PLoS ONE: MAML1 Acts kooperativt med EGR1 at aktivere EGR1-Reguleret Initiativtagere: Konsekvenser for Nephrogenesis og udvikling af Renal Cancer

Abstrakt

Mastermind-lignende 1 (MAML1) er en transkriptionel coregulator af aktivatorer i forskellige signalering veje, såsom Notch, p53, myocyt forstærker faktor 2C (MEF2C) og beta-catenin. I tidligere undersøgelser, viste vi, at MAML1 forbedret p300 acetyltransferase aktivitet, hvilket har øget acetylering af Notch af p300. I denne undersøgelse viser vi, at MAML1 kraftigt induceret acetylering af transkriptionsfaktoren tidlig vækst respons-1 (EGR1) ved p300, og øget EGR1 proteinekspression i embryoniske nyreceller.

EGR1

mRNA-transkripter blev også opreguleret i tilstedeværelse af MAML1. Vi viser, at MAML1 fysisk interageret med, og handlede samvirkende med EGR1 at øge transkriptionel aktivitet af EGR1 og p300 promotorer, som begge indeholder EGR1 bindingssteder. Bioinformatik vurdering afslørede en sammenhæng mellem

p300

,

EGR1

MAML1

kopi nummer og mRNA ændringer i renal klar celle karcinom og

p300

,

EGR1

MAML1

genændringer var forbundet med øget samlet overlevelse. Vores resultater tyder MAML1 kan være en komponent af de transkriptionelle netværk, der regulerer EGR1 målgener under nephrogenesis og kunne også have konsekvenser for udviklingen af ​​renalcellecarcinom

Henvisning:. Hansson ML, Behmer S, Ceder R, Mohammadi S, Preta G, Grafström RC, et al. (2012) MAML1 Acts samarbejdsvilligt med EGR1 at aktivere EGR1-Reguleret Initiativtagere: Konsekvenser for Nephrogenesis og udvikling af nyrekræft. PLoS ONE 7 (9): e46001. doi: 10,1371 /journal.pone.0046001

Redaktør: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile

Modtaget: April 23, 2012; Accepteret: August 27, 2012; Udgivet: 27. september 2012 |

Copyright: © Hansson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne modtaget støtte fra det svenske Forskningsråd, svensk Kræftens Bekæmpelse og den svenske Børnenes Cancer Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mastermind-lignende 1 (MAML1) er den humane homolog af

Drosophila

mastermind, en neurogen gen er genetisk forbundet med Notch funktion [1], [2]. Notch signalvej spiller en vigtig rolle i mange udviklingsmæssige processer ved at påvirke cellulær proliferation, differentiering og apoptose. I kernen, den Notch intracellulære domæne (Notch ICD) associerer med transkriptionsfaktoren CSL (også kendt som RBP-Jk eller CBF1 hos hvirveldyr, undertrykker af hårløs i

Drosophila

Lag-1 i

C . elegans

), når det er bundet til DNA, og coactivatorer såsom PCAF [3], GCN5 [3], p300 [4] og MAML1 [1], [2] rekrutteres til at aktivere ekspression af Notch målgener . For nylig MAML1 har vist sig at fungere som en co-aktivator til transkriptionsfaktorer, der er involveret i en række forskellige Notch-uafhængige signalveje, herunder myocyt enhancer faktor 2C (MEF2C) [5], p53 [6] og beta-catenin [7], og N-terminalen af ​​MAML1 er vigtige for disse interaktioner. Disse resultater tyder på, at MAML1 fungerer som en co-aktivator i diverse cellulære processer og kan være en formidler af krydstale mellem forskellige signalveje. MAML1 kan også påvirke forskellige signalveje ved at interagere med p300, et almindeligt anvendt coaktivator. Vi og andre forskere har tidligere rapporteret, at MAML1 medierer Notch ICD-medieret transkription in vivo, og kan også danne chromatin skabeloner in vitro, ved at rekruttere p300 til en DNA-CSL-Notch kompleks [8], [9], [10]. Vi har for nylig rapporteret, at MAML1 forbedrer p300 autoacetylation, histonacetyltransferase (HAT) aktivitet og coaktivator funktion [11]. Vi fandt også, at p300 acetylerer den Notch1 ICD i cellekultur assays og

