PLoS ONE: Zic1 Promotor Hypermethylering i plasma-DNA er en potentiel biomarkør for mavekræft og intraepitelialneoplasi

Abstrakt

mavekræft (GC) er stadig en af ​​de mest almindelige fordøjelsesforstyrrelser kræftformer verdensplan; Men de fleste patienter præsentere på et fremskredent stadium ved første diagnosticering.

Zic1

er en ny kandidat tumorsuppressorgen der er epigenetisk tavshed i GC. I denne undersøgelse undersøgte vi

Zic1

promotor methylering i plasma-DNA som en ny molekylær markør for tidlig diagnose og overvågning af GC. Methyleringsspecifik polymerasekædereaktion (MSP) assay blev udført for at detektere

Zic1

promotor-methylering i plasma DNA fra 20 raske forsøgspersoner, 50 gastriske intraepitelialneoplasi patienter og 104 GC patienter.

Zic1

promotor methylering sats i plasmaprøver fra raske kontrolgruppe var 0%, men den nåede 54,0% i intraepithelial neoplasi gruppen og 60,6% i GC-gruppen. De sidstnævnte to værdier var signifikant højere end den, der findes i det sunde kontrolgruppen (p 0,05), med en 100% specificitet for intraepitelialneoplasi og GC diagnose. Den positive prædiktive værdi af plasma

Zic1

promotor methylering til diagnosticering af intraepitelialneoplasi og GC var 100%. Status for methylering i GC-gruppen var ikke signifikant associeret med tumorstørrelse, tumor differentiering, lymfeknudemetastase, TNM stadieinddeling eller tumorinvasion (p 0,05). Vurdering af betydningen af ​​påvisning af Karcinogenicitet-embryonale antigen (CEA) niveau og

Zic1

promotor methylering sats for GC diagnose afslørede, at følsomheden af ​​

Zic1

promotor methylering var signifikant højere end for CEA-niveau som en markør, og at den kombinerede målingen af ​​disse to indeks (parallel test) forbedret følsomhed. Tilsammen vores resultater tyder på, at

Zic1

promotor methylering sats i plasma-afledt DNA er af stor betydning for den tidlige screening af GC og overvågning af tumorigenese.

Zic1

promotor methylering kan tjene som en ny ikke-invasiv plasma biomarkør for tidlig påvisning af GC og for risikovurdering i højrisiko populationer. Den kombinerede måling af

Zic1

promotor methylering sats og CEA-niveau (parallel test) kan forstærke de nuværende retningslinjer for tidlig diagnosticering af GC

Henvisning:. Chen X, Lin Z, Xue M , Si J, Chen S (2015)

Zic1

Promotor Hypermethylering i plasma-DNA er en potentiel biomarkør for mavekræft og intraepitelialneoplasi. PLoS ONE 10 (7): e0133906. doi: 10,1371 /journal.pone.0133906

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Modtaget: April 10, 2015; Accepteret: 2 jul 2015; Udgivet: Juli 24, 2015

Copyright: © 2015 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (81302070, 81372623) (https://www.nsfc.gov.cn), Zhejiang Provincial Medicinsk og sundhed generelt forskningsplan (2014KYB121) (https://www.zjwst.gov.cn/), Zhejiang Provincial Department of Education forskningsplan (Y201327398) (https://www.zjedu.gov.cn), og Zhejiang-provinsen centrale videnskab og teknologi innovation team (2013TD13) (https://www.zjkjt.gov.cn/). Den bidragyder Shujie Chen udtænkt og designet eksperimenterne for dette håndskrift

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er en af ​​de mest almindelige fordøjelsesforstyrrelser kræftformer og den tredje hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. De fleste af GC patienter til stede på et fremskredent stadium ved første diagnose. Globalt GC tegner sig for næsten 952 tusind nye tilfælde årligt i henhold til Globocan 2012 [2]. I Japan, 5-årige overlevelsesrate for tidlig GC (EGC) er 86% sammenlignet med 32% for avancerede GC, som rapporteret af det amerikanske SEER-programmet [3].

