Abstrakt
Baggrund
Tumor-associerede makrofager (TAM’er) remodel den kolorektal cancer (CRC) mikromiljø. Men resultater om rolle TAM’er i CRC synes at være modstridende i forhold til andre kræftformer. Foxp3
+ regulatoriske T (Treg) -celler overvejende infiltrere CRC. Men den underliggende molekylære mekanisme, hvor TAM’er kan bidrage til handel med Treg-celler til tumormassen fortsat ukendt.
Metode /vigtigste resultater
CRC blev enten induceret af N-methyl- N-nitrosourea (MNU) og H.
pylori
eller oprettet af subkutan injektion af mus kolorektal tumor cellelinje (CMT93) i mus. CMT93 celler blev co-dyrket med primære makrofager i et Transwell apparat. Rekruttering af foxp3 grøn fluorescens protein positive (foxp3
GFP +) Treg-celler blev vurderet ved hjælp af IVIS Imaging System eller immunfluorescensfarvning. En rolle for makrofager i handel med Treg-celler og i udviklingen af CRC blev undersøgt i CD11b difteritoxin receptor (CD11b-DTR) transgene C57BL /6J mus, hvor makrofager kan selektivt udtømt. Treg-celler bemærkelsesværdigt infiltreret solid tumor, og overvejende udtrykte målsøgende kemokinreceptor (CCR) 6 i den inducerede CRC-modellen. Begge CMT93 kræftceller og makrofager produceret en stor mængde CCL20, den eneste ligand af CCR6
in vitro
in vivo
. Injektion af rekombinant mus CCL20 i tumor sites fremmet dens udvikling med en markant rekruttering af Treg-celler i transplantatet CRC-modellen. Betinget makrofag ablation faldt CCL20 niveauer, blokerede Treg-celle rekruttering og hæmmede tumorvækst i CD11-DTR mus podet med CMT93.
Konklusioner /Betydning
Tams rekruttere CCR6
+ Treg-celler til tumormasse og fremme dens udvikling via at øge produktionen af CCL20 i en CRC musemodel
Henvisning:. Liu J, Zhang N, Li Q, Zhang W, Ke F, Leng Q, et al. (2011) Tumor-associerede makrofager Recruit CCR6
+ Regulatory T-celler og fremme udviklingen af kolorektal cancer via Forbedring CCL20 Produktion i mus. PLoS ONE 6 (4): e19495. doi: 10,1371 /journal.pone.0019495
Redaktør: Sven G. Meuth, University of Muenster, Tyskland
Modtaget: Oktober 27, 2010; Accepteret: April 7, 2011; Udgivet: 29 April, 2011
Copyright: © 2011 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne forskning er støttet af en bevilling fra National Natural Science Foundation of China (No: 30.972.787), som programmet til professor i Special Udnævnelse (Eastern Scholar) på Shanghai institutioner for videregående uddannelse, af Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (nr : 09140902600), og af den førende akademiske Disciplin projekt Shanghai Municipal Education Kommissionen (No: J50208 og nr: J50207). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Kolorektal cancer (CRC) er en af de mest almindelige kræftformer i hele verden, og den fjerde mest almindelige årsag til cancer-associeret død [1]. I lighed med andre typer af cancer, opstår CRC i kronisk betændt væv, og dens udvikling er under immunovervågning og afhænger af cytokiner og chemokiner secerneret fra tumor-infiltrerende immunceller [2]
Regulatory T (Treg). – celler blev oprindeligt karakteriseret ved deres CD4
+ CD25
+ foxp3
+ fænotype og menes at balancere nødvendige aggressivitet mod fjender med tolerance for selvstændige bestanddele [3]. Stigende antal Treg-celler er blevet rapporteret i blodet og tumorer i patienter med forskellige cancere, herunder brystcancer, colorektal cancer, esophageal cancer, gastrisk cancer, hepatocellulært carcinom, leukæmi, lungecancer, lymfom, melanom, ovariecancer, og pancreas kræft [4]. Endvidere undersøgelser, depleteret Treg-celler resulterede i forbedret antitumor immunitet og markant reduceret tumorvækst i flere musetumormodeller [4]. Hos patienter med CRC, øget antal af Treg-celler i perifert blod, mesenteriske lymfekirtler og direkte i tumoren blev observeret [5], [6]. Endvidere antistofmedieret foxp3 proteinterapi resulterede i en klinisk signifikant reduktion i tumorbyrde i en syngen model af tyktarmskræft metastase til leveren i Balb /c-mus [7].