in vitro

, og at regioner, der ligger inden for de Notch C-terminalen er afgørende for Notch acetylering. MAML1 og CSL, komponenter af Notch transkriptionskomplekset, kraftigt forbedre Notch acetylering og vi foreslog, at MAML1 øger Notch acetylering ved potensering p300 autoacetylation [12]. p300 kan også acetylere MAML1, men effekten af ​​denne posttranslationelle modifikation på funktionen af ​​MAML1 er i øjeblikket ukendt. MAML1 er et phosphoprotein, og vi tidligere identificeret GSK3ß som en kinase ansvarlig for phosphorylering af MAML1

in vitro

[13]. Den aktive form af GSK3ß direkte interagerer med N-terminalen af ​​MAML1 at inhibere MAML1 transkriptionelle aktivitet [13]. Derudover MAML1 N-terminus er underlagt SUMOylation, som også undertrykker den transkriptionelle aktivitet af MAML1 [14].

transskriptionsfaktoren tidlig vækst respons-1 (EGR1) udtrykkes som svar på forskellige ekstracellulære signaler , såsom vækstfaktorer, cytokiner, bestråling og forskellige former for stress. I mange normale celler, vækstfaktorstimulering inducerer hurtigt ekspression af EGR1, som efterfølgende fører til aktivering af downstream vækst pathways [15]. Imidlertid kan EGR1 også undertrykke væksten ved overekspression i transformerede celler i flere eksperimentelle systemer [16]. Den cellulære respons på EGR1 med hensyn til apoptose varierer: EGR1 kan inducere apoptose ved at stimulere enten p53 eller PTEN; imidlertid kan EGR1 også fremme overlevelse i visse celletyper ved at modvirke p53-afhængig apoptose [17]. EGR1 spiller en vigtig rolle som tumorsuppressor i bryst-, hjerne- og lungecancer som EGR1 er dårligt udtrykt i disse væv og virker som et suppressor af vækst og transformation ved overekspression [16]. Til gengæld synes ekspression af EGR1 skal holdes i en høj andel af prostata og nyre kræft, hvor det fremmer væksten. EGR1 er fraværende eller udtrykkes i lave niveauer i normale prostatavæv; mens EGR1 promotoren reguleres af en positiv spiral mellem EGR1 og vækstfaktorer i prostatacancerceller, hvilket resulterer i konstitutiv vækst. Prostatacancer væv udtrykker også høje niveauer af p300, hvilket fører til konstitutivt høje niveauer af stabil acetyleret EGR1 protein, som er en vigtig komponent i transformation og progression af denne sygdom [18]. Niveauerne af EGR1 øges med graden af ​​malignitet i prostatacancer, som angivet ved Gleason tumor score [15]. Evnen til at reducere EGR1 udtryk kan give en effektiv klinisk behandling for prostatakræft, som nedregulering af EGR1 kan reducere vækstfaktor induktion og positiv feedback til EGF1 promotoren.

EGR1 har været impliceret som en vigtig faktor i nephrogenesis og udviklingen af ​​nyrecancer. Under embryogenese, er EGR1 udtrykt i næsten alle prolifererende celler, herunder metanephric blastems; er det imidlertid normalt nedreguleres under renal udvikling [19]. Ekspression af EGR1 er også forhøjet i mange Wilms ‘tumorer sammenlignet med normale nyrevæv. Wilms ‘tumor er en pædiatrisk malignitet i nyren, som ofte er af embryonal oprindelse [20]. Overekspression af EGR1 er blevet rapporteret at øge proliferation, forbedre tumorvækst og antagoniserer virkningerne af tumor suppressor Wilms tumor 1 (WT1) i baby rottenyreceller [21]. Renalcellekarcinom (RCC) er den mest almindelige nyrekræft hos voksne, der tegner sig for 80-85% af de primære nyre malignances. Ryd celle (konventionel) RCC og renal papillær celle karcinom er de mest og næstmest hyppige typer af RCC hhv. Strefford og kolleger rapporterede, at kromosom 5 blev overrepræsenteret og omstruktureret i en betydelig del af 19 renale celle karcinom cellelinjer, med de gener, der koder for

EGR1

(5q31.1) og

CSF1R

(koloni stimulerende faktor 1 receptor) (5q33-Q35) hyppigst ændret på kromosom 5, yderligere underbygger en rolle for EGR1 i nyrekræft [22]. I en tidligere undersøgelse, rapporterede vi, at MAML1 øget p300 autoacetylation og p300 acetylering aktivitet i embryonale nyre (HEK293) celler [11]. Formålet med dette studie var at undersøge, om MAML1 og p300 regulere niveauerne af EGR1 i nyreceller.

