PLoS ONE: Hæmning af PTEN genekspression ved oncogen miR-23b-3p i Renal Cancer

Abstrakt

Baggrund

MIR-23b er placeret på kromosom nummer 9 og spiller forskellige roller i forskellige organer, især med hensyn til udvikling af kræft. Men den funktionelle betydning af miR-23b-3p i renalcellecarcinom (RCC) ikke er blevet rapporteret,.

Metoder og Resultater

Vi målte miR-23b-3P-niveauer i 29 par renalcellecarcinom og deres normale matchede væv under anvendelse real-time PCR. Udtrykket niveau af miR-23b-3p blev korreleret med fem år overlevelsesraten for nyre kræftpatienter. I 15 tilfælde (52%), blev MIR-23b-3p-ekspression sig at være høj. Alle patienter med moderat til lav MIR-23b-3p-ekspression overlevede 5 år, mens dem med høj MIR-23b-3p-ekspression, kun 50% overlevede. Efter banker ned miRNA-23b-3p-ekspression i RCC-cellelinjer, der var en induktion af apoptose og reduceret invasive kapacitet. MIR-23b-3p vist sig at direkte målrette PTEN gen gennem 3’UTR reporter assays. Inhibering af MIR-23b-3p inducerer PTEN genekspression med en ledsagende reduktion i PI3-kinase, total Akt og IL-32. Immunhistokemi viste manglen på PTEN proteinekspression i cancerøse regioner af vævsprøver, hvor ekspressionen af ​​MIR-23b-3p var høj. Vi studerede

in vitro

virkninger af kosten kemo forebyggende middel genistein på miR-23b-3p udtryk og fandt, at det hæmmede ekspressionen af ​​miR-23b-3p i RCC-cellelinjer.

Konklusioner

Den aktuelle undersøgelse viser, at miR-23b-3p er et onkogen miRNA og hæmmer PTEN tumorsuppressorgen i RCC. Derfor kan inhibering af MIR-23b-3p være et nyttigt terapeutisk mål til behandling af renalcellecarcinom

Henvisning:. Zaman MS, Thamminana S, Shahryari V, Chiyomaru T, Deng G, Saini S, et al. (2012) Hæmning af PTEN genekspression ved oncogen miR-23b-3p i nyrekræft. PLoS ONE 7 (11): e50203. doi: 10,1371 /journal.pone.0050203

Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: 13 august, 2012; Accepteret: 17 oktober 2012; Udgivet: 26 november, 2012 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af VA Merit Review, VA Program Project og NIH Grant RO1CA130860 (PI: R. Dahiya). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

miRNA har vist sig at være involveret i forskellige nyresygdomme [1]. MIR-23b er placeret på kromosom nummer 9 i en klynge med MIR-27b og MIR-24-1 [2]. Det er blevet vist at spille forskellige roller i forskellige organer, især med hensyn til udvikling af cancer. I cancere såsom blære og mundtlige pladecellecarcinom [3] – [4] har det vist sig at være overudtrykt. I nyrecancer MIR-23b-5P virker som en potentiel OncomiR ved at undertrykke prolin oxidase, som er et hidtil ukendt tumorsuppressorprotein [5]. Henviser i prostatacancer [6], det spiller rollen som en tumorsuppressor microRNA som det er målrettet efter den onkogene transkriptionsfaktor c-myc. Dette resulterer til sidst i en forøgelse af proteinekspression af pro-kræft enzym mitokondrie glutaminase, som er et mål for MIR-23b [7]. I brystcancer er det blevet vist at være opreguleret med MIR-27b og MIR-24-1 ved oncosuppressor transskriptionsfaktoren ERp [8]. Tilsvarende i hepatocellulært carcinom det virker som en tumorsuppressor ved at målrette Urokinase-plasminogenaktivator (uPA) og c-met resulterer i nedsat migration og proliferation af HCC-celler [9]. I tyktarmskræft det fungerer på at undertrykke cancer metastaser ved at målrette prometastatic gener FZD7 eller MAP3k1 [10].