Viden om oprindelsen af Treg-celler akkumulere inde tumorbyrde kommer fra dyr tumor modelstudier. Det er blevet foreslået, at både eksisterende naturligt forekommende Treg-celler (nTreg-celler) og adaptive Treg-celler (aTreg-celler) induceret fra ikke-Treg precursorceller bidrager til den samlede pulje af tumor-infiltrerende foxp3
+ Treg-celler [8], [9]. Intratumorale Treg-celler antigen erfarne, stærkt aktiveret og synes at undergå omfattende cellulær proliferation da størstedelen af intratumoral Treg-celler har mistet CD62L og CD45RB-ekspression, men deres ekspression af CD25, CTLA-4 og GITR er stærkt forøget [8], [10]. Nedbrydningen af allerede eksisterende nTreg-celler ved hjælp af anti-CD25 mAb resulterede i hurtigere og mere omfattende omlægning af prækursor celler til aTreg-celler, som i vid udstrækning kan kompensere for tabet af nTreg-celler [8]. Aktivering og ekspansion af enten nTreg-celler eller aTreg-celler ved tumor-sites er antigen afhængig, og bidrager til tumoren specifik tolerance [4]. Især er antigenpræsenterende celler, såsom tumorinfiltrerende DC’er og makrofager sandsynligvis involveret i den lokale aktivering og ekspansion af nTreg-celler inde tumorbyrde [11]. Endvidere hos mennesker, tumorantigen specifik foxp3
+ Treg-celler med succes er blevet isoleret fra tumorvæv samt perifert blod fra patienter med melanom og livmoderhalskræft [12], [13].
foxp3
+ Treg-celler begynder at infiltrere den begyndende tumor læsion på et meget tidligt stadium af tumor udvikling [14]. Studier med humane ovariecancer har vist, at Treg-celler traffick til tumormassen og ascites via kemokinreceptor CCR4 reagere på CCL22 frigivet af tumorceller og tumorassocierede makrofager (TAM’er). Dette antyder, at chemokin og kemokinreceptorer er vigtige for Treg-celle homing til tumorer [15]. Men andre kemokinreceptorer, f.eks CXCR3, og CCR6, som deles med hukommelse Th1, Th2 og Th17 celler, er også blevet vist, skal udtrykkes med tumorinfiltrerende Treg-celler [16], [17]. CCR6 er en chemokinreceptor med kun én enkelt kendt specifik kemokinligand, den inflammatoriske og homeostatiske kemokin CCL20 som også er kendt som lever og aktivering-reguleret chemokin (LARC) [18] eller Exodus [19]. I modsætning til mange andre chemokiner, CCL20 har en relativt specifik receptor og binder næsten udelukkende til kemokinreceptoren CCR6, som også udtrykkes af CD45RO
+ memory T-celler og andre [20].
Trods den at tumorudvikling kan fremmes delvis af immunsystemet selv, den undertrykkende funktion Treg-celler, såvel som den molekylære mekanisme bag deres handel til tumorsteder stadig vanskeligt at definere. I denne undersøgelse undersøgte vi de målsøgende egenskaber ved Treg-celler, og den potentielle tumorfremmende funktion af TAM’er i en CRC-model. Vi rapporterer, at, i faste tumorer i mus med CRC, Treg-celler var signifikant forøget sammenlignet med kontrolgrupper. TAM’er bidraget til den øgede CCL20 produktion i tumoren miljø og rekrutterede Treg-celler, der udtrykte høje niveauer af CCR6. Injektion af rekombinant muse CCL20 i CRC fremmet tumorudvikling med en markant rekruttering af Treg-celler i vildtypemus, og stimuleret tumorvækst med direkte aktivere CMT93 celler i CCR6 – /- mus. Vigtigst er det, ved hjælp af CD11-DTR transgen musemodel viser vi for første gang, at betinget makrofag ablation ikke kun nedsat ekspression af CCL20 og foxp3 men resulterede i en signifikant inhibering af CRC. Vores data tyder på, at selektivt at målrette CCL20 ved nedregulere aktiviteten af TAM’er eller dens counter receptor CCR6 at blokere hukommelse rekruttering Treg-celle kan repræsentere en roman terapeutisk strategi mod CRC i mennesker.