Materialer og metoder

plasmider

pcDNA3,1-flag- EGR1 og pGL3-p300 blev indkøbt fra Addgene (Cambridge, MA, USA). Plasmidet 4xEBS1-luc var en slags gave fra Dr. G. Thiel (University of Saarland Medical Center, Homburg, Tyskland) og pGL3-EGR1 var generøst tilvejebragt af Dr. T. E. Eling (National Institute of Environmental Health Sciences, NC, USA). pcDNA3.1-FLAG-MAML1 (1-1016), (1-625) og CMV-p300-HA har tidligere [11] blevet beskrevet. CDNA kodende MAML1 (1-127) og (75-1016) blev amplificeret ved PCR og subklonet ind i ekspressionsvektoren FLAG-pcDNA3.1. Salg

Cellelinjer

MAML1 cellelinier blev konstrueres ved at transficere humane embryoniske nyre (HEK) -293 celler med vektorerne pcDNA3.1-FLAG-MAML1 eller pcDNA3.1-MAML1 og stabile kloner blev selekteret med geneticin [11].

siRNA transfektion

HEK-293-celler blev transient transficeret med 100 nM MAML1 siRNA (forhåndsudformede MAML1 SMARTpool sæt af 4 siRNAs, Dharmacon) eller kontrollere siRNA hjælp DharmaFECT 1 siRNA reagenser (Dharmacon, Lafayette Colorado, USA) og dyrket i nærvær eller fravær af 50 ng /ml TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat) (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA).

reportergenassay

HEK-293 celler i 24 Tja plader blev transient transficeret under anvendelse transit-LT1 reagent (Mirus, Madison, WI, USA) med 200 ng reporterplasmid-DNA og 150 ng EGR1 eller MAML1 ekspressionsvektor DNA, som angivet i figurerne. Cellerne blev lyseret i Reporter Lysis buffer (Promega, Madison, WI, USA) efter 24 timer og luciferaseaktiviteten blev målt ved anvendelse LucySoft3. Dataene er angivet som middelværdierne for mindst tre uafhængige forsøg.

Real-time PCR

Totalt RNA blev oprenset under anvendelse af RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge den producentens protokol og cDNA blev syntetiseret under anvendelse af Superscript III første-streng syntese systemet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Real-time PCR blev udført under anvendelse af Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) på et Applied Biosystems 7500 Sequence detektor anvendelse af følgende primere sæt:

EGR1

fremad, 5′-TACGAGCACCTGACCGCAG- 3 «

omvendt, 5′-CACCAGCACCTTCTCGTTGTT-3 ‘;

18S rRNA fremad, 5′-CCTGCGGCTTTAATTTGACTCA-3′;

omvendt, 5′-AGCTATCAATCTGTCAATCCTGTC- 3 ‘.

EGR1

mRNA-ekspression blev normaliseret til 18S rRNA i hver prøve.

In vivo

acetylering assay

HEK -293 celler blev transient transficeret med pcDNA3.1-FLAG-EGR1, pcDNA3.1-MAML1 og CMV-p300-HA ved hjælp transit-LT1 transfektionsreagens (Mirus, Madison, WI, USA). Efter 24 timer blev cellerne behandlet med 10 mM natriumbutyrat. Cellerne blev høstet 40 timer efter transfektion, lyseret i lysisbuffer (50 mM Tris-HCI pH 8, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 og komplet EDTA-fri proteaseinhibitor Pierce). Immunpræcipitation af FLAG-EGR1 blev udført ved hjælp af M2-agarose, der genkender FLAG epitop. Indgangs- og immunopræcipitation (IP) prøver blev analyseret ved Western blotting under anvendelse af følgende antistoffer: EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), de acetylerede lysiner i EGR1 (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA), p300 (Santa Cruz Bioteknologi, CA, USA), MAML1 (Bethyl Laboratories, Cambridge, Storbritannien,. Millipore, Billerica, MA, USA) og acetyleret p300 lysin 1499 (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA)

Køben- immunoprecipitation

helcellelysater fra HEK-293-celler blev præ-blokerede og endogent MAML1 blev immunpræcipiteret under anvendelse af et MAML1 antistof (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Input og IP prøver blev analyseret ved Western blot ved hjælp af følgende antistoffer:. MAML1 (Bethyl laboratorier, Cambridge, Storbritannien) og EGR1 (Santa Cruz Bioteknologi, Californien, USA)

Immunfarvning

HCT116-celler blev transficeret med pcDNA3-FLAG-EGR1 og pcDNA3.1-MAML1 hjælp transit-LT1 transfektionsreagens (Mirus, Madison, WI, USA), inkuberet i 24 timer, vaskes med PBS, fikseret med 4% paraformaldehyd og permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Cellerne blev immunfarvet ved anvendelse af FLAG (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) og MAML1 (Millipore, Billerica, MA, USA) antistoffer, og analyseres med en Leica konfokal mikroskopi (Leica Microsystems, Wetzler, Tyskland).