Aberrant DNA methylering er en vigtig epigenetisk forandring og en tidlig begivenhed i carcinogenese [4]. For nylig, flere tumorsuppressorgener (GTS), herunder

FAM5C

,

MYLK

,

p16

E-cadherin

, er blevet rapporteret til at være methyleret i serum /plasma af GC patienter [5-7]. Desuden hypermethylering af GTS tendens til at blive forbedret med progressionen af ​​forstadier til kræft [8-9]. Derfor kan påvisningen af ​​methyleret DNA i serum /plasma være en lovende fremgangsmåde til tidlig diagnose af GC. Intraepitelialneoplasi (IN) er en potentielt præcancerøse læsion, som giver en høj risiko for GC; således, screening af IN patienter er afgørende for diagnosticering og forudsigelse af GC. Kun få rapporter om hypermethyleret DNA-analyser af blodprøver fra gastrisk intraepitelialneoplasi (GIN) patienter er tilgængelige til dato.

Voksende data viser, at

Zic1 Hotel (

Zic

familiemedlem 1 , ulige-parrede Drosophila homolog) deltager i udviklingen af ​​flere kræftformer [10-13]. Vi har tidligere opdaget, at

Zic1

, en hidtil ukendt TSG er tavshed via promotor hypermethylering i både GC celler og væv [14]. Vi har også påvist, at

Zic1

er involveret i hæmning af GC celle overlevelse og nedskrivninger på celle migration [15].

I den foreliggende undersøgelse, bestemte vi de tidlige diagnostiske og prædiktive potentialer

Zic1

hypermethylering i plasmaet hos GC patienter. Vi målte status promotor methylering af

Zic1

i plasma fra patienter med GC eller GIN og normal kontrol (NC) emner. Foreningen af ​​

Zic1

promotor methylering med klinisk-patologiske parametre blev også vurderet. Desuden har vi klassificeret høj kvalitet IN og T1 GC som EGC og placeret GC og gin patienter i et GC plus IN gruppe (GPI). Derefter analyserede vi den

Zic1

hypermethyleringsassocierede satser i både EGC og GPI grupper. Endvidere den kombinerede evaluering af Karcinogenicitet-embryonale antigen (CEA) niveau og

Zic1

promotor methylering til GC diagnose blev vurderet ved hjælp af plasma fra GC og gin patienter.

Materialer og metoder

Kliniske prøver

Plasmaprøver blev opnået præoperativt på Sir køre køre Shaw Hospital, Hangzhou, Zhejiang, Kina, fra november 2012 til april 2015. Alle patienterne indgår i vores undersøgelse gennemgik gastroendoscopy og blev grupperet ifølge histopatologi diagnose. Plasma prøver blev indsamlet fra GC og gin patienter, som var naive over for helbredende behandlinger, såsom kemoterapi, strålebehandling, og kirurgisk resektion. Udelukkelseskriterierne inkluderet gastrointestinale sygdomme med andre årsager og sygdomme i andre organer. Patienter med gastrisk metastaser fra andre tumorer blev også udelukket.

Vi nummererede prøverne i henhold til den rækkefølge, de blev indsamlet og derefter udførte methylering-specifik polymerasekædereaktion (MSP) til at vurdere prøverne i numerisk rækkefølge. Prøverne blev yderligere grupperet efter patologien resultater. Plasma prøver blev indsamlet fra 104 GC patienter med en gennemsnitsalder på 59,8 år, der blev diagnosticeret i henhold til World Health Organization kriterier [16]. Halvtreds GIN patienter med en gennemsnitsalder på 58,0 år blev diagnosticeret ved gastroskopi. Blodprøver blev også indsamlet fra 20 raske frivillige i NC-gruppen med en gennemsnitsalder på 38,5 år.

Etik erklæring

Vores projekt har modtaget godkendelse fra Clinical Research etiske komité for Institut for Gastroenterologi Zhejiang University. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient før prøvetagning. De personer, der deltog i denne undersøgelse gav skriftligt informeret samtykke (som beskrevet i

PLoS

samtykkeerklæring) til at offentliggøre disse case detaljer.

DNA isolation og bisulfit modifikation

DNA blev ekstraheret fra plasmaprøverne under anvendelse af en QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). DNA-koncentrationer blev målt ved spektroskopi ved en bølgelængde på 260 nm. DNA blev behandlet med bisulfit med en Zymo DNA Modification Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA). Det modificerede DNA blev opbevaret ved -20 ° C indtil brug.