I denne undersøgelse undersøgte vi rollen som miR-23b-3p i renal klar celle carcinom. Vi fandt, at ekspression af MIR-23b-3p blev forøget i A-498 og Caki-2-cellelinjer og et flertal af vævsprøver. Forøget ekspression også korreleret med lavere overlevelsesrate for patienter med renalcellecarcinom. Inhibering af MIR-23b-3p-ekspression i A-498 og Caki-2-celler medførte en stigning i apoptose og et fald i invasive egenskaber. PTEN proteinekspression blev fundet at forøges efter banker ned MIR-23b-3p i A-498-celler med et samtidigt fald i ekspressionen af ​​PI3-kinase, total Akt og IL-32. PTEN genet viste sig at være et direkte mål for MIR-23b-3p ved 3’luciferase reporter assays. Immunhistokemi viste den manglende PTEN proteinekspression i kræft områder af vævsprøver, hvor ekspressionen af ​​miR-23b-3p var høj.

Resultater

miR-23b-3p er Up Reguleret i Renal Carcinoma vævsprøver og renal kræftceller

for at forstå den kliniske relevans af miR-23b i nyrekræft vi målte miR-23b-3P-niveauer i 29 par af humane nyre kræft (alle klar celle renalcellecarcinom) og matches normale væv ved real-time PCR. I 15 tilfælde (52%), blev MIR-23b-3p vist sig at være forøget (T /N [Tumor /Normal] var større end 1,2). I 5 prøver (17%) ekspressionen var moderat (T /N 0,8-1,2). Ekspression af miR-23b-3p blev også målt i dyrkede nyrekræft cellelinjer, A-498, ACHN, Caki-1, Caki-2 og ikke maligne normale HK-2 celler. miR-23b-3p-ekspression i A-498 celler var ca. 11x den for HK-2-celler, mens den for ACHN var 4.1x Caki-1 4,8x, og Caki-2 5,8x (Figur 1).

a) Ratio af T /N-ekspression i vævsprøver viste sig at være høj i de fleste prøver. B) A-498 og Caki-2-celler havde høj ekspression af MIR-23b-3p sammenlignet med ikke maligne normale HK-2-celler (T-tumor, N-Normal), [P-værdi (A) 0,032; p-værdi (B) 0,018)].

Korrelation af miR-23b-3p Expression med overlevelse i Renal Cancer

Udtrykket niveau af miR-23b-3p korreleret med fem år overlevelse af patienterne. For de patienter med moderat til lav MIR-23b-3p-ekspression (n = 12) (figur 2), alle overlevede 5 år efter operationen, mens dem med høj MIR-23b-3p (n = 12) ekspression, kun 50% overlevede (figur 2). Overlevelsen kurve blev baseret på antallet af patienter (24), hvor vi havde overlevelse oplysninger ud af i alt 29 patienter. Ingen sammenhæng mellem tumor klasse, scene og miRNA-23b-3P niveauer blev observeret.

Funktionel rolle miR-23b-3p i A-498 Celler

For at belyse den funktionelle rolle af miR-23b-3p i nyrekræft vi bankede ned udtryk for miR-23b-3p i a-498 og Caki-2 renale cancerceller med en kommercielt tilgængelig miR-23b-3p-hæmmer. Anti-MIR-Negativ kontrol # 1 blev også anvendt til disse eksperimenter. MIR-23b-3p niveau blev reduceret med mere end 99% i forhold til den negative kontrol i A-498 celler (figur 3a). Anti-miR-23b-3p transfektion i Caki-2-celler også reduceret niveauet af miR-23b-3p-ekspression i disse celler (figur 3b).

