PLoS ONE: Filtration Anordning til On-Site Collection, opbevaring og forsendelse Celler fra urin og dens anvendelse til DNA-baseret detektion af blærekræft

Abstrakte

Molekylær analyse af celler fra urin giver en bekvem tilgang til ikke-invasiv påvisning af blærekræft. Den praktiske anvendelse af urin cellebaserede prøver vanskeliggøres ofte af vanskeligt ved at håndtere og analysere store prøvevolumener, behovet for hurtig prøve behandling for at undgå nedbrydning af det cellulære indhold og lav følsomhed på grund af en høj baggrund af normale celler. Vi præsenterer en filtrering enhed, der er designet til hjemmet eller point-of-care brug, som gør det muligt indsamling, oplagring og forsendelse af urin celler. Et særligt træk ved denne enhed er en aftagelig patronhus et membranfilter, som efter filtrering af urin kan overføres til en lagerenhed indeholder en passende konservering opløsning. I spiking eksperimenter, brugen af ​​denne anordning effektiv inddrivelse af blærekræft celler med eliminering af 99% af overskydende mindre størrelse celler. Ydeevnen af ​​anordningen blev yderligere vurderet ved DNA-baseret analyse af urin celler opsamlet fra 57 patienter underkastet transuretral resektion følgende fleksibel cystoskopi indikerer tilstedeværelsen af ​​en tumor. Alle prøver blev testet for

FGFR3

mutationer og syv DNA methylering markører (

BCL2

,

CCNA1

,

EOMES

,

HoxA9

,

POU4F2

,

SALL3

VIM

). I gruppen af ​​patienter, hvor en overgangsordning celle tumor blev bekræftet på histopatologisk vurdering, urin DNA var positiv for en eller flere markører i 29 ud af 31 tilfælde (94%), herunder 19 med

FGFR3

mutation (61% ). I gruppen af ​​patienter med benign histopatologi, urin DNA var positiv for methylering markører i 13 ud af 26 tilfælde (50%). Kun en patient i denne gruppe var positiv for en

FGFR3

mutation. Denne patient havde et stadium Ta tumor reseceret 6 måneder senere. Evnen til let at indsamle, lagre og sende diagnostiske celler fra urin ved hjælp af den præsenterede enhed kan lette ikke-invasiv test for blærekræft

Henvisning:. Andersson E, Dahmcke CM, Steven K, Larsen LK, Guldberg P ( 2015) Filtration Anordning til On-site Collection, opbevaring og forsendelse Celler fra urin og dens anvendelse til DNA-baseret detektion af blærekræft. PLoS ONE 10 (7): e0131889. doi: 10,1371 /journal.pone.0131889

Redaktør: Jorg Tost, CEA-Institut de Genomique, FRANCE

Modtaget: Oktober 1, 2014 Accepteret: 8 juni 2015; Udgivet: 7 juli 2015

Copyright: © 2015 Andersson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse modtaget tilskud støtte fra The Candy Foundation

Konkurrerende interesser:. KS og PG er navngivet opfindere på en patentansøgning indgivet af Cancer Research Technology Limited, som vedrører enhed, der beskrives i denne artikel: Offentliggørelse nummer WO2015036781; Ansøgning nummer PCT /GB2014 /052.776; Udgivelsesdato 19 Mar 2015. Dette patent ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker vedrørende datadeling og materialer.

Introduktion

Analyse af sjældne celler til stede i komplekse biologiske væskeprøver giver et potentielt magtfuldt diagnostisk og vurdering værktøj for en række sygdomme og tilstande. Især isolation, kvantificering og nedstrøms afprøvning af cancerøse celler til stede i patientens krop væskeprøver lover godt for ikke-invasiv detektion og karakterisering af tumorer til at guide diagnostiske og terapeutiske beslutninger. En fælles tilgang til kræftdiagnostik gennem minimalt invasiv prøvetagning er ved isolering af intakte tumorceller eller celle-fri tumor DNA fra perifere blodprøver [1,2]. Evnen til at analysere cirkulerende tumor-afledt materiale er blevet hurtigt frem med store teknologiske udvikling og opdagelsen af ​​meget informative biomarkører, herunder nogle, der repræsenterer mål for præcision kræftbehandling [3].