Resultater
Antallet af foxp3
+ Treg-celler blev forøget i tumor-infiltrerende lymfocytter i CRC i mus
en større mål med dette studie var at give en endelig demonstration af menneskehandel mekanisme for foxp3
+ Treg-celler i CRC
in vivo
. Til dette formål har vi inducerede CRC i mus med MNU og H.
pylori
. MNU er en direkte alkyleringsmiddel, som ikke kræver metabolisk aktivering og er således en potent topisk kræftfremkaldende [21]. Tidligere har intrarektal inddrypning af MNU blevet rapporteret at inducere CRC i rotter [21]. Som forventet, efter 80 uger, 85% mus anvendt i denne undersøgelse udviklede synlig CRC induceret af MNU og H.
pylori
(Figur 1A-C). H 0,0001 ved Student t-test). Repræsentative data er vist, som var blevet gengivet i 3 uafhængige forsøg.
For at undersøge om foxp3
+ Treg-celler blev infiltrere tumorer induceret af MNU og H.
pylori
i mus, immunfluorescensfarvning af tumoren og normal colon for foxp3 blev udført. Som observeret i PBMC fra humane patienter (fig S1) blev foxp3 (rød farvning) rigeligt udtrykt i tumorvæv afledt fra mus behandlet med MNU og H.
pylori
sammenlignet med normal colon af ubehandlede mus eller IgG kontrol farvning (Figur 1F-H). Til at se mere præcist ved frekvensen af Treg-celler infiltrerer CRC, blev enkelt cellesuspension af CRC og normal slimhinde fremstillet og hyppigheden af Treg-celler blev bestemt ved flow cytomery. Vi bekræftede, at en signifikant højere frekvens af CD4
+ foxp3
+ Treg-celler var til stede i tumoren i sammenligning med normal colon (gennemsnit 9,095% ± 1.038% vs. betyde 0,478% ± 0,095%,
p
0,0001) (Figur 1I-K). Den øgede tæthed af Treg-celler i tumor-lymfocytter (TIL) antyder kraftigt, at Treg-celler kan spille en væsentlig rolle i modulering anti-tumor immunrespons i musemodel for CRC induceret af MNU og H.
pylori
.
CCR6 var nødvendig for rekruttering af Treg-celler til CRC i mus
for at behandle spørgsmålet om, hvorvidt naturligt forekommende foxp3
+ Treg-celler er i stand til at migrere til tumor væv efter adoptiv overførsel, vi injiceres 0,5-1 × 10
6 Treg-celler, der blev isoleret fra foxp3
GFP transgene mus i at mus med CRC fremkaldt af MNU og H.
pylori
eller sund kontroller. To uger efter adoptiv overførsel, kryosektioner afledt af tumorvæv fra mus injiceret med foxp3
GFP + -celler blev undersøgt for GFP
+ Treg-celler. Vi observerede, at GFP
+ Treg-celler massivt akkumuleret i tumoren (figur 2A). Især identificerede vi, at disse akkumulere GFP
+ Treg-celler inden colorektal tumor udtrykt CCR6, den Treg-celle homing receptor (figur 2B). Men naive Treg-celler fra foxp3
GFP transgene mus udtrykte ikke CCR6 (Figur 2C-D). Desuden har vi fordøjet kolorektal tumor fra mus behandlet med MNU og H.
