (Gibco Life Technologies 15070-063), 10% (v /v) føtalt kalveserum (Sigma F7524) ved 37 ° C, 5% CO

2. Alle reagenser blev fremskaffet fra Sigma, medmindre andet er angivet. Lithiumchlorid L9650, lithiumcarbonat 255.823, rapamycin R8781, 5-fluorouracil (5-FU) F6627, chloroquin C66288. Oxaliplatin (Eloxatin 5 mg /ml) var fra Sanofi Aventis.

Cyto-ID Autophagy afsløring

Celler blev podet i tre eksemplarer (3,0 x 10

4 celler /cm

2) og behandlet med lithium (10-30 mM) eller rapamycin (100-300 nM) alene eller i kombination med chloroquin (10 uM) i 24 og 48 timer i brønde i en plade med 6. Celler blev høstet med trypsin og fremstillet ifølge producentens instruktioner. CYTO-ID assay (Enzo Life Sciences ENZ-51031-K200) inkorporerer en 488 nm-exciteres grønt fluorescerende påvisningsreagens, som specifikt fluorescerer i autophagic vesikler. En stigning i antallet af autophagic vesikler, som pletten grøn detekteres som en stigning i fluorescens i FL-1 kanal. Celler blev inkuberet i Cyto-ID (1 pi Cyto-ID /1ml celledyrkningsmedium uden phenolrødt-indikator) i 30 minutter og vasket før analyse ved flowcytometri FACScan.

Western blotting og antistoffer

Totalt cellulært proteinekstrakter blev fremstillet ved at skrabe cellerne ind modificeret RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,25% natriumdeoxycholat, 1% Igepal, 1 mM EDTA, 1 x Pefabloc, 1x protease inhibitor cocktail , 1 mM Na

3VO

4, 1 mM NaF). Alle proteinprøver blev adskilt på NuPAGE 4-12% Bis-Tris-geler og elektroforetisk overført på PVDF-membran (Invitrogen Life Technologies NP0322 og IB401001). Membraner blev inkuberet med anti-LC3 (polyklonale kanin-antistof-MBL PD014, 1: 500 fortynding), anti-LAMP 1 (monoklonalt muse-antistof-Abcam ab25245, 1: 5000 fortynding), anti-LAMP 2 (polyklonale kanin-antistof-Abcam ab101325 , 1: 500 fortynding) eller anti-cathepsin B (monoklonalt muse-antistof-Abcam ab58802, 1: 500 fortynding) antistoffer natten over ved 4 ° C og med anti-β-actin (loading control) (Sigma A5441) i en time ved stue temperatur. Proteiner blev visualiseret ved hjælp af relevante IR-Dye konjugerede sekundære antistoffer (Rockland) på Odyssey IR imaging system (Li-Cor, Cambridge, Storbritannien).

Evaluering af morfologi

For at undersøge cellemorfologi blev behandlede celler cytospun på objektglas og farves med Pro-Diff (Braidwood Laboratories BAPROD1 -Faste og farves med bufferet eosin efterfulgt af methyl thioniner). Apoptotisk celledød er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​to eller flere af følgende morfologiske træk: celle krympning, kromatin kondensering, DNA nedbrydnings- og fragmentering i »apoptotiske organer« som en intakt plasmamembran. Ikke-apoptotisk celledød blev identificeret ved klart tab af cytoplasmisk materiale, pyknosis af kernen og en intakt kernemembran. Cytospin billeder er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Billeder blev taget med et DP70 digitalt mikroskop kamera og Olympus DP-Soft823-version 3.2 software (Mason Technologies Dublin, Irland). Alle billeder er repræsentative for mindst tre separate forsøg.