For urologiske kræftformer såsom blære cancer, urin tilvejebringer en mere bekvem kilde til diagnostisk materiale. Celler kaste fra tumorer beliggende i urinvejene ophobes i blæren og kan indsamles og analyseres ikke-invasivt ved urinopsamling [4]. Urin cytologi har været meget anvendt til at diagnosticere urologiske kræftformer, især som et supplement til cystoskopi til påvisning og overvågning af blærekræft. Men for lav kvalitet blæretumorer, cytologi har en følsomhed så lav som 10-20% [5], og er blevet forladt af mange centre. Adskillige urin test for blærekræft er blevet godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA), men deres præstationer er stadig ringere cystoskopi i form af følsomhed (sand positiv rate) og specificitet (sand negativ rate) [6]. Større ydeevne kan opnås ved hjælp genbaserede urin biomarkører såsom driver mutationer og DNA-methylering ombygninger, som er kræft specifikke og mindre påvirket af inflammation og andre benigne tilstande [7-12]. Med fremkomsten af ​​forbedrede metoder til påvisning og kvantificering af sjældne DNA-molekyler, herunder næste generation sekventering og digital PCR [13], følsomhed DNA-baseret detektion af blæretumorer kan hæves yderligere.

Trods sin løfte, anvendelse af urin cellebaserede assays til påvisning af blærecancer er begrænset af iboende krav til indsamling og behandling af urinprøver. Den mest almindelige procedure til analyse af cellulære indhold af urin involverer sedimentering af cellerne ved centrifugering. For at undgå cellelysering og nedbrydning af cellulære komponenter, bør prøverne behandles hurtigt efter tømning. Af disse praktiske årsager, er sampling normalt udføres på et dedikeret websted med specialudstyr og uddannet personale. Et andet vigtigt aspekt i forbindelse med udførelsen af ​​urin-baserede tests er den høje intra- og inter-individuel variation i alt urin celletal og forholdet mellem tumor-til-normal celler [14]. En høj baggrund af normale celler begrænser følsomheden af ​​de fleste påvisningsassays og kræver, at en større del af prøvematerialet analyseres for at øge chancen for at identificere tumorceller.

Den cellulære bestanddel af urin er stærkt heterogen, bestående af celler af forskellige typer og størrelser, såsom epitelceller, pladeceller og makrofager [15,16]. Vi [17] og andre [18-20] har tidligere vist, at præ-analytisk filtrering af urin under anvendelse af et membranfilter tilvejebringer et middel til indfangning og berige blære cancerceller fra urin. Med en porestørrelse på ca. 8 um, kan sådanne filtre indfange normale og maligne urothelial celler, der typisk har en diameter på 20 um, mens de eliminere nogle mindre størrelse celler. En typisk fremgangsmåde til filtrering, såsom den, der anvendes i vores tidligere undersøgelse [17], indebærer anvendelse af en engangssprøjte at tvinge urinen gennem et membranfilter monteret i en passende filterholder udstyret med et indløb og et udløb. Efter filtrering filtret fjernes med en pincet og overføres til et mikro-centrifugerør til umiddelbar forarbejdning eller fryser opbevaring. Denne procedure kræver træning, er ikke egnet til behandling af store mængder og indebærer risikoen for at miste materiale gennem spild og under håndtering af den fine filter membraner.

Vi præsenterer en filtrering enhed til prøveudtagning og opbevaring af celler fra store mængder af urin eller andre biologiske væsker. Efter filtrering kan filteret med indfangne ​​celler let fjernes fra filterindretningen og anbragt i et vandtæt lagerenhed, som indeholder en passende opløsning til fremstilling eller bevare de opfangede celler. Den lagerenhed kan derefter sendes til en test facilitet for passende nedstrøms analyse af den cellulære indhold. Vi demonstrerer brugen af ​​denne enhed til DNA-baseret karakterisering af patienter med benigne læsioner og maligne tumorer i blæren.