pylori
, og bestemt CCR6 udtryk for tumor-infiltrerende Treg-celler ved Flow cytomery. Konsekvent, fandt vi tumorinfiltrerende Treg-celler næsten udelukkende udtrykkes CCR6 (figur 2E, F). For at bekræfte, om CCR6 var nødvendig for migration af Treg-celler til tumorsteder, vi podede mus colorektal tumorcellelinie CMT93 ind CCR6 – /- mus. To uger efter CMT93 podning, tumor-infiltrerende Treg-celler i CCR6 – /- mus blev undersøgt ved Flow cytomery. Vi observerede, infiltration af Treg-celler blev fuldstændigt forhindret i fravær af CCR6 i CCR6 – /- mus sammenlignet med CCR6 + /+ mus (figur 2G, H). Disse data antyder, at homing og handel med tumorinfiltrerende Treg-celler til tumormassen er afhængig af kemokinreceptoren CCR6
in vivo
i CRC-musemodellen podet med CMT93.
Treg -celler (0,5-1 × 10
6) oprenset fra milte fra foxp3
GFP-mus blev adoptivt overført til mus, der bærer CRC induceret af MNU og H.
pylori
. (A) kryosektioner fra tumor blev farvet for cellekerner med DAPI for at undersøge infiltration af foxp3
GFP + Treg-celler i tumormassen (oprindelig forstørrelse, × 20). (B) Co-lokalisering af GFP med CCR6 farvning. (C, D) Flowcytometrisk analyse for CCR6 af FoxP
GFP + Treg-celler afledt fra perifert blod fra naive foxp3
GFP-mus. (E, F) Flowcytometrisk analyse for CCR6 af infiltrerende Treg-celler afledt fra CRC induceret af MNU og H.
pylori
i mus. For at bekræfte, om CCR6 er nødvendig for foxp3
+ Treg-celle menneskehandel, blev CMT93 cellelinje podet ind CCR6 – /- og CCR6 + /+ mus. (G, H) Flowcytometrisk analyse af tumor-infiltrerende CD4
+ foxp3
+ Treg-celler to uger efter CMT93 cellelinie podning på CCR6 – /- (G) og CCR6 + /+ (H) mus. Repræsentative data er vist, som var blevet gengivet i 4 uafhængige forsøg.
TAMer bidraget til produktionen af CCL20, liganden af CCR6
CCL20 er hidtil kendt for at være den eneste ligand for CCR6 og stand til at styre migrationen af CCR6
+ -celler [20]. For at undersøge den mulige produktion af CCL20 i tumor væv tumor kryosektioner taget fra C57BL /6J mus behandlet med MNU og H.
pylori
blev immunfarvet med anti-mus CCL20 mAb. Vi observerede, at ekspression af chemokin CCL20 (rød farvning) blev markant forøget i CRC væv sammenlignet med normal slimhinde (figur 3A, B). Koordineret signalering mellem tumorceller og ikke-maligne inflammatoriske celler i tumormikromiljøet kræves til udvikling af tumorer. Blandt dem, makrofager er store producenter af proinflammatoriske cytokiner, såsom tumornekrosefaktor-a (TNF-α), IL-1β og IL-6, og spiller en afgørende rolle i modulering af immunresponser [22]. For at undersøge, om makrofager er en vigtig kilde til CCL20 i tumorstederne, var dobbelt immunfluorescensfarvning udført på cryo-snit afledt af tumor biopsier af mus behandlet med MNU og H.