GST pull-down assay

HEK293-celler blev transficeret med pcDNA3.1-FLAG-EGR1 hjælp transit-LT1 transfektionsreagens og dyrket i 2 timer med 50 ng /ml TPA 24 timer efter transfektion . Helcellelysater blev fremstillet, og 100 pi alikvoter af proteinekstrakt i lysispuffer (50 mM Tris-HCI pH 8, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM DTT og 1 × komplet EDTA-fri proteaseinhibitor cocktail) var inkuberet med GST-proteiner (fremstillet som beskrevet i [14]) bundet til glutathion Sepharose 4B perler (GE Healthcare, Little Chalford, Storbritannien) i BC-150-buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCI, 10% glycerol ) natten over ved 4 ° C. Efter vask med BC-150 puffer, blev de bundne proteiner elueret i SDS-PAGE loading buffer (1 M Tris-HCI pH 6,8, 50% glycerol, 10% SDS, 1% bromphenolblåt, 1 mM DTT), adskilt ved hjælp 7,5% SDS-polyacrylamidgeler, overført til PVDF-membraner (GE Healthcare, Little Chalford, Storbritannien) og inkuberet med et antistof, der genkender EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).

Protein stabilitet assay

HEK-293 FLAG-MAML1 og HEK-293-kontrolceller blev dyrket i 24-brønds plader og behandlet med 50 ng /ml TPA i 2 timer og 50 ug /ml cyclohexamid (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) i 1 time. Cellerne blev høstet i lysispuffer (50 mM Tris-HCI pH 8, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 og komplet EDTA-fri proteaseinhibitor cocktail) blev proteinerne separeret under anvendelse af SDS-PAGE og underkastet immunoblotting under anvendelse af et antistof, der genkender EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Intensiteten af ​​båndene blev kvantificeret med Image J (rsb.info.nih.gov/ij/index.html).

Bioinformatik analyse af

MAML1, EGR1

p300

Angivelse af

MAML1

,

EGR1

p300

blev analyseret i tumorprøver fra 20 forskellige undersøgelser kræft ved hjælp af webbaserede cBio Cancer Genomics Portal (https://www.cbioportal.org/, sidst adgang 07/26/12), herunder genomics data, f.eks DNA kopital data fra 5134 prøver (matrix-komparativ genomisk hybridisering) og mRNA udtryk data fra 2430 prøver ( RNA-sekventering). Formodede kopi nummer ændringer såsom amplificeringer og homozygote sletninger blev afledt i portalen ved hjælp af “genomisk identifikation af væsentlige mål i kræft” algoritme [23]. De mRNA ekspression ændringer blev betragtet som signifikante, hvis prøver viste en Z-score ≥2 forhold til referencen befolkning (diploide tumorer eller normale tilstødende væv hvis relevant). Foreningen af ​​ændret genekspression med samlede overlevelse blev vurderet i udvalgte undersøgelser kræft ved hjælp af Kaplan-Meier analyse. Patientprøverne blev inddelt i to grupper baseret på “gensæt ændret” eller “gensæt ikke ændret” ved hjælp af udvalgte genomics data, og signifikant overlevelse forskelle mellem grupperne blev bestemt ved anvendelse af log-rank test;

s

-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater og Diskussion

MAML1 regulerer EGR1 mRNA og protein-ekspression

EGR1 protein stabilitet har været. rapporteret at være stabiliseret af p300 acetylering, hvilket resulterer i transaktivering af overlevelse gener [18]. Som vi tidligere fundet, at MAML1 øger p300 autoacetylation, som udvidede acetylering aktivitet af p300 [11], vi satte os for at undersøge, om EGR1 ekspressionsniveauerne kunne være forhøjet ved MAML1. Først, transficerede vi embryoniske nyre (HEK-293) celler med