Materialer og metoder

Patienter og urinprøver

Urin prøver blev indsamlet fra patienter, hvor rutine fleksibel cystoskopi i ambulatoriet viste tegn på blære tumor og som efterfølgende blev nævnt transuretral resektion af blæren (TURB) på Rigshospitalet, Herlev, Danmark. Undersøgelsen omfattede både nydiagnosticerede patienter og patienter, der gennemgår rutinemæssig kontrol cystoskopi som opfølgning på tidligere diagnosticeret overgangsordning celle tumor i blæren. Prøver blev transporteret ved stuetemperatur til den danske Kræftens Bekæmpelse og behandles inden for 4-6 timer efter tømning. Undersøgelsen blev godkendt af Udvalget for Biomedical Research Ethics af Region Hovedstadens Danmark (H-2-2010-045), og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle fag, før undersøgelsen deltagelse.

Indsamling af celler og DNA-isolering

udtømt urin prøver (100-400 ml) eller suspensioner af dyrkede celler blev bearbejdet ved anvendelse af en filtreringsanordning (fig 1) monteret med en Nuclepore ætsede spor polycarbonat hydrofil membranfilter (diameter 25 mm, porestørrelse 8 um, Whatman, Maidstone, UK). Efter filtrering blev filterpatronen overført til opbevaring kassette, som derefter blev monteret med låget fra en Oragene DNA Self-Collection Kit indeholdende 1,7 ml lysis /stabilisering puffer (diskformat OG-250; DNA Genotek, Ottawa, Ontario, Canada). Ifølge producenten, DNA er stabil i denne opløsning i 5 år ved stuetemperatur. DNA blev oprenset fra 0,5 ml prøve ved hjælp af Oragene DNA rensende opløsning (DNA Genotek) ifølge ethanoludfældning protokollen tilvejebragt af producenten. Til opsamling af det totale cellulære komponent blev 25 ml urin centrifugeres ved 2.000 g i 10 minutter. Pelleten blev resuspenderet i 200 pi phosphatpufret saltvand (PBS) og opbevaret ved -80 ° C. DNA blev ekstraheret under anvendelse af Qiagen Mini Prep kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner (protokol for DNA oprensning fra væv). DNA udbytte blev estimeret ved kvantitativ realtids-PCR-analyse under anvendelse af et LightCycler 2.0-system (Roche, Mannheim, Tyskland), den FastStart DNA Master

PLUS SYBR Green I Kit (Roche), human genomisk DNA (Roche) som reference og følgende primere til

GAPDH

:. 5′-TAGTGTCCTGCTGCCCACAGTCCAG-3 ‘og 5′-GGCGACGCAAAAGAAGATGC-3’

anordningen består af en filtreringsenhed (a, individuelle komponenter; B, samlet enhed, C, efter filtrering) og en vandtæt opbevaring kassette (D, individuelle komponenter. E, samlet kassette)

Cell kultur og modelsystem

urothelial karcinom -afledte cellelinjer 639V og 97-7 var fra laboratoriet af Margaret A. Knowles og havnen de

FGFR3

p.R248C og p.S249C mutationer henholdsvis [21]. Celler blev holdt i DMEM-medium tilsat 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2. Lymfocytter fra en rask donor blev fremstillet fra perifert blod i overensstemmelse med en tidligere beskrevet protokol [22]. Celler blev frosset i AIM V-medium (Gibco) indeholdende 45% humant-plasmaafledt serum + 10% DMSO og opbevaret ved -80 ° C. Frosne celler blev optøet i et 37 ° C opvarmet vandbad, og udvindes i AIM V-medium ved 37 ° C i 30 minutter inden brug. Celler i suspension taltes og deres diameter blev målt ved anvendelse af en grevinde Automated Cell Counter (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Lymfocytter og carcinomaceller blev blandet i forskellige forhold i 100 ml PBS og behandles med filterindretningen.