pylori
. Vi observerede, at foruden F4 /80
+ makrofager, andre celler producerede også CCL20 i tumorpositionen af mus (Figur 3C), hvilket indikerer, at CCL20 udgivet af TAM’er eller andre kan inducere Treg-cellemigration til tumorer. For at tydeliggøre, hvad andre celler producerer CCL20, vi transduceret CMT93 med GFP, og podet subkutant til C57BL /6J mus (Figur 3D). Tre uger senere, vi har registreret størstedelen af CCL20
+ -celler (78,98%) blev GFP
+ CMT93 tumorceller, hvilket antyder fleste andre CCL20 producerende celler er tumorceller (figur 3e). For at bestemme om makrofager er ansvarlige for overproduktionen af CCL20 i tumormassen, vi co-dyrkede CMT93 cancerceller med frisk peritoneale makrofager fra mus i 48 timer i en transwell apparat. Vi viste, at i co-kultur både makrofager og CMT93 cancerceller produceret forøgede niveauer af CCL20 sammenlignet med enten makrofager eller CMT93 kultur alene (figur 3F, G). Påfaldende, i co-kultur af CMT93 og peritoneale makrofager fra mus, CMT93 cancerceller produceret 26,4 gange mere CCL20 end makrofager på mRNA-niveauer, hvilket antyder, at makrofager kan spille sammen med cancerceller til produktion af CCL20 i tumormikromiljøet (figur 3F). Desuden blev forhøjet proteinniveauer af CCL20 bekræftet ved ELISA i co-kultur (figur 3H).
(A, B) kryosektioner fra muse CRC induceret af MNU og H.
pylori
eller mus normal colon blev farvet for CCL20 (rød, original Magni-fikation, × 20). Dobbelt immunfarvning med anti-muse CCL20 og F4 /80 mAb blev udført på kryosektioner afledt fra muse CRC. (C) Co-lokalisering af CCL20 med F4 /80-farvning (original forstørrelse, × 20). (D) CMT93 blev transduceret med GFP, og bekræftet ved flowcytometri. (E) Flowcytometrisk analyse af CCL20
+ celler tre uger efter GFP
+ CMT93 celler grafting i C57BL /6J-mus. (F) mRNA-niveauer af CCL20 for co-dyrkning af peritoneale makrofager fra mus med CMT93 cancerceller. AU, arbitrære enheder. (G) Protein niveauer af CCL20 for co-dyrkning af peritoneale makrofager fra mus med CMT93 cancerceller. Repræsentative data er vist som var blevet gengivet i mindst 2 uafhængige forsøg. *
s
0,05, **
s
0,01, ***
s
. 0,001, Students
t
test
Samtidig injektion af rekombinante mus CCL20 resultater i handel med CCR6
+ Treg-celler i tumorer, og fremme af CRC vækst i mus
Tumor-infiltrerende Treg-celler undertrykker priming og effektorfunktion af tumordræbende effektor T-celler, der bidrager til tumorvækst og udvikling [11]. For at fastlægge den rolle, CCL20 i migreringen af Treg-celler
in vivo
, vi s.c. injiceres CMT93 murine CRC celler sammen med rekombinant muse-CCL20 i foxp3
GFP transgene mus. Brug af hele kroppen lille dyr fluorescens imaging system til overvågning af migrationen af Treg-celler [23], demonstrerede vi, at rekombinant muse CCL20 rekrutteret et stort antal GFP
+ Treg-celler i tumorer (hvid pil) sammenlignet med PBS behandlede grupper (figur 4A-C). For yderligere at bekræfte GFP mærkede Treg-celler migreret til tumormassen som reaktion på rekombinant muse CCL20 blev enkeltcellesuspensioner af tumorvæv fremstilles og foxp3
GFP + Treg-celler blev detekteret ved flow cytomery ved slutningen af eksperimentet . I modsætning til PBS behandling, observerede vi, at GFP
+ Treg-celler var signifikant forhøjede i tumoren, der blev behandlet med rekombinant muse CCL20 (figur 4D). For yderligere at studere den patologiske betydning CCL20, vi administreret rekombinant mus CCL20 omkring tumor sites ugentlige i 4 uger. Vi viste, at tumorstørrelse var signifikant forøget i mus behandlet med rekombinant muse CCL20 sammenlignet med PBS-kontroller (Figur 4E), hvilket tyder på en kritisk rolle af CCL20 i CRC vækst og udvikling. I humane CRC patienter blev CCR6 også fundet at udtrykkes ved primære CRC celler [24]. Derfor, for den endelige bekræftende undersøgelse, vi podet CMT93 CRC kræftceller i CCR6 – /- mus. I denne model vil tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) ikke udtrykke CCR6. To uger senere vi analyseret ved flowcytometri for CCR6 ekspression af enkeltcelle-suspension fremstillet fra graft CRC. Konsistent med studier i humane CRC patienter [24], bemærkede vi, at i CCR6 – /- mus, så meget som 73,71% af graft CRC-celler udtrykte CCR6 (Figur 4F). Mest interessant, observerede vi, at rekombinant mus CCL20 stimuleret CMT93 CRC cellevækst ved direkte at aktivere CCR6 på tumorceller i fravær af CCR6
+ TIL i CCR6 – /- mus (Figur 4G). Denne CCL20 medieret effekt er sandsynlig via tiltrække Treg-celler til tumormassen eller direkte stimulerende CRC cancerceller eller begge.