Kolonidannelse assay

Cellernes evne til at komme sig efter behandlinger og danne kolonier som et monolag blev vurderet ved anvendelse af en kolonidannelse assay. Efter behandling blev alle adhærente celler trypsinbehandlet, talt og levedygtigheden bestemt. Af disse levedygtige celler blev 1.500 celler podet i en brønd af en seks-brønds plade (in triplo). Cellerne fik lov at klæbe og vokse til mellem 10 til 14 dage. At visualisere kolonier, blev mediet fjernet, blev celler fikseret i 96% ethanol i 10 minutter og farvet med Prodiff opløsning C (Braidwood Laboratories E310). Plader blev scannet ved hjælp af Odyssey IR imaging system (Li-Cor, Cambridge, Storbritannien) og kolonier kvantificeret. Resultaterne præsenteres som integrerede intensitet ± SEM fra mindst tre uafhængige forsøg. Når koloni numre var meget lave, blev kolonier manuelt optalt.

pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B udtryk

Celler blev transficeret med 1 pg af pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B udtryk plasmid (Addgene 22418) ved hjælp TurboFect transfektion reagens (ThermoScientific R0531) som anbefalet af producenterne. Fireogtyve timer efter transfektion blev celler behandlet med lithium (20-30 mM) eller rapamycin (200-300 nM) alene eller i kombination med chloroquin (10 uM) i 24 og 48 timer. For at vurdere niveauer af ekspression af mCherry-EGFP-LC3 blev cellerne analyseret via PE og 488 2 kanaler af en BD LSRII flowcytometer (BD Bioscience, Oxford, Storbritannien). Gennemsnitlig fluorescensintensitet blev målt og data præsenteres som gennemsnittet af tre uafhængige forsøg.

Dyr og tumor induktion

Alle dyreforsøg blev godkendt af Det Dyreetiske Eksperimenter Komité (AEEC) af University College Cork og Department of Health (Etik nummer 2010/009), i overensstemmelse med retningslinjer fastsat af Europæiske Fællesskaber (Ændring af dyremishandling handle 1876) regulering 2002 2005 (licensnummer B100 /4499). Mus blev opnået fra Harlan Laboratories (Oxfordshire, England). De blev holdt i patogenfrie betingelser, ved en konstant stuetemperatur (22 ° C) med en naturlig dag /nat lyscyklus på konventionel dyr koloni. Standard laboratorie mad og vand blev leveret

ad libitum

. Før eksperimenter blev musene gav en prøvetid på mindst 14 dage. BALB /c mus af 6-8 uger gamle, med vægte på 18-22 g blev anvendt i alle eksperimenter. Til rutinemæssig tumorinduktion, 1 x 10

6 CT26 (kolorektal carcinom) celler suspenderet i 200 pi serumfrit DMEM blev injiceret subkutant i den højre flanke, efter anæstesi (intraperitoneal (IP) administration af 200 ug xylazin og 2 mg ketamin ). Alle mus blev aflivet ved cervikal dislokation under overdosis af bedøvelse.

In vivo

lithium koncentration

Lithium koncentrationer blev valgt baseret på tidligere

in vivo

undersøgelser som er fokuseret på neurologiske undersøgelser. I humane studier, har 0,6-0,8 mmol /l (mEq /L) er etableret som en sikker terapeutisk dosis hos patienter i langvarig lithium. Bivirkninger kan opstå på et niveau under 1,5 mEq /L. Milde til moderate bivirkninger kan forekomme fra 1,5 til 2,5 mEq /l, og moderate til alvorlige reaktioner kan ses ved niveauer på 2,0 mækv /l og derover [6]. Vi kunne opnå chemosensitization

in vitro dele på lithium svarende til 1,6 mmol /L-dette er i den højere ende af skalaen for mennesker. Med hensyn til dyreforsøg, følgende vifte af koncentrationer er tidligere sikkert ansat (60, 80, 100 og 250 mg /kg) [7-10]. I en undersøgelse, der blev anvendt sammenlignelige koncentrationer lithium, som blev anvendt i dette arbejde blev plasmaniveauer af lithium rapporteret at være 0,25 mM [11]. Dette er lavere end det terapeutiske område i mennesker (0,5-2,0). Vi har valgt 200 mg /kg, efter en titrering til at vurdere toksicitet. Som lovende effekter blev opnået i dyr på denne koncentration-uden toksicitet-vi ikke yderligere at øge denne koncentration.