Mutation analyse

Påvisning og kvantificering af

FGFR3

mutationer (s. R248C, p.S249C, p.G370C og p.Y373C) og tilsvarende vildtype-sekvenser blev udført ved dråbe digital PCR (ddPCR) ved anvendelse af QX200 systemet (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) og hydrolyseprobe assays ( PrimePCR ddPCR mutation Detection Analyser, Bio-Rad). PCR-blandingen indeholdt 11 pi ddPCR dråber Supermix for prober (ingen dUTPs), 1,1 pi mutation primer /probe mix (FAM), 1,1 pi vildtype primer /probe mix (HEX) og 2 pi DNA i et slutvolumen af 22 pi. Tyve mikroliter af denne blanding og 70 pi generation dråber olie blev overført til forskellige brønde af en generation dråber patron. Efter dannelse af dråber ved hjælp af dråber generator blev prøver overført til en 96-brønds PCR-plade og underkastet amplificering i 40 cykler ved 94 ° C i 30 sek. og 55 ° C i 60 sek. Dråber (i gennemsnit ~ 16.000 pr reaktion) blev analyseret på dråbens læseren, og Quantasoft software (version 1.4.0.99) blev anvendt til analyse af DNA-koncentrationer. Cutoff indstillinger blev bestemt under anvendelse mutation-positive og negative kontrol-DNA-prøver. For urinprøver behandlet både ved filtrering og sedimentering, blev ækvimolære mængder af DNA anvendt som template.

DNA methyleringsanalyse

DNA (op til 500 ng) blev behandlet med bisulfit under anvendelse af EZ DNA-methylering -guld Kit (Zymo Research Corp, Orange, CA, USA), elueret i 20 pi M-elueringspuffer og opbevaret ved 80 ° C. Kvantitativ analyse af methylering niveauer på promoter CpG øer

BCL2

,

CCNA1

,

EOMES

,

HoxA9

,

POU4F2

,

SALL3

VIM

blev udført ved hjælp af TaqMan-baseret real-time PCR (MethyLight) analyser, ved hjælp af tidligere beskrevne primere, prober og betingelser [17]. Reaktioner blev udført på LightCycler 480 platformen ved hjælp LightCycler 480 Probes Master Kit (Roche, Mannheim, Tyskland) og 1 pi behandlet med bisulfit DNA pr reaktion.

In vitro

methyleret DNA (IVM; CpGenomeTM Universal Methyleret DNA, Chemicon /Millipore, Billerica, MA) og hel-genom amplificeret DNA tjente som positive og negative kontroller til methylering, henholdsvis. Methylering niveauer blev beregnet som procent methyleret reference (PMR, Ref. [23]) ved at normalisere markør-specifikke reaktion værdier til

ALUC4

værdier i forhold til de samme værdier for fuldt methyleret kontrol (IVM). Prøver med en koncentration under hvad der svarer til 0,25 ng /pl non bisulfit-behandlet DNA blev udelukket. For hver markør blev afskæringsværdi over hvilken en prøve blev betragtet som positive bestemt ved analyse af DNA fra filtreret urin fra 11 raske kontroller [17]. Cut-off PMR-værdier for

HoxA9

,

POU4F2

,

SALL3

VIM

var 3, 2, 0,5 og 2, henholdsvis mens der ikke baggrund forstærkning blev observeret for

BCL2

,

CCNA1

EOMES

.

Resultater

Oversigt over filtrering enhed

prototype af filterindretningen og dets individuelle bestanddele er vist i figur 1. det hele enheden omfatter enheden 1) en filtreringsenhed til filtrering af en biologisk fluidprøve, 2) et aftageligt filter patron indeholdende et filter egnet til indfangning af relevant materiale og 3) en opbevaringsenhed til fremstilling og /eller konservering filteret indhold. Filtreringsenheden har et opsamlingskammer, et reservoir affald, og et filter support platform huser den aftagelige filterpatronen (Fig 1A). Disse tre dele er forbundet til at tillade passage af et fluidum fra opsamlingskammeret ind i reservoiret affald gennem filteret af filterpatronen (Fig 1B). Opsamlingskammeret består af et cylindrisk pose omgivet af en skruefjeder, som kan manuelt komprimeres til at generere et tryk, der tvinger væske gennem filtret (fig 1C). Filterstøtteenheden platform indeholder en ventil, der er frigivet ved højt tryk, hvis filteret bliver tilstoppet af materiale, der muliggør direkte passage af fluidum fra opsamlingskammeret i reservoiret affald. Reservoiret affald indeholder absorberende materiale nødvendig for at afsætte enhed og væske affald. Prototypen af ​​denne indretning er designet med en maksimal fluid kapacitet på 500 ml til at rumme og bearbejde hele urin hulrum.