Mus kolorektal cellelinie, CMT 93 (1 x 10
6) med eller uden 0,5 pg muse rekombinant muse CCL20 i 100 pi PBS blev injiceret sc i foxp3
GFP mus og 0,5 ug rekombinant muse CCL20 i 100 pi PBS blev injiceret s.c. ugentligt i 28 dage. Kontrol foxp3
GFP-mus fik kun 100 pi PBS injektion. (A) Normal foxp3
GFP mus blev anvendt som en teknik kontrol. (B, C) Grøn fluorescens af foxp3
GFP + -celler i mus behandlet PBS eller rekombinant muse CCL20 (hvid pil) blev overvåget ved anvendelse IVIS Imaging System på dag 28. (D) Antal tumor-infiltrerende foxp3
GFP + Treg-celler afledt fra podet CRC i mus behandlet med PBS eller rekombinant muse CCL20 blev analyseret ved flowcytometri. (E) Størrelserne af tumorer blev målt med passere i de angivne tidspunkter i 28 dage. Injektion af rekombinant muse CCL20 resulterede i en signifikant stigning i tumorstørrelser (n = 5). (F) Ekspressionsniveauer af CCR6 efter podet CRC i CCR6 – /- mus. (G) CMT 93 (1 × 10
6) med eller uden 0,5 pg muse rekombinant muse CCL20 i 100 pi PBS blev injiceret s.c. til CCR6 – /- mus og 0,5 ug rekombinant muse CCL20 i 100 pi PBS eller 100 pi PBS blev injiceret s.c. på hver anden dag i 21 dage. Tumorvægt af CRC blev målt ved slutningen af eksperimentet. Repræsentative data er vist som var blevet gengivet i 3 uafhængige eksperimenter. *
s
0,05, **
s
0,01, Students
t
test
Selektiv udtømning af makrofager i CD11b. -DTR mus faldt CCL20 tumorniveauer, blokeret CCR6
+ treg-celle rekruttering ind i tumormassen og inhiberede tumorvækst
CD11-DTR transgene mus har CD11b-promotor-medieret ekspression af det humane difteritoksin (DT ) receptoren, og dette inducerbare system selektivt udtømmer makrofager
in vivo
når DT injiceres [25]. For at undersøge, om
in vivo
DT behandling kunne eliminere TAM’er i CMT93 graft CRC model, vi først injicerede DT eller DT
mu ved en koncentration på 25 ng /g mus vægt én dag før podning CMT93 i CD11 -DTR transgene mus. Derefter behandlede vi mus med DT eller DT
mu ved en koncentration på 5 ng /g hver tredje dag i 14 dage. Efter aftale med andre, vi demonstreret, at DT selektivt forarmet F4 /80
+ makrofager 24 timer efter injektion, men havde ingen signifikant virkning på T-celler, neutrofiler, mastceller eller modent Langerhanske celler /dendritiske celler (data ikke vist) [ ,,,0],26]. Ved afslutningen af forsøget, viste vores data, at DT behandling fuldstændig fjernet F4 /80
+ TAM’er i CRC sammenlignet med DT
mu injektion (figur 5A, B). Vi undersøgte yderligere CCL20 ekspression i tumorvæv afledt fra mus behandlet med DT, fandt vi, at selektiv depletion af makrofager resulterede i et markant fald i både CCL20 mRNA-niveau (figur 5C) og CCL20 proteinniveau (figur 5D) i tumormassen sammenlignet med DT
mu behandling. For at undersøge om TAM’er fremmer frigivelsen af CCL20 fra CMT93 tumorceller
in vivo
, vi podet GFP
+ CMT93 tumorceller i CD11b-DTR transgene mus. Efter behandling af DT eller DT
mu i 14 dage, observerede vi, at den selektive depletering af TAM’er åbenbart inhiberede produktionen af CCL20 ved CMT93
GFP muse tumorceller, hvilket antyder, at TAM’er er ikke kun den største kilde til CCL20 men også tydeligt bidrage til frigivelsen af CCL20 fra CRC-celler i mus (figur 5E). Desuden viste vi, at DT behandling ikke formindske CCR6 udtryk ved CMT93
GFP mus tumorceller i forhold til DT