Angivelse af miR-23b-3p blev reduceret med mere end 99% efter sin hæmning i både A-498 (A) og Caki-2-celler (B).

effekt på Cell Cycle og Apoptose

virkningerne af miR-23b- 3p banke ned på cellecyklussen og apoptose blev analyseret ved flowcytometri. Apoptose assay viste en betydelig stigning i antallet af totale apoptotiske celler (tidligt apoptotiske plus apoptotiske) i både A-498 (8,87%) (figur 4a) og Caki-2-celler (11,74%) (figur 4B) med MIR-23b- 3p vælte så sammenlignet med den negative kontrol [A-498 (3,37%) og Caki-2 (3,68%)]. Der var ingen signifikante ændringer i cellecyklussen for både A-498 og Caki-2-celler (data ikke vist).

A) Apoptose assay viste en betydelig stigning i antallet af totale apoptotiske celler (8,87%) i anti mIR-23b-3p-inhibitor transficerede celler i sammenligning med den negative kontrol (3,37%) i A-498-celler (p-værdi 0,029). B) I Caki-2-celler det totale antal apoptotiske celler (11,74%) i anti MIR-23b-3p-inhibitor transficerede celler i sammenligning med den negative kontrol (3,68%) (p-værdi 0,030).

Effekt på Cell invasion og migration Properties

for at bestemme om miR-23b-3p påvirker nyrekræft celle migration og invasion en cytoselect 24-brønd celle migration og invasion kit blev brugt. A-498 og Caki-2-celler blev transficeret med anti-MIR-23b-3p-inhibitor og anti-MIR-negativ kontrol. Både A-498 og Caki-2-celler viste et fald på 30% i celleinvasion i prøverne, hvor MIR-23b-3p blev inhiberet i sammenligning med negative kontroller (figur 5a og 5b). blev ikke observeret nogen signifikant ændring i migration i både A-498 og Caki-2-celler (data ikke vist).

Invasive egenskaber af A-498 (A) og Caki-2 (B) celler blev reduceret med 30 % efter miR-23b-3p banke ned sammenlignet med kontrolgruppen. Y-aksen-Absorbans ved 560 nm [p-værdi (A) 0,026; p-værdi (B) 0,030].

PTEN øges Efter Knock Down af miR-23b-3p i A-498 Celler

For at se effekten af ​​miR-23b-3p ekspression på forskellige gener involveret i apoptose og invasion vi kontrolleres proteinet ekspression af flere gener involveret i disse processer. Pro apoptotiske gen PTEN viste sig at være op reguleres efter miR-23b-3p banke ned i A-498 celler (figur 6A). Vi fandt også et fald i protein-niveauer af PI3-kinase og total Akt. Interessant nok blev et fald i ekspressionen af ​​pro inflammatoriske cytokin IL32 også observeret efter MIR-23b-3p vælte. De protein udtryk niveauer blev kvantificeret ved optisk densitometri hjælp ImageJ Software version 1.36b (https://rsb.info.nih.gov/ij/). Fold ændring blev beregnet som forholdet mellem den netto intensiteten af ​​hver prøve transficeret med anti-MIR-23b-3p divideret med GAPDH og den negative kontrol transficerede prøver divideret med GAPDH (Anti-MIR-23b-3p transficerede prøver /GAPDH) /(Neg kontrol miR transficerede prøver /GAPDH) (figur 6B).

A) Angivelse af PTEN, PI3-kinase, Akt og IL-32 i A-498 celler, i forhold til negativ kontrol. GAPDH blev anvendt som en normaliserende kontrol. B) Kvantitative data til Western blot-analyse. PTEN blev op reguleret, hvorimod PI3-kinase, Akt og IL-32-ekspression blev nedreguleret.

PTEN er et direkte mål for miR-23b-3p

Da en betydelig stigning i apoptose blev observeret i både A-498 og Caki-2-celler og forøget PTEN udtryk i A-498 celler efter miR-23b-3p vælte, vi kiggede for at se om miR-23b-3p henvender pro apoptotiske gen PTEN. Brug af Targetscan (targetscan.org) og microrna.org vi identificeret komplementære sekvenser til MIR-23b i 3’UTR af PTEN genet (figur 7a). Vi gennemførte luciferase reporter analyser ved hjælp af en 3’PTEN konstruere med miR-23b-3p eller miR-Control- udtrykker A-498 celler og observerede en konsekvent reduktion af luciferaseaktivitet (figur 7b) i miR-23b-3P transfektanter tyder på, at miR -23b-3p undertrykker PTEN direkte.