In vivo

drug delivery

Mus blev tilfældigt opdelt i eksperimentel grupper. Mus blev behandlet ved en tumor volumen på ca. 100 mm

3 i volumen (5-7 mm større diameter). Alle behandlinger blev leveret i 50 ul rumfang givet enten direkte i tumoren, eller via IP injektion hver tredje dag. Behandlingsgrupper var som følger; PBS (kontrol), lithiumchlorid (200 mg /kg), 5-FU (20 mg /kg), oxaliplatin (10 mg /kg) og kombinationer af enten lithium og 5-FU (200 mg /kg, 20 mg /kg ) eller lithium og oxaliplatin (200 mg /kg, 10 mg /kg). Lithium blev rekonstitueret i sterilt phosphatbufret saltvand. Fluorouracil blev leveret af Hospira Irland (25 mg /ml injektionsvæske, opløsning). Oxaliplatin blev leveret af Sanofi Irland (5 mg /ml). Alle lægemidler blev injiceret ved hjælp af aseptiske teknikker til at undgå forurening. Efter lægemiddelbehandling blev tumorer overvåget af alternative dag målinger i to dimensioner, ved hjælp af en skydelære. Tumor volumen blev beregnet efter formlen V = ab

2ᴨ /6, hvor a er den længste diameter af tumoren og “b” er den længste diameter vinkelret på diameteren ‘a’. Dyrene blev aflivet, når tumor mængder oversteg ~ 500/600 mm

3 (ikke større end 15 mm i diameter). Toksiciteten af ​​lithium

in vivo

blev testet ved at undersøge plasmaniveauet af natrium, kalium og kreatinin i alle behandlingsgrupper, 24 timer efter den sidste behandling af en tre ugers undersøgelse. Der var ingen forskel i niveauet af natrium, kalium eller creatinin i nogen af ​​behandlingsgrupperne (PBS-kontrol, lithium, 5-FU, 5-FU lithium). Dette kombineret med den upåklagelig dyrenes sundhed viser, at niveauet af lithium er lavere end i forbindelse med toksicitet. Under forsøgene blev overvågning af dyresundhed (måling af kropsvægt, spiseadfærd, drikke adfærd, krop affald, og tilstanden af ​​huden og pelsen) udført hver dag.

MTT levedygtighed assay

celler blev podet ved 3 x 10

4 celler pr cm

2, behandlet i 48 timer og inkuberet i yderligere 60 minutter ved 37 ° C i 0,5 mg /ml MTT-farvestof (Sigma M2128). Levedygtig, metaboliserende celler reducerer MTT farvestof, der producerer en mørk formazan produkt, med absorbans aflæses ved 562 nm, reference bølgelængde 620 nm.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 5 software . Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev anvendt til at vurdere virkningen af ​​behandlingen på den samlede overlevelse. Log-rank (Mantel-Cox) testen blev anvendt til at sammenligne overlevelse fordelinger af to prøvegrupperne. P-værdi blev betragtet som statistisk signifikant, når det var mindre end 0,05. ** P 0,01, *** p 0,0001. Median overlevelse af hver prøve gruppe blev også bedømt. T-test (uparret) blev anvendt til at vurdere betydningen af ​​gennemsnitlig tumorvolumen på den sidste dag af behandlingen. ** P 0,005.

Resultater

Evaluering af virkningerne af lithium og rapamycin på autophagy induktion i KYSE450 esophageal celler

Vi har tidligere ansat fire esophageal cellelinjer til at undersøge konsekvenserne af apoptotiske og autophagic reaktioner på lægemiddelbehandling [4]. To cellelinjer (OE21 og OE33) blev vist at være apoptose og autofagi kompetente og er relativt lægemiddel følsomme. I modsætning hertil to cellelinjer (KYSE450 og OE19), der reagerer med autofagi alene er mere resistent og kan gendanne efter tilbagetrækning narkotika. Sidstnævnte to cellelinjer er af særlig interesse, da de er tilbøjelige til at være mere repræsentativ for tumorer, der har mistet apoptose kompetenceudvikling. Vi har derfor vurderet effekten af ​​to mekanistisk distinkte autophagy inducere, i første omgang på de KYSE450 celler.

Rapamycin er et kendt mTOR-hæmmer [12], mens lithium er blevet rapporteret at inducere autophagy ved at hæmme inositolmonophosphatase (IMPase) [ ,,,0],13]. Vi bekræftet, at både lithium (lithiumchlorid medmindre andet er angivet) og rapamycin induceret autofagi i KYSE450 celler under anvendelse af Cyto-ID autophagy detektionsassayet, vurdering af LC3 I- og II-isoformer ved Western blotting og ved morfologisk vurdering af vesikel akkumulering.