Efter filtrering kan filterpatronen med filter fjernes fra filtreringsenheden og indsat i opbevaringsenheden (fig 1D). Låget af lagerenhed indeholder en passende behandling eller opbevaring løsning, der er udgivet på filteret, når låget er monteret. Når beskæftiget med filterpatron og låg, opbevaring enhed danner en forseglet samling, der let og sikkert kan transporteres (Fig 1E). Efter modtagelsen af ​​en analytiker, kan det opfangede biologiske materiale let hentes fra lagerenheden ved fjernelse af låget.

Evaluering af enhedens funktion

Som et modelsystem til at evaluere evnen hos anordning til at fange og optælle tumorceller fra væskeprøver, brugte vi den 639V urothelial karcinom cellelinje, som har en punktmutation (p.R248C) i genet, der koder fibroblast vækstfaktor receptor 3 (

FGFR3

) med tab af det tilsvarende vildtype-allel (S1 fig). I det første sæt eksperimenter, 100 ml PBS indeholdende mellem 1,000 og 5 × 10

6 639V-celler (diameter, 11-18 um) blev tilsat til opsamlingskammeret af indretningen, og tvinges gennem et polycarbonat membranfilter med en porestørrelse på 8 um. For at kvantificere antallet af celler fanget på filteret, vi ekstraheret totalt DNA og bestemmes antallet af mutant

FGFR3

molekyler under anvendelse af en dråbe digital PCR (ddPCR) assay. I denne indstilling, en positiv begivenhed svarer til en celle. Positive signaler blev reproducerbart opnået for alle prøver, når 2 pi (4%) af det ekstraherede DNA blev anvendt som template for ddPCR (Fig 2A). Især for den laveste koncentration af celler (1.000 i 100 ml), opsvinget var ~ 70% (fig 2B). Ved højere koncentrationer af celler, der var et fald i recovery rate, ned til ~ 5% ved 5 × 10

6 celler /100 ml. Denne lavere helbredelse var forventet som mætning af filteret vil forårsage frigivelse af trykventilen og en direkte strøm af den resterende væske og dets cellulære indhold i reservoiret affald. Denne første afprøvning antydede, at filtreringen indretning kan anvendes til effektivt at indfange blære cancerceller fra et fluid, og at opsvinget er særlig høj ved lave koncentrationer af celler, hvor kapaciteten af ​​filteret er endnu ikke nået.

PBS (100 ml) indeholdende mellem 1,000 og 5 × 10

6 639V-celler blev behandlet på en anordning monteret med et 8-um porestørrelse polycarbonat membranfilter. DNA blev ekstraheret fra filtrene og testet for mutant

FGFR3

(p.R248C) molekyler ved hjælp ddPCR. DNA fra normale perifere blod-lymfocytter blev anvendt som en kontrol for vildtype

FGFR3

. A, ddPCR fluorescens amplitude plot. Lodrette linjer repræsenterer manuelt indstille cutoff indstillinger. De viste resultater er fra en af ​​to uafhængige forsøg. B, søjlediagram, der viser antallet af genvundne celler (beregnet på grundlag af mutant

FGFR3

molekyler) i forhold til antallet af input celler. Totale tællinger af mutante molekyler blev beregnet på grundlag af tre uafhængige ddPCR tests, der hver måler mutantmolekyler i 4% af den samlede DNA-prøve. Data af tredobbelte målinger (hver på 4% af totalt DNA) fra ét forsøg er repræsenteret som middelværdi ± SD. Procenter over søjler repræsenterer antallet af indvundne celler i forhold til antallet af input-celler.