A) Software analyse viser sekvenser komplementære til de frø sekvenser af miR-23b-3p i 3’UTR af PTEN genet. B) Luciferase assay viste et fald i relative luciferaseenheder i prøver co transficeret med MIR-23b-3p var og PTEN 3’UTR genkonstruktion sammenlignet med kontroldyr konstruktioner (Neg Con-negativ kontrol; Con-Control plasmidkonstruktion mangler PTEN 3′ UTR sites for miR-23b-3p, PTEN-PTEN plasmid konstruktion med PTEN gen 3’UTR sites for miR-23b-3p;. (p-værdi 0,017)

Angivelse af PTEN protein i normal og kræft regioner af vævsprøver, der har en høj ekspression af miR-23b-3p

for yderligere at bekræfte, at PTEN er et mål for miR-23b-3p vi kontrolleret for ekspression af PTEN protein i normale og cancer regioner i patientens væv prøver, som havde en høj ekspression af mIR-23b-3p, under anvendelse af immunhistokemi (IHC). Ti prøver med høj mIR-23b-3p-ekspression blev valgt. et repræsentativt eksempel på PTEN immunhistokemi er vist i figur 8A.

A) Repræsentative billeder af immunhistokemi (IHC) analyser. B) Grafisk fremstilling af de data, der viser, at PTEN udtryk var høj i normale regioner af renale prøver kræftpatient mens i kræft regioner med høj miR-23b-3p udtryk PTEN ikke blev observeret.

IHC farvningsresultater for væv blev gradueret efter hurtig score (procent celler farves × intensitet plet). Hurtig score opnået fra tumorprøver blev normaliseret med den praktiske resultat af deres normale prøver (T /N) og Chi-square test blev udført med MIR-23b-3P ekspressionsniveauer i de samme patientprøver (Figur 8B). Alle normale prøver udtrykt PTEN protein selvom på forskellige niveauer. PTEN farvning var fraværende fra tumor prøver, der udtrykte højere niveauer af miR-23b-3p (p 0,001). (Figur 8B)

Genistein Formindsker Expression af miR-23b-3p i A-498 celler

Vi undersøgte også effekten af ​​chemoprevention middel, genistein (en soja produkt), på ekspressionen af ​​miR-23b-3p i a-498 celler. Behandling med genistein (25 uM) i 96 timer faldt ekspressionen af ​​MIR-23b-3p med 50%, hvorimod en højere koncentration af genistein (50 uM) i samme periode reduceret ekspression med 45% (figur 9).

mIR-23b-3p-ekspression blev reduceret med 50% i 25 uM genistein behandlet A-498-celler i sammenligning med ubehandlede celler, 50 uM genistein faldt mIR-23b-3p-ekspression med 45% (p-værdi 0,030).

diskussion

Den foreliggende undersøgelse viser, at miR-23b-3P fungerer som en onkogene mikroRNA i renalcellecarcinom. Dets ekspression er forøget i renale celle carcinom-cellelinjer og vævsprøver (clear cell carcinoma) sammenlignet med normale renale celler og matchede normale væv, henholdsvis. Desuden fandt vi, at høje niveauer af miR-23b-3p føre til lavere overlevelse for nyre kræftpatienter. For at undersøge den funktionelle rolle miR-23b-3p sit udtryk blev slået ned i A-498 og Caki-2 nyrekræft cellelinjer. Dette førte til en stigning i det samlede antal celler, som undergår apoptose i begge cellelinier sammenlignet med kontroller. Der var imidlertid ingen signifikant ændring i cellecyklussen. Desuden A-498 og Caki-2 celler viste nedsat celle invasion i miR-23b-3p slået ned celler, men ingen signifikant ændring i migration. Western-analyse af miR-23b-3p vælte viste øget PTEN udtryk og samtidige nedgang i ekspressionen af ​​PI3-kinase, Akt og IL-32. PTEN viste sig at være et direkte mål for MIR-23b-3p gennem reportergenassays.