MSP analyser

Zic1

promotor methylering blev undersøgt ved at udføre MSP under anvendelse af ovennævnte bisulfit-modificerede fri plasma-DNA som template. MSP blev udført i 40 cykler ved en annealing temperatur på 56 ° C som tidligere [14] beskrevne. De methylering-specifikke primere var ZIC1-MF (5′-GGATTTTTTGTTTCGTAATC) og ZIC1-MR (5′-CCCGTTAACCACGTTAAACG), og de ikke-methylerede-specifikke primere var ZIC1-UF (5′-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT) og ZIC1-UR (5′ CCCATTAACCACATTAAACA). PCR-proceduren omfattede indledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 30 s, annealing ved 56 ° C i 40 s, primerforlængelse ved 72 ° C i 40 s, og slutekstension ved 72 ° C i 7 min. PCR produkterne blev elektroforese på 1,5% agarosegeler, farvet med Gel Red, og visualiseret ved UV-belysning.

Serum CEA test

De serumprøver blev sendt til det kliniske laboratorium Sir køre køre Shaw Hospital til test, og en CEA koncentration af 5 ng /ml blev betragtet som unormal.

Statistiske analyser

methylering frekvenser og CEA-niveauer i plasmaprøverne blev sammenlignet under anvendelse af Fishers eksakte test. Sammenhængen mellem de klinisk-patologiske karakteristika og DNA hypermethylering blev analyseret ved hjælp af chi-square test. Den diagnostiske værdi af kombinationen af ​​

Zic1

promotor methylering og plasmaet CEA-niveau blev vurderet ifølge arealet under Receiver Operating karakteristiske kurve (AUC). Følsomhed, specificitet og positive og negative prædiktive værdier for patologisk diagnose blev beregnet med intervaller for

Zic1

promotor methylering eller

Zic1

promotor methylering kombineret med CEA på 95% sikkerhedsgrænser. Positive og negative sandsynlighedsforhold blev også beregnet. For alle de tests, en cut-off værdi af p 0,05 blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 19,0 software (SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultater

Methylering status i plasma

For at vurdere ændringer i

Zic1

promotor methylering i GC, vi først opdaget status methylering af denne promotor i 104 patienter med GC, 50 med gin, 31 med EGC og 20 nationale koordinatorer og udførte sammenligninger mellem grupperne. De methylering satserne for

Zic1

promotor i plasmaprøverne var 0% i NC-gruppen (0%), stigende til 54,0% i GIN gruppen og 60,6% i GC-gruppen (p 0,001 for både GIN og GC vs. NC), med 100% specificitet for GPI diagnose (20/20) (fig 1). De positive og negative prædiktive værdier og positive og negative sandsynligheden nøgletal for diagnosticering IN og GC var 100% (90/90), 23,8% (20/84), uendelig og 0,42 hhv. Repræsentant MSP analyseresultater for

Zic1

promotor methylering er vist i fig 2.

De procentdele af

Zic1

promotor methylering var 60,6% (63/104) i GC, 54,0% (27/50) i GIN, 54,8% (17/31) i EGC og 0,0% (0/20) i NC grupperne (*: p 0,001)

M: methylering primere; U:. Umethylerede-specifikke primere

Foreningen af ​​klinisk-patologiske funktioner med

Zic1

promotor methylering i plasmaet af GC patienter

Vi derefter korreleret de klinisk-patologiske træk med

Zic1

promotor methylering sats i plasmaet af GC patienter til at identificere eventuelle foreninger. Resultaterne viste ingen markante sammenhænge mellem

Zic1

promotor methylering sats og de kliniske parametre, herunder tumorstørrelse, differentiering kvalitet, lymfeknude status, tumor invasion dybde og TNM stadie (p 0,05) (tabel 1) .

kombineret bestemmelse af

Zic1

hypermethylering og CEA niveau

betydningen af ​​den kombinerede bestemmelse af

Zic1

hypermethylering sats og CEA niveau til diagnose og tidlig forudsigelse af GC blev analyseret. Vi målte CEA niveau i 9 NCS 24 GIN patienter og 71 GC patienter før behandling. De følsomhed CEA niveau i GC, IN, og EGC grupper var 22,5% (16/71), 16,7% (4/24) og 10,5% (2/19), hhv. I alle tre af grupperne, følsomheden af ​​

Zic1

promotor methylering var signifikant højere end for CEA-niveau (p 0,05).