For at teste evnen af ​​filtreringsindretningen at forøge koncentrationen af ​​blærekræft celler til stede i en baggrund af mindre rumfang normale celler, vi spiket mellem 1.000 og 50.000 639V-celler i 100 ml PBS indeholdende 10

7 normale oprensede dyrkede humane lymfocytter (diameter, 7-8 um) og forarbejdet suspensionen op filterindretningen. Analyse af DNA ekstraheret fra filtre ved ddPCR viste signaler til både mutant (p.R248C) og vildtype

FGFR3

(Fig 3A). Vigtigst, genfindingsprocenten for mutant DNA svarede til der opnås med rene opløsninger af 639V-celler (Fig 3B). Selvom behandling af prøver ved filtrering elimineres de fleste lymfocytter ( 99%), der var en konsistent baggrund af vildtype

FGFR3

alleler (fig 3), som kan være afledt af resterende monocytter (diameter, 15-25 um) til stede i lymfocyt præparater.

mellem 1.000 og 50.000 639V-celler blev tilsat til 10

7 normale lymfocytter i 100 ml PBS, og suspensionen blev bearbejdet ved anvendelse filterindretningen. DNA blev ekstraheret fra filtrene og testet for mutant (p.R248C, mut) og vildtype (WT)

FGFR3

hjælp ddPCR. A, ddPCR fluorescens amplitude plots af

FGFR3

R248C-FAM sonde fluorescens signal (blå, øverste panel) og

FGFR3

WT-HEX sonde fluorescens signal (grøn, lavere panel). Lodrette linjer repræsenterer manuelt indstille cutoff indstillinger. De viste resultater er fra en af ​​to uafhængige forsøg. B, søjlediagram, der viser antallet af genvundne celler (beregnet på grundlag af mutant og WT

FGFR3

molekyler) i forhold til antallet af input tumorceller. Total tællinger af

FGFR3

molekyler blev beregnet på grundlag af tre uafhængige ddPCR tests, hver bruger 4% af den samlede DNA som skabelon, og er repræsenteret som middel ± SD. Procenter over søjlerne repræsenterer antallet af indvundne celler i forhold til antallet af input-celler.

At evaluere variabiliteten af ​​resultaterne, vi filtreres 100 ml PBS indeholdende 500, 1.000 eller 5.000 97-7 celler (diameter, 18-25 um), hver med 3-5 datapunkter fra tre uafhængige forsøg. DNA blev isoleret, og antallet af mutant

FGFR3

(p.S249C) molekyler blev kvantificeret under anvendelse ddPCR. I denne model, intra-prøve variation var generelt lav og faldt med større celle nummer (S2 Fig).

Påvisning af blærecancer i urinprøver

Vi næste evaluerede enhedens ydeevne ved at behandle urin indsamlet fra 59 patienter umiddelbart før TURB. Alle patienter havde vist tegn på blære tumor, når først undersøgt ved fluorescens-vejledt fleksibel cystoskopi. På grundlag af histopatologiske evaluering af biopsier, 33 af patienterne blev diagnosticeret med blæretumorer, mens de resterende 26 patienter havde benigne læsioner eller normal blære epitel. Tabel 1 og 2 viser de demografiske og patologi data for disse patienter. De fleste tumorer var invasiv (stadie Ta; 73%), en var en papillære urotelial neoplasma af lav malignt potentiale (PUNLMP), to blev klassificeret som tumor in situ (Tis), fire var stadie T1 og to var scenen T2. Tyve tumorer (61%) var lav kvalitet.

For at teste, om filtrering kunne øge forholdet mellem normal-til-tumor celler, vi først testet 13 urinprøver i et split- setup prøve, hvor 25 ml af hver prøve blev sedimenteret ved centrifugering, og resten blev behandlet ved filtrering. DNA isoleret fra alle filtrer og sedimentprøver blev screenet for fire fælles

FGFR3

mutationer (p.R248C, p.S249C, p.G370C og p.Y373C) ved hjælp af ddPCR. Otte af prøverne (58%) var positive for en af ​​disse mutationer (tabel 1). Kvantitativ analyse ved anvendelse af ækvimolære mængder af total DNA fra filtre og sedimenter viste, at forholdet mellem mutant-til-vildtype DNA var højere i de filtrerede prøver end i de tilsvarende sedimenter (tabel 3). Mest vigtigt blev de største berigelser (6,5 og 8,0 gange, henholdsvis) opnået for de to prøver, der repræsenterer de laveste mutant-til-vildtype-forhold (figur 4).