De væsentlige ændringer i antallet af apoptotiske celler efter banke ned af MIR-23b-3p i både A-498 og Caki -2 celler føre os for at søge efter gener og pathways involveret i apoptose. Tidligere undersøgelser har vist, at PTEN kan inducere apoptose gennem en PI3-kinase afhængige vej [11]. PTEN fungerer som et tumorsuppressorgen gennem virkningen af ​​dens phosphatase proteinprodukt [12], nedbrydende PIP3 til inaktive phosphatidylinositol (4,5) -diphosphate PIP2 [13], [14]. Dette igen negativt regulerer pro-overlevelse PI3K /Akt-signalvejen. Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway regulerer forskellige cellulære processer, herunder proliferation, vækst, apoptose og cytoskelet omlejring. PI3K’er er heterodimere lipid kinaser der er sammensat af regulatoriske og katalytiske underenheder kodet af forskellige gener [15]. En af de vigtigste funktioner i PI3K er at syntetisere second messenger PtdIns (3,4,5) P3 (PIP3) fra PtdIns (4,5) P2 (PIP2). AKT, en serin /threonin-kinase, som har en bred vifte af substrater, aktiveres ved rekrutteringen til plasmamembranen gennem direkte kontakt af sin pleckstrin-homologi (PH) -domæne med PIP3, og phosphorylering på Thr308 og Ser473. AKT virker nedstrøms for PI3K at regulere mange biologiske processer, såsom proliferation, apoptose og vækst, men andre signalveje er også kendt at være reguleret af PI3K-aktivitet og kan være involveret i PI3K-medieret tumorigenese. PTEN er en af ​​de mest almindeligt mistet tumorsuppressorgener i human cancer. Under tumorudvikling, mutationer og deletioner af PTEN ske at inaktivere dets enzymatiske aktivitet fører til øget celleproliferation og reduceret celledød. Hyppig genetisk inaktivering af PTEN forekommer i glioblastom, endometriecancer, prostatakræft; og reduceret ekspression findes i mange andre tumorer, såsom lunge- og brystcancer [15]. I denne undersøgelse Western-analyse viste også et fald i IL-32-ekspression efter inhibering af MIR-23b-3p i A-498-celler. Vi har ikke overvåge IL-32 i kulturen medier. IL-32 er et cytokin og det er pro-kræft rolle er blevet dokumenteret i adskillige undersøgelser [16], [17], [18]. PI3-kinase pathway er blevet vist at inducere IL-32-ekspression i en række undersøgelser [19], [20], [21], [22], især i bugspytkirtelkræft hvor dens pro- kræft rolle er fastslået. Derfor er disse undersøgelser antyder, at årsagen til den nedsatte IL-32-ekspression ved knock down af MIR-23b-3p er, at den også virker ekspressionen af ​​PI3-kinase og Akt. En software søgning på miR-23b-3p bindende sites på PI3-kinase og Akt blev videreført men vi ikke finde nogen beviser for, at PI3-kinase og Akt er direkte mål for miR-23b-3p.