Øget Cyto-ID fluorescens angivet autophagosome dannelse i lithium (10, 20 og 30 mM) og rapamycin (100, 200 og 300 nM) behandlede celler, ved 24 timer [fig 1A (i) og (ii)] henholdsvis. Lithium induceret autophagy var mere udtalt end den, der induceres ved rapamycin med en stigning på 9,2 gange observeret mellem kontrol og 30 mM lithium behandlede celler sammenlignet med 4,8 gange stigning induceret af den højere koncentration af rapamycin. De viste data repræsenterer tre uafhængige forsøg. Efter 48 timers behandling blev Cyto-ID detekterbar autofagi reduceret i lithium-behandlede celler (2,3 gange stigning observeret mellem kontrol og 30 mM behandlede celler) og ikke påviselig i rapamycinet behandlede celler (data ikke vist).

(A) KYSE450 celler blev behandlet med lithiumchlorid (lithium) (10-30 mM) eller rapamycin (100-300 nM) i 24 og 48 timer. Celler blev vurderet for autophagy induktion 24 timer efter behandling med lithium (i) eller rapamycin (ii) med CYTO-ID autofagi detektion kit. Paneler til venstre viser repræsentative billeder af FACS-analyse, med paneler til højre viser tilsvarende gennemsnitlige fluorescensintensitet. De viste data her er repræsentativt for tre uafhængige forsøg. (B) Western blot-analyse af LC3 ekspression i celler behandlet med lithium (i) eller rapamycin (ii) i 24 timer. LC3I og LC3II båndene blev kvantificeret ved hjælp af Odyssey Infrared Imaging System (Li-COR), normaliseret til p-actin og præsenteret som integrerede intensiteter. (C) Morfologiske træk ved KYSE450 celler efter lithium (30 mM, centerpanelet) eller rapamycin (300 nM, højre panel) behandling i 24 timer. Sorte pile viser akkumulering af vesikler i både lithium og rapamycin-behandlede celler, røde pile angiver perifer vesikel akkumulering (forstørrelse 40x). (D) Celler blev forbehandlet med chloroquin (10 uM) i to timer, før behandling med lithium (10 mM) (i) eller rapamycin (100 nM) (ii) i 48 timer og Autophagy vurderede niveauer med CYTO-ID autofagi afsløring kit. Repræsentative billeder af FACS analyse er vist (n = 3), med indsatte søjlediagrammer viser tilsvarende gennemsnitlige fluorescensintensitet (* p 0,05). E levedygtige celler efter behandling med enten lithium eller rapamycin i 48 timer blev talt og lige numre (1.500 celler per brønd) reseeded i tre eksemplarer, i fravær af lægemiddel. Celler lodes vokse i 14 dage, derefter blev fikseret og farvet og koloni genvækst vurderet.

Western blot-analyse bekræftede en forøgelse i niveauerne af både LC3 I og II efter 24 timer behandling med lithium-[ ,,,0],fig 1B (i)], en effekt, der blev opretholdt i op til 48 timer (data ikke vist). Niveauerne af LC3 II blev også signifikant rejst af rapamycin ved 24 timer [Fig 1B (ii)], og blev delvist reduceret 48 timer efter behandling (data ikke vist).

Morfologisk analyse af KYSE450 celler bekræftede akkumulering af vesikler i cytoplasmaet i celler behandlet med lithium (30 mM) (figur 1C, midterste panel) og rapamycin (300 nM) (fig 1C, højre panel) i 48 timer (også indlysende ved 24 timer, data ikke vist). Pile viser celler med betydelig vesikel akkumulering. Lithium behandlede celler udviste omfattende perifer vesikel akkumulation (røde pile).