mu (Figur 5F). Imidlertid muse CRC celler har lav CCR6 ekspression før podning til værter (figur 5F). Vigtigst er det, makrofag depletering ved indgivelse af DT ført til en markant reduktion i antallet af tumor-infiltrerende foxp3
+ Treg-celler (figur 5G, H). Tilsammen indikerer disse data, at TAM’er understøtter akkumuleringen af CCR6
+ tumorinfiltrerende Treg-celler, og, i det mindste delvist via denne mekanisme, fremme frigørelsen af CCL20 i CRC i mus. Endelig fandt vi, at selektiv fjernelse af TAM’er dramatisk inhiberede væksten af CRC i mus (fig 5I, J), viser en kritisk tumorfremmende rolle TAM’er i CRC musemodel.
(A, B) Flow cytometri af TAM’er afledt podet CRC i CD11-DTR mus injiceret med DT
mu eller DT. (C) CCL20 mRNA-niveauer i podet CRC i CD11-DTR mus injiceret med DT
mu eller DT (data fra 5 mus i hver gruppe blev samlet sammen). (D) Lysater af podet CRC fra CD11-DTR mus injiceret med DT
mu eller DT blev udsat for western blotting for CCL20 udtryk. Actin – lastning kontrol. (E) Immunfluorescensfarvning med anti-muse CCL20 blev udført på snit af frosset GFP
+ CMT93 podet tumormasse afledt af CD11-DTR mus injiceret med DT
mu eller DT i 14 dage. (F) Flowcytometrisk analyse af CCR6 udtryk for GFP
+ CMT93 celler før podning (venstre panel), og CCR6 farvning på snit af frosset GFP
+ CMT93 podet tumor masse afledt fra CD11-DTR mus injiceret med DT
mu eller DT i 14 dage (midterste og højre panel). (G, H) Antal tumor-infiltrerende foxp3
+ Treg-celler i podede CRC i CD11-DTR mus injiceret med DT
mu eller DT. (I) CRC podet i CD11-DTR mus injiceret med DT
mu eller DT i 14 dage. (J) Tumor vægt CRC podet i CD11-DTR mus injiceret med DT
mu eller DT i 14 dage. Repræsentative data er vist, som var blevet gengivet i 2 uafhængige forsøg.
Diskussion
De medfødte og adaptive immunforsvar kan fremme tumor udvikling gennem betændelse-afhængige mekanismer [2], [27 ]. Denne begivenhed er koordineret af mange inflammatoriske celler, blandt dem foxp3
+ Treg-celler menes at undertrykke T-celle immunitet over for tumor-associerede antigener og lette tumorprogression [4]. Foxp3 er den mest definitive producent af Treg-celler, og dens opdagelse kan tillade en bedre forståelse af de mekanismer, hvorigennem Treg-celler er involveret i autoimmune sygdomme og infektionssygdomme, samt transplantation og tumor immunitet [28]. Selv om mange undersøgelser har fokuseret på rollen som Treg-celler i at kontrollere selv-reaktivitet, der er en voksende mængde af beviser for, at Treg-celler har en betydelig indvirkning på værten reaktion på kræft [29], [30], herunder CRC [31], [32]. Det blev tidligere rapporteret, at patienter med høje frekvenser af infiltrerende CD3
+ T celler i deres kolorektale tumorer er blevet anset for at have en bedre 5-års overlevelse (73%) end dem med lave niveauer af CD3
+ T celler (30%) [33]. Men inden for denne CD3
+ T-celle population, bortset fra effektor T-celler, Treg-celler anses for at undertrykke anti-tumor immunrespons i patienter med CRC [34]. I denne undersøgelse har vi også bekræftet, at foxp3
+ Treg-celler er stærkt akkumuleret i mikromiljøet i CRC musemodel, støtter opfattelsen, at tilstedeværelsen af Treg-celler kan tillade udslip af tumorceller fra immunovervågning efter cytotoksisk T lymfocytter i CRC patienter.