MAML1

siRNA eller kontrol (Ctrl) siRNA og dyrket cellerne i nærvær af TPA for at inducere ekspression af EGR1. Proteinerne blev detekteret ved immunoblotting med antistoffer, der genkender MAML1, EGR1 og GAPDH. Ekspression af EGR1 blev induceret i celler dyrket med TPA (figur 1A, bane 3 og 4); henviser niveauerne af EGR1 blev reduceret i celler behandlet med

MAML1

siRNA (bane 4), sammenlignet med celler behandlet med kontrol siRNA (bane 3). Næste fremstillede vi helcelleekstrakter fra HEK-293-celler, der stabilt udtrykker MAML1 og kontrol HEK-293-celler, efter at inducere ekspression af EGR1 med TPA. Proteinerne blev detekteret ved immunoblotting med antistoffer, der genkender MAML1, EGR1 og GAPDH. Som vist i figur 1B, blev EGR1 induceret af TPA (bane 2 og 4) og ekspressionen af ​​EGR1 signifikant forøget i celler, der overudtrykker MAML1 (bane 4). Dernæst undersøgte vi, om MAML1 påvirket

EGR1

mRNA-niveauer. HEK-293-celler blev transficeret med

MAML1

siRNA eller kontrol siRNA, dyrket med TPA i 2 timer, og

EGR1

mRNA-ekspression blev analyseret ved real-time RT-PCR. Transfektion af HEK-293-celler med

MAML1

siRNA reduceret signifikant ekspressionen af ​​

EGR1

mRNA, sammenlignet med celler transficeret med kontrol siRNA (figur 1C). Efter aftale med denne observation,

EGR1

mRNA steg i MAML1-udtrykkende cellelinie efter induktion med TPA, i forhold til at styre HEK-293-celler (Figur 1D). , Foreslog således vores data, at MAML1 kan være involveret i reguleringen af ​​EGR1 mRNA og protein-ekspression i embryonale nyreceller.

(A) HEK-293 celler blev transficeret med

MAML1

siRNA eller kontrol (Ctrl) siRNA og dyrket i nærvær af TPA for at inducere ekspression af EGR1. Proteiner blev påvist ved immunoblotting under anvendelse af antistoffer, der genkender MAML1, EGR1 og GAPDH. (B) hele celleekstrakter blev fremstillet fra celler, der udtrykker MAML1 og kontrol HEK-293-celler dyrket med TPA. Proteiner blev påvist ved immunoblotting under anvendelse af de angivne antistoffer. (C) HEK-293-celler blev transficeret med

MAML1

siRNA eller kontrol siRNA, dyrket med TPA; derefter

EGR1

mRNA-ekspression blev analyseret ved real-time PCR. (D) HEK-293 kontrolceller og HEK-293-celler der stabilt udtrykker FLAG-MAML1 dyrket med TPA; derefter

EGR1

mRNA-ekspression blev analyseret ved real time PCR. Dataene præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse af middelværdien (SEM) og udtrykt i forhold til

EGR1

niveauer i kontrol HEK-293 celler dyrket i fravær af TPA.

EGR1 har en særskilt spatio-temporale udtryk mønster under nephrogenesis [19], og forstyrrelser i reguleringen af ​​EGR1 proteinekspression kan føre til uønskede virkninger på normal celle skæbne. Overekspression af EGR1 er blevet rapporteret at forøge proliferationen af ​​nyreceller og forbedre tumorigenese [21]. Derfor proteiner påvirker ekspressionen af ​​EGR1, såsom MAML1, i sidste ende kan være forbundet til EGR1 signalvejen, som bestemmer celleskæbne.

MAML1 fysisk interagerer med EGR1

Derefter undersøgte vi, hvorvidt MAML1 kunne inducere ekspression af et EGR1 target-promotor, ved at transficere 4xEBS-luc reporter indeholdende fire EGR1 bindingssteder i celler, der udtrykker FLAG-MAML1 og kontrolmaterialer HEK-293-celler, og dyrkning af cellerne med TPA. Reporter aktivitet øges, når EGR1 blev induceret i kontrol- celler under anvendelse TPA; imidlertid blev reporter aktiviteten forøget næsten tre gange i FLAG-MAML1 celler dyrket med TPA, sammenlignet med kontrolceller dyrket med TPA (figur 2A). Desuden blev HEK-293-celler co-transficeret med 4xEBS-Luc og vektorer, der udtrykker EGR1 og /eller MAML1. Mens både EGR1 og MAML1 øgede aktiviteten af ​​EGR1 promotor; sammen EGR1 og MAML1 synergistisk inducerede en 500 gange forøgelse i aktiviteten af ​​EGR1 target-promotoren (figur 2B). Således er vores data tyder MAML1 ansættes til promotorer, der reguleres af EGR1, at øge ekspressionen af ​​generne reguleres af EGR1.