Autophagic flux er det udtryk bruges til at beskrive hele processen med autophagy, herunder levering af sekvestrerede komponenter til lysosomer og deres efterfølgende opdeling [14]. Hvis ophobning af autophagosomes alene skyldes en fejl i celler omsætnings- autophagosomes, tilsætning af chloroquin-en lysosomotropiske middel, der hæmmer lysosomal aktivitet og blokerer autophagosome omsætning [15], vil ikke have nogen yderligere effekt på vesikel akkumulation. Derfor, for at skelne mellem autophagy induktion og vesikel akkumulering grund af en fejl i omsætningen, vi pre-behandlede celler med chloroquin (10 uM) før behandling med enten lithium (10 mM) eller rapamycin (100 nM) i 48 timer. Som vist i fig 1D, behandling af KYSE450 celler med chloroquin alene, som forventet, forårsagede en stigning i ophobning af vesikler (grønne overlejringer) som vurderet af Cyto-ID. Lithium alene forårsagede en signifikant stigning i vesikel akkumulering, som blev forøget, men ikke signifikant, ved chloroquin (blå overlay), hvilket antyder kun moderat flux. I modsætning hertil rapamycin alene forårsagede en mere beskeden skift i påviselige autophagosomes. Tilsætningen af ​​chloroquin, betydeligt øget niveau af vesikler (* p = 0,0136) (blå overlay), hvilket indikerer autophagosome induktion og omsætning (flux) som reaktion på rapamycin.

vigtigt er, at induktion af autophagy i op til 48 timer i respons på lithium eller rapamycin alene, på en række koncentrationer, havde en begrænset effekt på levedygtighed som vurderet ved kolonidannelse assay (fig 1E). Nogle toksicitet med lithium er tydeligt over 20 mM. Tilsammen indikerer disse data, at begge forbindelser kan inducere relativt ugiftigt ophobning af autophagosomes i disse esophageal cancerceller.

Vurdering af virkningen af ​​rapamycin og lithium på kemosensitivitet

Vi derefter evalueret virkningerne kombinere rapamycin eller lithium med 5-FU på følsomheden af ​​esophageal cellelinier. Autophagy induktion med 5-FU i den KYSE450 celler er tidligere blevet demonstreret ved GFP-LC3, elektronmikroskopi, og western blot analyse af LC3II [4]. Autophagic flux, fremkaldt af 5-fluorouracil (5-FU) er også medtaget her, viser en forbedring af vesikel akkumulation med chloroquin (S1 Fig blå overlay).

KYSE450 celler blev behandlet med 30 mM lithiumchlorid, 300 nM rapamycin, 40 uM 5-FU eller en kombination af autophagy inducer og 5-FU i op til 48 timer. Lige antal levedygtige celler fra hver behandlingsgruppe blev podet følgende lægemiddelbehandling og inkuberet i op til to uger i fravær af lægemiddel. De kolonier, der udviklede er vist i fig 2A. Kolonier var sjældne i KYSE450 celler behandlet med kombinationen af ​​5-FU og lithium, med en 11,9 gange formindskelse i antallet af kolonier genoprettelse fra lithium 5-FU behandling sammenlignet med 5-FU alene (*** p = 0,001) [Fig 2A (i)]. I modsætning hertil tilsætning af rapamycin til 5-FU-behandlede celler forbedret deres evne til at komme sig, med en 2,3 gange stigning i antallet af regnskabsførende kolonier i rapamycin 5-FU-behandlede celler sammenlignet med 5-FU alene [Fig 2A (ii)].

KYSE450 celler blev behandlet med lithiumchlorid (lithium) (30 mM) eller rapamycin (300 nM) alene eller i kombination med 5-fluorouracil (5-FU) (40 uM) i 48 timer. (A) levedygtige celler efter behandling med enten lithium (i) eller rapamycin (ii) alene eller i kombination med 5-FU i 48 timer blev talt og lige numre reseeded i tre eksemplarer, i fravær af lægemiddel. Celler lodes vokse i 14 dage, derefter blev fikseret og farvet, og kolonier kvantificeret under anvendelse af Odyssey Infrared Imaging System (Li-COR). Data præsenteres grafisk som middelværdien +/- SEM for tre uafhængige forsøg.

Stjernerne

indikerer en signifikant forskel i antallet af kolonier dannet i kombination behandlede celler sammenlignet med enkeltstof behandlede celler (*** p 0,0005, ** p 0,005) (uparret

t

-test). (B) Morfologiske træk ved KYSE450 celler blev undersøgt efter behandling i 48 timer. Paneler til venstre viser morfologien induceret som reaktion på lithium eller rapamycin alene, paneler til højre viser morfologi med tilsætningen af ​​5-FU. Pile viser akkumuleringen af ​​autophagic vesikler i lithium, rapamycin, 5-FU og kombination behandlede celler. CD betegner tilstedeværelsen af ​​en ikke-apoptotisk celledød morfologi (forstørrelse 40x).