Ligesom andre humane sygdomme, er musemodeller almindeligt anvendt til at belyse mekanismer involveret i colon carcinogenese (initiering, promotion og progression) samt undersøgelser af chemoprevention og intervention [35]. Heri, vi inducerede CRC i C57BL /6J mus med MNU og H.
pylori
at undersøge Treg-celle menneskehandel, differentiering og funktion. MNU er en direkte alkyleringsmiddel, som ikke kræver metabolisk aktivering og dermed er en potent topiske carcinogener [21]. Vi har fundet den anvendte strategi til induktion af CRC i mus er ganske effektiv som 85% mus anvendt i denne undersøgelse udviklede synlig CRC under den udfordring MNU og H.
pylori Salg (upublicerede observationer).
Beviser understøtter en vigtig rolle for foxp3
+ Treg-celler i tumor immune unddragelse kommer fra undersøgelser, der eliminerede Treg-celler før tumor udfordring. Denne behandling resulterede i tumor afvisning i flere mus tumormodeller [10], [36], [37], [38]. Som i humane indstillinger [34], blev en øget antal Treg-celler observeret både i perifert blod (figur S2) og faste tumorer i mus behandlet med MNU og H.
pylori
sammenlignet med normal colon af ubehandlede mus . Mest interessant, i faste tumorer afledt fra mus behandlet MNU og H.
pylori
, hyppigheden af CD4
+ foxp3
+ Treg-celler var i gennemsnit 9,095% af det samlede TIL, hvilket tyder at disse akkumulerede Treg-celler kan tjene som en fælles immun unddragelse mekanisme til at hindre immunosurveillance mod autologe tumorceller. Treg-celler udfører en vigtig funktion at begrænse autoimmunitet og derfor målretter Treg-cellemigration kan tjene som en ny og foretrukken fremgangsmåde i immunterapi af samlede tumorprogression. Derudover har vi opdaget nogle CD4
– celler, der udtrykker foxp3 i tumormassen. Oprindelsen af CD4
-FoxP3
+ celler vil blive forelagt den kommende undersøgelse.
For at fungere effektivt i tumor mikromiljø, Treg-celler skal migrere til og operere i forskellige lymfoide og ikke- lymfoide organer. Svarende til effektor-T-cellepopulationer, der Treg-cellepopulationer underinddeles på grundlag af deres ekspression af homing receptorer i delmængder, der er forudsagt at migrere fortrinsvis til visse væv [39]. Undersøgelser med humane ovariecancer har afsløret, at Treg-celler hjem til tumormassen og ascites
via
CCR4 som reaktion på tumor celle- og TAM-afledt CCL22 [15]. Alligevel har nye beviser foreslået, at bortset fra CCR4 nogle andre kemokinreceptorer er involveret i vejledende Treg-celle handel med forskellige typer af tumorer i både mennesker og mus [17], [40]. Derfor kemokinreceptor ekspressionsmønstre synes at være stærkt heterogen inden den perifere foxp3
+ Treg-cellepopulationen [11]. Til dato har ingen enkelt homing receptor blevet identificeret som specifikt udtrykkes af Treg-celler. Men blandt CD4
+ T-celler, kemokinreceptoren CCR6 hovedsageligt udtrykt af Treg-celler i forskellige inflammatoriske indstillinger [41]. Tilsvarende er CCR6 ligand CCL20 konstitutivt udtrykt af intestinale epitelceller, og opreguleret i epitelceller under inflammation [42].
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.