(A) FLAG-MAML1 udtrykkende celler og HEK-293-kontrolceller blev transficeret med en luciferase reporter indeholdende fire EGR1 bindingssteder (4xEBS-Luc) og dyrket med TPA at inducere ekspression af EGR1. Dataene er angivet som middelværdi ± SD. (B) HEK-293-celler blev co-transficeret med 4xEBS-Luc og vektorer, der udtrykker EGR1 og MAML1. (C) Whole-celleekstrakter blev fremstillet fra HEK-293-celler og MAML1 protein blev immunpræcipiteret under anvendelse af et antistof, der genkender MAML1. Proteinerne blev separeret ved SDS-PAGE og analyseret ved Western blotting under anvendelse af antistoffer, der genkender MAML1 og EGR1. (D) vektorer, der udtrykker FLAG-EGR1 og MAML1 blev co-transfekteret ind HCT116 celler; efter 24 timer blev cellerne immunfarvet ved anvendelse af de viste antistoffer og analyseret ved konfokal mikroskopi med 100 × olie linse.

For at belyse, om MAML1 interagerer med EGR1 blev helcelleekstrakterne fremstillet ud fra HEK-293-celler og MAML1 blev immunpræcipiteret under anvendelse af et antistof, der genkender MAML1. Proteinerne blev separeret ved SDS-PAGE og Western blotting blev udført under anvendelse af antistoffer, der genkender MAML1 og EGR1. Som vist i figur 2C, MAML1 og EGR1 interageret i de cellulære ekstrakter (bane 3). For at bestemme om EGR1 colocalized med MAML1, HCT116 celler blev co-transficeret med FLAG-EGR1 og MAML1 vektorer og immunfarvet med antistoffer, der genkender FLAG og MAML1. EGR1 og MAML1 var stærkt colocalized i kernen (figur 2D). Vi bemærkede, at ekspressionsmønsteret for EGR1 i kernen ændret i nærvær af MAML1. Vi, og andre, der tidligere har rapporteret, at MAML1 colocalize MAML1-interagerende proteiner til nukleare organer [24]. Vore data antyder, at EGR1 og MAML1 kan udgøre en del af en transkriptionsenhancer kompleks, som kan forøge ekspressionen af ​​gener med EGR1 bindingssteder. Både MAML1 og EGR1 er endogent udtrykt i embryoniske nyreceller, og begge disse transkriptionsfaktorer er blevet vist at regulere genekspression under udviklingsmæssige processer [25], [26]; men det er endnu ikke klarlagt, om MAML1 og EGR1 samarbejder om at regulere nogle af disse gener.

MAML1 og EGR1 synergistisk aktivere p300 promotor

p300 promotor er blevet rapporteret at indeholde EGR1 bindingssteder og at være reguleret af EGR1 [18]. Derfor samarbejder vi transficerede HEK-293-celler med et p300-luc reporter og vektorer, der udtrykker EGR1 og MAML1, og derefter dyrkes cellerne i nærvær af TPA. EGR1 alene aktiveret p300-luc reporter i nærvær af TPA, og co-transfektion af MAML1 med EGR1 stærkt forøget aktiviteten af ​​p300 reporter (figur 3A). Vi antager, at MAML1 kan regulere ekspressionen af ​​p300, samt acetyleringen aktivitet af p300 [11]. Lysater blev fremstillet ud fra et FLAG-MAML1 cellelinie og HEK-293-kontrolceller, og niveauerne af p300 blev analyseret ved Western blotting under anvendelse af et antistof, der genkender p300. Ekspressionen af ​​p300 steg i MAML1-udtrykkende cellelinie sammenlignet med kontrolceller (figur 3B, sammenlign bane 2); henviser ekspressionsniveauet af GAPDH, som ikke er en MAML1 mål, var ens i begge cellelinier (bane 1 og 2).