Kombineret bestemmelse af

Zic1

hypermethylering og CEA-niveau i GC gruppe.

i GC-gruppen, følsomhed og specificitet af den kombinerede bestemmelse af

Zic1

promotor methylering sats og CEA niveau (tandem test) var 16,9 % og 90,9% (tabel 2). Følsomheden af ​​den kombinerede analyse af disse to parametre (parallel afprøvning) var 69,0% (tabel 2), der var højere end de følsomheder opnået ved afprøvning af enten parameter alene. ROC-kurve analyse blev udført for at vurdere betydningen af ​​methylering rate DNA og CEA-niveau for GC diagnose. AUC for

Zic1

promotor methylering test alene var 0,610 (S1 Fig), og at for den kombinerede vurdering af

Zic1

promotor methylering og CEA niveau (tandem test) var 0,539 (S2 Fig) . Især når

Zic1

promotor methylering og CEA-niveau blev analyseret parallelt, AUC steg til 0,633 (figur 3). Baseret på de ovenstående resultater den kombinerede bestemmelse af

Zic1

promotor methylering sats og CEA-niveau (parallel afprøvning) til GC diagnose viste sig at være synergistisk sammenlignet med anvendelsen af ​​hver metode alene.

En ROC-kurve for at vurdere betydningen af ​​den kombinerede detektering af de to parametre for GC diagnose.

kombineret bestemmelse af

Zic1

hypermethylering og CEA-niveau i GPI gruppe.

i GPI-gruppen, følsomhed og specificitet af den kombinerede bestemmelse af

Zic1

promotor methylering sats og CEA-niveau (tandem test) var 15,8% og 100,0%, henholdsvis (tabel 3) . Den kombinerede vurdering af disse to parametre (parallel afprøvning) havde den højeste følsomhed ved 65,3%, med en positiv prædiktiv værdi nåede 98,4% (tabel 3). ROC-kurve analyse blev udført for at vurdere betydningen af ​​methylering rate DNA og CEA-niveau for GPI diagnose. AUC for

Zic1

promotor methylering test alene var 0,792 (S3 Fig), og at for den kombinerede vurdering af

Zic1

promotor methylering sats og CEA niveau (parallel test) var 0,771 (Fig 4). Derfor påvisning af

Zic1

promotor methylering kan være et mere effektivt alternativ til GPI diagnose.

En ROC-kurve for at vurdere betydningen af ​​den kombinerede påvisning af disse to parametre for GPI diagnose.

diskussion

for nylig er der fundet adskillige gener, der skal methyleres i GC væv, herunder

E-cadherin

,

RASSF1A

,

p16

,

GSTP1

,

SOCS1

,

SFRP1

PTEN

[17]. Rapporterede methylering frekvenser har varieret fra 56% til 96% [17]. DNA methylering er også blevet observeret i blodprøver fra GC patienter. Der er fundet flere GTS skal methyleres i blodprøver fra GC patienter, herunder

p16

,

E-cadherin

, og

RAR

, med afsløring satser på 37% til 48%, henholdsvis [18-21].

Zic1

er afvigende nedreguleres i visse former for kræft, der indikerer dens funktion som GTS. Vores tidligere arbejde har vist, at

Zic1

promotor ofte methyleres i primære gastrisk karcinom væv, med en høj opdagelse sats på 94,6%, men ikke i normale gastrisk væv [14]. Vores resultater har afsløret, at

Zic1

er en roman kandidat TSG der nedreguleres via promotor hypermethylering i GC. Men til vores bedste overbevisning, har ingen undersøgelser undersøgt plasma

Zic1

promotor methylering i GC eller GIN.

I den foreliggende undersøgelse, vi først vist, at afvigende methylering af

Zic1

promotor kunne påvises i plasma fra GC og gin patienter ved frekvenser på 60,6% og 54,0%, henholdsvis, som var væsentligt højere end for NCS. Disse resultater er i overensstemmelse med de tidligere undersøgelser [14]. Fra et diagnostisk synspunkt

Zic1

promotor methylering udstillet høj specificitet for at diskriminere NCS fra GC og gin patienter (100%). Vores resultater viste også, at påvisning af

Zic1

promotor methylering sats havde en høj positiv prædiktiv værdi og en positiv sandsynlighed ratio og AUC for GC og GIN diagnose, hvilket tyder på, at

Zic1

promotor methylering vurdering har potentiel anvendelighed til diagnosticering og tidlig forudsigelse af GC.