Morfologisk analyse afslørede, at mens lithium alene forårsagede en ophobning af cytoplasmatiske vesikler (venstre panel center, pile), var der en signifikant stigning i antallet af celler, som viser funktionerne af ikke-apoptotisk celledød (CD) i lithium 5-FU-behandlede celler (højre midterpanelet, CD). Rapamycin alene eller i kombination med 5-FU, forårsagede en ophobning af cytoplasmatiske vesikler (pile), som ikke var forbundet med udvikling af celledød morfologier (Fig 2B lavere paneler).

For at kontrollere, at denne virkning var hverken cellelinie eller 5-FU specifik, bekræftede vi det kemosensibiliserende virkning af lithium i en yderligere lægemiddelresistent /apoptose inkompetente esophageal cancer cellelinje (OE19) og i kombination med en yderligere kemoterapeutisk lægemiddel-cisplatin (S2 fig), som vi tidligere havde bekræftet at være en inducer af autofagi i disse celler [4]

Kollektivt, disse fund understrege, at selv om både lithium og rapamycin kan modulere autofagi, har de modstående aktivitet, når det kombineres med et kemoterapeutisk middel.; lithium virker som en kraftfuld chemosensitizer mens rapamycin er beskyttende.

Vi vurderede også virkningerne af kombinationsbehandlinger i apoptose kompetente esophageal cellelinjer. Det er vigtigt, at disse midler ikke ville interferere med apoptose og reducere lægemiddelfølsomhed. Kombinationen af ​​lithium eller rapamycin med 5-FU forbedret autofagi og apoptose i både OE21 (S3 Fig) og OE33 (data ikke vist) celler, som klart var tydeligt ved morfologi [S3A (i) S3B (i) Fig]. Begge kombinationsbehandlinger også reduceret levedygtighed som bestemt ved MTT assay [S3A (ii) S3B (ii) Fig].

er en række lithiumsalte bruges som humør-stabiliserende medicin, med lithiumcarbonat mest almindeligt ordineret på grund af lavere toksicitet. For at verificere, at virkningerne af lithium på autofagi og chemosensitization ikke var begrænset til lithiumchlorid, vi behandlede KYSE450 celler med en række lithiumkarbonat koncentrationer (10-20 mM). Data præsenteret i S4 Fig demonstrerer, at lithiumcarbonat induceret forøget ekspression af LC3 II på western blot (S4A Fig bane 2,3 og 4.). Immunofluorescens farvning for LC3 (s4b Fig center panel) indikerede også en slående ophobning af cytoplasmatiske vesikler ved koncentrationer så lave som 10 mM, med en fordeling mønster svarende til den observeret i lithium klorid behandlede celler (S4C Fig højre panel). Når det kombineres med 5-FU, lithiumcarbonat inducerede de samme celle død morfologier (CD, nederste højre paneler) som dem observeret i lithium chlorid behandlede celler. Vigtigere, lithiumcarbonat inducerer også lignende chemosensitization med 5-FU (40 uM) i KYSE450 celler, især ved de lavere koncentrationer på 10 og 15 mM (S4D Fig). Kollektivt disse resultater understreger den vigtige rolle, lithium-ion som autophagy modulator og dens tilknytning til forbedring af celledød i kombinationsbehandlingen.

Mekanisme af cytotoksicitet

Tidligere undersøgelser har antydet, at ændringer i autophagic flux, kan føre til en overdreven ophobning af autophagosomes vende autophagy til en destruktiv proces [16]. Vores indledende studier med Cyto-ID-analysen viste, at lithium påvirkede autophagosome omsætning (figur 1). Vi kiggede derfor til yderligere bevis på downstream forskelle i autophagosome behandling, der kan tegne sig for evnen af ​​lithium til chemosensitize esophageal celler.

Vi sammenlignede niveauet af flux i lithium og rapamycin behandlede celler ved hjælp fusionsproteinet (mCherry- GFP-LC3) i KYSE450 celler, kvantificere både grøn og rød fluorescens ved flowcytometri, med to separate lasere til at fjerne eventuelle kompensation krav.