(A) HEK-293-celler blev co-transficeret med et p300-luc reporter , EGR1 og MAML1, derefter dyrket i nærvær af TPA for at inducere ekspression af EGR1. Dataene er angivet som middelværdi ± SD. (B) hele celleekstrakter blev fremstillet fra FLAG-MAML1 transficerede og kontrol HEK-293-celler (Ctrl) og MAML1, p300 og GAPDH blev påvist ved Western blotting. (C) Whole-celleekstrakter blev fremstillet fra HEK-293-celler transficeret med vektorer, der udtrykker FLAG-EGR, MAML1 og p300; FLAG-EGR1 blev immunpræcipiteret under anvendelse af et antistof, der genkender FLAG-epitopen. Proteinerne blev separeret ved SDS-PAGE og påvist ved Western blotting under anvendelse af antistoffer, der genkender EGR1, acetylerede lysiner i EGR1, MAML1, p300 og acetyleret lysine1499 af p300. (D) HEK-293-celler der stabilt udtrykker FLAG-MAML1 og HEK-293-kontrolceller blev dyrket med TPA (2 timer) i nærvær eller fravær af cyclohexamid (1) og EGR1 proteinekspression blev analyseret ved Western blotting under anvendelse af et antistof, der genkender EGR1 . I grafen er EGR1 proteinekspression i MAML1 stabil cellelinie udtrykt i forhold til kontrolceller behandlet med cyclohexamid. Forholdet mellem båndintensiteter før tilsætning af cycloheximid og efter 1 h behandling med cycloheximid blev bestemt med Image J.

EGR1 er et substrat for acetylering af p300 [18], og vi har tidligere vist at MAML1 regulerer p300 aktivitet ved at øge p300 autoacetylation [11]. Derfor har vi undersøgt, om MAML1 regulerer p300-afhængige acetylering af EGR1. Helcelle-ekstrakter blev fremstillet ud fra HEK-293-celler og EGR1 blev immunpræcipiteret under anvendelse af et antistof, der genkender EGR1. Proteinerne blev separeret ved SDS-PAGE og Western blotting blev udført under anvendelse af antistoffer, der genkender EGR1, de acetylerede lysiner i EGR1, MAML1, p300 og acetyleret lysin ved 1499 af p300 (en markør for p300 autoacetylation). Vi bemærkede, at ekspression af EGR1 steg i nærværelse af co-udtrykkes MAML1 og /eller p300 (figur 3C, sammenlign bane 1 til bane 2-4). Men vi kun fundet acetyleret EGR1 i nærvær af co-udtrykte p300 (bane 3 og 4), der er steget stærkt i nærvær af MAML1 (bane 4). Den forøgede ekspression af EGR1 protein i nærvær af co-udtrykkes MAML1 (bane 2) kan skyldes MAML1-afhængig opregulering af EGR1 mRNA (se figur 1). Efter aftale med vores tidligere observationer, blev p300 autoacetylation steget betydeligt ved MAML1 (sammenlign spor 3 og 4). Således har vi formoder, at autoacetylated p300 acetylerer EGR1 mere effektivt.

Talrige rapporter har beskrevet, hvordan acetylering kan øge protein stabilitet [27]. Derfor inducerede vi ekspression af EGR1 hjælp TPA i celler, der stabilt udtrykker MAML1 og HEK-293-kontrolceller. Efter 1 times inkubering med cyclohexamid, betydeligt mere EGR1 protein var til stede i MAML1-udtrykkende cellelinie sammenlignet med kontrolceller (Figur 3D). Vi foreslår derfor, at MAML1 kan være involveret i regulering af stabiliteten af ​​EGR1, eventuelt ved at øge acetylering af EGR1. Acetylering af EGR1 af p300 er blevet rapporteret at øge proteinniveauer af EGR1, at stimulere ekspression af vækst- og overlevelsescelle gener, såsom FGF2, PDGFB, TGFB1 og IGF2 og dermed spiller en afgørende rolle i prostatacancer [15], [18 ]. Som EGR1 udtrykkes i høje niveauer i prostatacancer og også visse nyre- cancere [21], [22], står det tilbage at blive undersøgt, om p300-afhængig acetylering af EGR1 påvirker ekspressionen af ​​EGR1 målgener eller spiller en rolle i udviklingen af nyrekræft.