Urinprøver fra patienter med blæretumorer var inddelt i to fraktioner og behandles af indretningen filtrering og sedimentering, hhv. Ækvimolære mængder af DNA fra filtre og sedimenter blev testet for

FGFR3

mutationer ved hjælp ddPCR.

Alle resterende urinprøver blev behandlet ved filtrering alene, og DNA blev ekstraheret og undersøgt for

FGFR3

mutationer ved hjælp ddPCR og syv DNA-methylering markører (

BCL2

,

CCNA1

,

EOMES

,

HoxA9

,

POU4F2

,

SALL3

og

VIM

) ved hjælp MethyLight analyser. Adskillige undersøgelser af blærekræft har rapporteret høje følsomheder ( 50%) og særlige ( 90%) for disse markører i blæretumorer [7,8,24], og som et panel, de gav en følsomhed på 94% [17 ].

Den mediane DNA udbytte fra urinprøver fra 33 patienter med blæretumorer var 138 ng (interval 6,3 til 3600 ng). I to prøver fra patienter med lav-grade Ta tumorer, mængden af ​​DNA efter bisulfit-behandling var utilstrækkelig til at muliggøre analyse af hele biomarkør panel. Tabel 1 viser resultaterne for de resterende 31 prøver. Nitten af ​​prøverne indeholdt

FGFR3

mutationer (61%), med hovedparten af ​​mutationer være p.Y373C (50%) og p.S249C (45%). En prøve indeholdt p.Y373C og p.S249C. I alt 118 promotor hypermethyleringsassocierede hændelser blev identificeret i 29 prøver (94%), med et gennemsnit på 4,1 hændelser (interval 1-7) pr prøve. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser [8,17], den højeste følsomhed blev opnået med

VIM

, som var positiv i 81% af tilfældene. De seks andre markører havde følsomheder spænder fra 74% (

HoxA9

) til 29% (

EOMES

). De to prøver er negative for alle mutation og methylering markører var fra en patient med PUNLMP og en patient med en low-grade Ta tumor, henholdsvis.

Den mediane DNA udbytte fra urinprøver indsamlet fra de 26 patienter med en godartet histopatologi var 271 ng (interval 21 til 1605 ng). I alt 30 promotor- hypermethyleringsassocierede hændelser blev identificeret i 13 prøver (50%), med et gennemsnit på 2,3 hændelser (interval 1-5) pr prøve. De resterende prøver var negative for alle markører. Profilen af ​​positive markører i denne patientgruppe var anderledes end hos patienter med tumorer, med

SALL3 Hotel (26%),

CCNA1 Hotel (22%) og

POU4F2

(19%) er den mest hyppige. Positive methylering markører blev fundet i 8 ud af 12 patienter (67%), som tidligere var blevet behandlet for blærekræft og blev optaget til opfølgning, og i 5 ud af 14 patienter (36%), der havde ingen forudgående historie for blærekræft . Kun én af patienter med benign blære patologi havde en

FGFR3

mutation påvises i urinen. Denne patient var også positive for fem methylering markører og blev diagnosticeret med en low-grade Ta tumor ved gentagen cystoskopi 6 måneder efter den negative TURB.

Diskussion

Vi har udviklet og afprøvet en filtrering enhed giver nem og billig indsamling og behandling af diagnostiske celler fra urin. Anordningen kan anvendes af patienter eller sundhedspersonale til at levere en prøve af celler, der er egnede til DNA-analyse. Bufferen i lagerenhed sikrer langsigtet stabilitet af DNA ved stuetemperatur, hvilket giver rigelig tid til at sende prøven til et testanlæg ved hjælp af standard postsystem. Den enkle procedure for at give urin celler kan i høj grad reducere behovet for direkte kontakt mellem patient og sundhedssystemet, og kunne være en attraktiv mulighed i lave ressource indstillinger, hvor cystoskopi ikke kan tilbydes som en standard til påvisning blærekræft. Fokus i denne undersøgelse var på blærekræft, men den samme fremgangsmåde kan anvendes på andre urogenitale kræftformer, såsom øvre urinveje tumorer [4] samt andre tilstande, hvor analyse af urin celler har diagnostisk, prognostisk eller terapeutisk værdi.