Genistein (40,5,7-trihydroxyflavone), en af ​​de vigtigste soja isoflavoner, har en bred vifte af kemoforebyggende handlinger. Anticancer effekter af genistein er blevet tilskrevet adskillige signalveje og mekanismer, der påvirker cellecyklusstop, apoptose, invasion, metastase og angiogenese, egenskaber, der potentielt forhindre tumor initiering og progression [23], [24]. Genistein er rigeligt i sojaprodukter og er blevet identificeret som en inhibitor af proteintyrosinkinaser og kan således spille en central rolle i cellevækst og apoptose [25], [26]. Det er blevet rapporteret at have østrogene egenskaber og anti-neoplastisk aktivitet i flere forskellige tumortyper [27]. I en tidligere undersøgelse Hillman et. al. har vist, at kombinationen af ​​genistein med primær tumor bestråling virker effektivt som et terapeutisk tilgang, i etablerede nyre tumorer, grundet tumorvækst inhiberes ved både den primære og metastatiske steder. I deres undersøgelse genistein alene havde en tendens til at stimulere væksten af ​​primær nyre tumor og øge metastaser [28]. Således disse resultater fik os til at overvåge ekspressionen af ​​miRNA-23b-3p efter behandling af de A-498 celler med forskellige koncentrationer af genistein. Vi fandt et fald i ekspressionen af ​​MIR-23b-3p 50% efter behandling af A-498 celler med 25 uM genistein i 96 timer (figur 8). I en tidligere undersøgelse [29] rapporterede vi også et fald på MIR-21 ekspression i muse xenotransplantattumorer dannet efter injektion af 25 uM genistein behandlet A-498-celler subkutant i nøgne mus sammenlignet med mindre tumorer dannet af ubehandlede A-498-celler. Vi målte også udtryk for miR-23b-3p i disse tumorer og kunne ikke finde nogen væsentlig ændring i sit udtryk.

Sammenfattende miR-23b-3p er et onkogen i RCC og direkte hæmmer PTEN tumor suppressor gen. MIR-23b-3p kan således være nyttig som en nyrecancer diagnostisk markør og som et terapeutisk mål til behandling af renalcellecarcinom.

Materialer og metoder Salg

etiske retningslinjer

Formalin-fikseret, blev paraffinindlejrede (FFPE) nyrekræft prøver indhentet fra San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical center. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, og undersøgelsen blev godkendt af UCSF Udvalget om menneskelige Forskning (Godkendelsesnr: H9058-35751-01).

cellelinjer og Cell Culture

Menneskelig renal cancercellelinier a-498, ACHN, Caki-1, Caki-2, og en normal nyrecellelinie (HK-2) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Integritet af cellelinierne blev bekræftet ved ATCC under anvendelse af DNA (STR) profilering. Normale renale HK-2-celler blev dyrket som et monolag i keratinocyt serumfrit medium (K-SFM) suppleret med 0,05 mg /ml bovin hypofyse (BPE), 5 ng /ml human rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF) (Life Technologies /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, USA), 50 mg /ml penicillin og 50 mg /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De renale cancercellelinjer A-498 og ACHN blev dyrket som et monolag i Eagles Minimum Essential Medium, (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, USA). Caki-1 og Caki-2 blev dyrket på samme måde i McCoy’s5A medier (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, USA). Alle cellelinjer blev opretholdt i en inkubator med en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO2 ved 37 ° C.

Genistein Behandling af A-498 Celler

A-498 celler (60 -70% konfluente) blev behandlet med genistein (25 uM og 50 uM). Genistein (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) blev opløst i DMSO, og celler behandlet med vehikel (DMSO) tjente som kontrol. Frisk genistein blev administreret hver dag med en ændring af medium, og cellerne inkuberes i 4 dage.

kvantitativ real-time PCR

I realtid polymerasekædereaktion (PCR), komplementært DNA var amplificeret med lageropgøres-assayet Produkter indeholdende to genspecifikke primere og én TaqMan MGB probe (6-FAM farvestof-mærket) ved hjælp af en TaqMan Universal Fast PCR Master Mix i en 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA , USA). Termiske cyklingsbetingelser omfattede 95 ° C i 20 sekunder (s), 40 cykler ved 95 ° C i 3 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder efter TaqMan Fast Universal PCR-protokol. Samlede microRNA blev ekstraheret ved anvendelse af et miRNeasy kit fra Qiagen (Valencia, CA, USA). For miRNA realtid eksperimenter cDNA streng blev syntetiseret under anvendelse af en Applied Biosystems Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), med 200 ng af det samlede ekstraherede miRNA. RNU48 blev anvendt som en endogen kontrol. Den blev også brugt som en endogen kontrol for real-time PCR-forsøg, hvor miRNA blev isoleret fra formalin-fikserede paraffin-indstøbt (FFPE) nyre prøver. Total miRNA blev ekstraheret fra FFPE prøver ved hjælp af en miRNA FFPE kit fra Qiagen.