N-terminalen af ​​MAML1 samarbejder med EGR1 under transkriptionsaktivering

MAML1 protein indeholder forskellige domæner, som er vigtige for protein interaktioner og funktionen af ​​MAML1 (se skematisk i figur 4A). Aminosyrer 1-74 af MAML1 interagere med Notch ICD og MEF2C, mens aminosyrer 75-305 er vigtige for interaktionen med p300. Den N-terminale domæne af MAML1 interagerer også med p53 og GSK3ß [24]. For at undersøge hvilke MAML1 domæne er påkrævet for aktivering af promotorer, der reguleres af EGR1, plasmider, der udtrykker EGR1 og forskellige MAML1 domæner blev co-transficeret med 4xEBS-luc reporter, som indeholder fire EGR1 bindingssteder, i HEK-293-celler. Som vist i figur 4B, MAML1 (1-1016) og (75-1016) stærkt forbedret luciferasereportergen aktivitet i nærvær af EGR1, mens MAML1 (1-625) havde ingen påviselig virkning på EGR1-promotor aktivering. MAML1 (1-1016) og (75-1016) blev udtrykt på lignende niveauer i cellekultur-analysen, mens vi har registreret højere niveauer af MAML1 (1-625) (figur 4C).

(A) Skematisk illustration af MAML1 domæner. (B) HEK-293-celler blev co-transficeret med 4xEBS-luc og vektorer udtrykker EGR1, MAML1 og trunkeringer af MAML1, som angivet i figuren. Dataene er angivet som middelværdi ± SD. (C) Western blots, der viser ekspressionsniveauer af MAML1 fuld længde og mutante proteiner i HEK-293-celler. (D) PageBlue Protein-farvet SDS-gel, der viser migrering af de oprensede GST-mærket MAML1 proteiner, der anvendes til protein-protein-interaktion assay. (E) GST-mærket MAML1 derivater og GST koblet til glutathion-Sepharose-perler blev inkuberet med HEK-293-helcelleekstrakter, og MAML1-interagerende EGR1 blev detekteret ved immunoblotting. Inputtet udgør 2% af hele celleekstrakt anvendes i bindingsreaktionen. (F) HEK-293-celler blev co-transficeret med 4xEBS-luc og vektorer udtrykker EGR1, MAML1 (1-1016) og (1-127). Dataene præsenteres som gennemsnit ± SD.

For at undersøge hvilken region i MAML1 interagerer med EGR1 blev fuld længde GST-mærket MAML1 protein og MAML1 derivater (Figur 4D) inkuberes med hel celle ekstrakter fra HEK293 celler transficeret med EGR1. EGR1 interagerede stærkt med fuld-længde GST-MAML1 protein og MAML1 (1-300); men kun viste en uge interaktion med MAML1 (1-625) og (309-625) (figur 4E). Da vi registreret en stærk EGR1-interaktion især med MAML1 (1-300), vi yderligere undersøgt rolle N-terminalen MAML1 i EGR1 transskription af co-transfektion HEK-293 celler med 4xEBS-luc reporter og plasmider, der udtrykker EGR1, MAML1 fuld længde og MAML1 (1-127). Som vist i figur 4F, MAML1 (1-127) undertrykte den MAML1-EGR1 synergistisk aktivering af EGR1-promotoren. Vi konkluderer, at et domænenavn inden aminosyre 75-127 af MAML1 kan være vigtigt for den synergistiske virkning af MAML1 og EGR1 på gentranskription. Den MAML1 N-terminus er rapporteret at interagere med Notch, MEF2C, p53 og GSK3beta, og til at spille en vigtig rolle i den transskriptionelle aktivitet af disse faktorer [1], [2], [5], [6], [13] . Den N-terminale domæne af MAML1 er også påkrævet for interaktionen af ​​MAML1 med p300, hvilket fører til øget p300 autoacetylation og HAT aktivitet [12]. Desuden MAML1 indeholder to N-terminale SUMOylation steder (K217 og K299), der undertrykker MAML1 aktivitet [14]. Derfor bør interaktionerne mellem MAML1 undersøges nærmere, med henblik på at afgøre, om samspillet mellem EGR1 med MAML1 forekommer i konkurrence, eller måske i synergi med andre transkriptionsfaktorer såsom Notch og p53.

MAML1 positivt korrelerer med EGR1 og p300 i nyrekræft

på baggrund af den stærke mekanistisk fremlagte beviser for samregulering mellem MAML1, EGR1 og p300, vi vurderede en genomics database for sådanne forhold. Vores bioinformatisk analyse af kopi-nummer forandringer (herunder amplificeringer og homozygote sletninger) i

MAML1

,

EGR1

p300

gen sæt afslørede ændringer i 18 af de 20 kræft