standardtilsætningsforsøg, demonstrerede vi, at filterindretningen var i stand til at opfange tumorceller samtidig fjerne et stort overskud af mindre størrelse celler. En analyse af urinprøver fra patienter med blærecancer viste, at filtrering steg forholdet mellem tumor-til-normal celler sammenlignet med sedimentering af cellerne ved centrifugering, især for prøver, hvor dette forhold var lavt. Det bemærkes dog, at genopretning og berigelse af celler ved filtrering afhænger af en række variabler, herunder celle egenskaber (f.eks størrelse og formbarhed), filter egenskaber (f.eks porestørrelse, antal porer, afstand mellem porer og filter materiale) [25] og filtrering parametre (f.eks, strømningshastighed og tryk over filteret) [26].

Blandt patienter, som havde en blære tumor bekræftet ved histopatologisk undersøgelse, urin DNA var positiv i mindst en af de testede biomarkører (

FGFR3

mutationer og promotor hypermethyleringsassocierede begivenheder) i 94% af tilfældene. Dette tal var opmuntrende i betragtning, at størstedelen af ​​patienterne i denne kohorte præsenteret med små ikke-invasive tumorer, der generelt er vanskeligt at påvise i urin, fordi de kaster relativt få celler [27]. Alligevel er større prospektive undersøgelser kræves for yderligere at vurdere potentialet af denne tilgang til påvisning af blærekræft i en diagnostisk indstilling. Den høje følsomhed til detektion af blæretumorer opnået i denne undersøgelse, kan i det mindste delvis tilskrives de store mængder (helt hulrum) af urin forarbejdet. Zuiverloon et al. [14] viste, at følsomheden af ​​dna-baseret detektion af blæretumorer forholdsmæssigt ved at forøge mængden af ​​urin og den mest pålidelige test blev opnået på grundlag af en 24-timers opsamling af urin celler, svarende til standard procedurer for samling af rå urin til diagnosticering af andre forhold såsom porfyri og nyreinsufficiens. I denne henseende kan den enhed, der beskrives her, lette hyppig og gentagen prøvetagning.

Næsten halvdelen af ​​patienterne udsættes for TURB skyldes tegn på tumor ved rutinemæssig fleksibel cystoskopi fandtes ikke at huse overgangsordning celle tumor i biopsiprøver . Interessant urinprøver fra halvdelen af ​​disse patienter var positive for et eller flere DNA-methylering markører, trods disse markører var negativt i urin fra raske individer. Tidligere undersøgelser har demonstreret promotor hypermethylering i normalt udseende urothelium fra patienter med blærecancer [28], hvilket indikerer en epigenetisk ‘felt defekt “. Andre undersøgelser har vist, at der kan påvises DNA-methylering biomarkører i urin år efter resektion af en blære tumor trods manglen på tilbagefald [29,30]. Epigenetisk ændret pletter af urothelium fænotypisk skelnes fra normal urothelium kan repræsentere prækursorer læsioner for blærekræft og kan forklare den høje gentagelse sats. Derfor er det muligt, at patienter med DNA-methylering markører påvises i urinen kan have øget risiko for at udvikle blærekræft senere i livet. I modsætning til den høje forekomst af

FGFR3

mutationer i urin fra patienter med bekræftet blære tumor (67%), kun én af de patienter med benign histopatologi havde en

FGFR3

mutation påvises i urinen. Interessant nok blev denne patient diagnosticeret med en blære tumor halvt år senere, tyder på, at urinen DNA-test kan opdage nogle blæretumorer på et tidligere tidspunkt end den TURB procedure.

filtrering enhed effektivt fanger celler fra store mængder af urin og koncentrater og gemmer dem til praktisk forsendelse og nedstrøms test.