Micro Dissektion af nyrekræft væv og RNA Udsugning fra FFPE Menneskelig Renal tumorprøver

Tilstødende normale og kræft nyrevævet blev opnået fra 29 repræsentative FFPE væv blokke af radikale nefrektomi prøver fra Patologi Department of Veterans Affairs (VA) Medical center i San Francisco. Blokkene var fra patienter nyre kræft, som blev opereret på VA Medical Center mellem 1980-2009. Sektioner (4 pm) af blokkene var forberedt, H 50 mmol l-1 Tris (pH 8,0), 150 mmol l-1 NaCl, 0,5% deoxycholat, 0,1% SDS og 1,0% NP-40) indeholdende en proteasehæmmer cocktail (Roche, Basel, Schweiz). Protein-assays blev udført under anvendelse af et BCA Protein assay kit (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) ifølge producentens anvisninger. Totalt protein (40 ug) blev elektroforesebehandlet i 12% SDS-PAGE geler og Western blotting blev udført under anvendelse af standardprotokoller og proteiner detekteret ved kemiluminescens. Antistoffer, herunder PTEN (kat. Nr. 9552S) og Akt (kat. Nr. 4691S) blev indkøbt fra Cell Signaling (Danvers, MA, USA), PI3-kinase (katalog nr. Ab69870) og IL-32 (cat no. ab62580) var fra Abcam (Cambridge, MA, USA), hvorimod GAPDH (kat. nr. sc-32233) var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).

proteinet ekspressionsniveauer blev kvantificeret ved optisk densitometri hjælp ImageJ Software version 1.36b (https://rsb.info.nih.gov/ij/). Fold ændring blev beregnet som forholdet mellem den netto intensiteten af ​​hver prøve transficeret med anti-MIR-23b-3p divideret med GAPDH og den negative kontrol transficerede prøver divideret med GAPDH (Anti-MIR-23b-3p transficerede prøver /GAPDH) /(Neg kontrol miR transficerede prøver /GAPDH).

Luciferase Reporter Assay

Celler i plader med 24 brønde blev transficeret med 30 nM pre-miR negativ kontrol (NC) eller præ-mIR-23b -3p (Applied Biosystems) og PTEN konstrukt (katalog nr. HmiT015535, Genecopoeia, Rockville, MD, USA) eller kontrol-konstruktionen, pEZX-MT01 (Genecopoeia) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Styringen konstruktion manglede MIR-23b-3P målsteder. Alle transfektionsforsøg blev udført tre gange. Luciferaseaktivitet blev analyseret ved 48 timer efter transfektion under anvendelse af en dual-luciferase reporter assaysystem (Promega).

Immunhistokemi

Immunfarvning blev udført på nyrekræft væv slides [fremstillet af formalin-fikseret, paraffinindstøbte (FFPE) renalcellecancer væv blokke ved hjælp af en mikrotom (Leica)]. Objektglassene blev deparaffineret og antigen-genvinding blev udført ved mikrobølgeopvarmning objektglassene i 10 mmol /l natriumcitrat-buffer. Objektglas blev inkuberet natten over med anti-PTEN antistof (cellesignalering). Farvningen blev udført ved hjælp af LABVISION Corporation (Thermo Fisher Scientific) Anti-kanin Farvning System (LOT-RHD 80.924) i henhold til producentens anvisninger.

Statistisk analyse

blev udført Statistisk analyse ved hjælp StatView-version 5.0 til Windows. T-test blev anvendt til at sammenligne de forskellige grupper. p-værdier for 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Chi-square test blev udført for at bestemme korrelationen mellem miR-23b-3P ekspressionsniveauerne og PTEN proteinekspressionsniveauer i vævsprøver.

Tak

Vi takker Dr. Roger Erickson for støtte og bistand med udarbejdelsen af ​​manuskriptet.