Mange tidligere undersøgelser har fokuseret på perifert blod DNA methylering i GC i stedet GIN patienter, med kun en håndfuld undersøgelser, der fokuserer på DNA methylering i gin. Udviklingen af ​​endoskopiske teknikker har gjort det muligt for tilgængeligheden af ​​mere effektive og mindre invasive behandlinger for EGC og gin patienter. Samlet set screening for GIN bidrager til overvågningen af ​​GC og reduktion af GC dødsfald. Et interessant aspekt ved den foreliggende undersøgelse er, at vi demonstreret afvigende

Zic1

promotor-methylering i plasma fra GIN patienter, med en opdagelse sats, der var betydeligt højere end for NC individer (p 0,001). I fremtiden, afsløring af hypermethylering af

Zic1

promotor kan potentielt anvendes som et advarselssignal tidligt eller til at screene for GC i højrisikogrupper.

Vi har også evalueret

Zic1

promotor-methylering i plasma fra GC patienter i association med forskellige klinisk-patologiske parametre. Ingen statistisk blev observeret signifikante relationer mellem

Zic1

promotor methylering og de forskellige kliniske parametre, herunder tumor størrelse, differentiering kvalitet, lymfeknude status, tumor invasion dybde og TNM stadie; men i vores tidligere undersøgelse [15]

Zic1

methylering er fundet, at være involveret i GC invasiv. I den foreliggende undersøgelse blev de fleste af de GC patienter diagnosticeres og behandles på et tidligt tidspunkt, hvilket kan have indflydelse på de endelige resultater. Validering i en større population kan give indsigt i disse forskellige resultater. Hvorvidt der findes en sammenhæng mellem afvigende

Zic1

promotor methylering og GC kliniske karakteristika kræver en afklaring af yderligere analyse.

CEA er en klassisk tumor markør, der er almindeligt vurderes i klinikken. Denne markør anses for at være den hyppigst forekommer i sene GC patienter; imidlertid har mange undersøgelser indikerede, at DNA-methylering kan detekteres begynder i de tidlige stadier af GC. I vores nuværende undersøgelse blev en ROC-kurve genereret at vurdere betydningen af ​​den kombinerede påvisning af

Zic1

promotor methylering sats og CEA-niveau (parallel test) til diagnosticering af GC, afslører, at deres kombinerede afsløring produceret mere signifikante resultater end påvisningen af ​​enten parameter alene. Derfor foreslår vi, at den samlede måling af

Zic1

promotor methylering sats og CEA-niveau kan øge diagnosen GC.

Som konklusion har vores resultater viste, at målingen af ​​

Zic1

promotor methylering i plasma-afledt DNA er af betydning for tidlig påvisning af GC og for risikovurdering i højrisiko populationer. Den kombinerede måling af

Zic1

promotor methylering sats og CEA-niveau (parallel test) kan forstærke de nuværende retningslinjer for tidlig diagnosticering af GC; imidlertid yderligere undersøgelser med større stikprøvestørrelser og klinisk validering påkrævet.

Støtte Information

S1 Fig. Påvisning af

Zic1

promotor methylering i gastrisk cancer (GC) plasmaprøver.

En ROC-kurve for at vurdere betydningen af ​​

Zic1

promotor methylering test for GC diagnose.

Doi : 10,1371 /journal.pone.0133906.s001

(TIF)

S2 fig. Kombineret påvisning af

Zic1

promotor methylering og CEA-niveau (tandem afprøvning) i gastrisk cancer (GC) plasmaprøver.

Et ROC-kurve for at vurdere betydningen af ​​den kombinerede detektering af de to parametre (tandem test .) til GC diagnose

doi: 10,1371 /journal.pone.0133906.s002

(TIF)

S3 fig. Påvisning af

Zic1

promotor methylering i gastrisk intraepitelialneoplasi (GPI) plasmaprøver.

En ROC-kurve for at vurdere betydningen af ​​

Zic1

promotor methylering test for GPI diagnose.

doi: 10,1371 /journal.pone.0133906.s003

(TIF)