PLoS ONE: Variation i cellesignalering Protein Expression kan indføre Sampling Bias i Primary epithelial kræft i æggestokkene

Abstrakt

Selv om ekspressionen af ​​cellesignalering proteiner bruges som prognostisk og prædiktiv biomarkør, variabilitet af protein niveauer i tumorer er ikke godt undersøgt. Vi vurderede intratumoral heterogenitet af protein udtryk inden primær kræft i æggestokkene. Proteiner i fuld længde blev ekstraheret fra 88 formalinfikserede og paraffinindlejrede prøver af 13 primære high-grade serøse ovariecarcinomer med 5-9 prøver hvert væv. Derudover 14 prøver af normal æggeleder epitel tjente som reference. Kvantitative omvendt fase proteinarrays blev anvendt til at analysere ekspressionen af ​​36 cellesignalering proteiner, herunder HER2, EGFR, PI3K /Akt, og angiogene veje samt 15 aktiveret (phosphorylerede) proteiner. Vi fandt betydelig intratumoral heterogenitet i ekspressionen af ​​proteiner med en gennemsnitlig variationskoefficient på 25% (interval 17-53%). Omfanget af intratumoral heterogenitet afveg mellem proteiner (p 0,005). Interessant var der ingen signifikante forskelle i graden af ​​heterogenitet mellem phosphorylerede og ikke-phosphorylerede proteiner. Til sammenligning vurderede vi variationen af ​​proteinniveauer blandt tumorer fra forskellige patienter, som afslørede en lignende gennemsnitlige variationskoefficient på 21% (interval 12-48%). Baseret på hierarkisk klyngedannelse, prøver fra den samme patient grupperet tættere sammen end prøver fra forskellige patienter. Imidlertid blev en klar adskillelse af tumor versus normale væv ved klyngedannelse kun opnås, når betyde udtryk værdier for alle individuelle prøver pr tumor blev analyseret. Mens differentiel ekspression af nogle proteiner blev detekteret uafhængigt af prøveudtagningsmetode anvendes, de fleste proteiner kun påvist differentiel ekspression når middelværdier ekspressionssystemer værdier af flere prøver pr tumor blev analyseret. Vores data viser, at vurdering af etablerede og nye celle signalering proteiner som diagnostiske eller prognostiske markører kan kræve sampling af serøse ovariecancer på flere forskellige steder for at undgå prøvetagning skævhed

Henvisning:. Mittermeyer G, Malinowsky K, Beese C, Höfler H, Schmalfeldt B, Becker KF, et al. (2013) Variation i Cell Signaling Protein Expression kan indføre Sampling Bias i Primary epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 8 (10): e77825. doi: 10,1371 /journal.pone.0077825

Redaktør: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Center for Bioteknologi, Indien

Modtaget: Juli 4, 2013; Accepteret: September 5, 2013; Udgivet: 28 oktober 2013

Copyright: © 2013 Mittermeyer et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af interne tilskud fra Patologisk Institut og Institut for Obstetrik og Gynækologi. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den anden mest almindelige gynækologisk malignitet og den med den højeste dødelighed i den vestlige verden [1]. Under tidlige stadier af sygdommen er for det meste asymptomatisk og dermed de fleste patienter er diagnosticeret med fremskredne stadier resulterer i en dårlig fem år samlet overlevelse på mindre end 40% [2]. Standard behandling til patienter med kræft i æggestokkene er kirurgi efterfulgt af platin og taxan baseret kombinationskemoterapi. Selv om de fleste patienter viser første reaktion på kemoterapi, de fleste efterfølgende udvikler resistens og 50-75% af patienterne tilbagefald inden for fem år [3]. Vurderingen af ​​celle signalering proteiner giver mulighed for at identificere potentielle nye lægemiddelkandidater samt at forudsige respons på behandling og støtte i individualiserede behandling beslutninger [4]. For at fungere som en biomarkør for en optimeret målrettet terapi nærmer identifikation og kvantitativ analyse af mål strukturer og /eller respektive nedstrøms signalering kaskader er af stor relevans. Men potentielle intratumoral heterogenitet celle signalering proteinekspression kan indføre en sampling bias og er ikke blevet grundigt vurderet i kræft i æggestokkene.

En række celle signalering proteiner er blevet tidligere identificeret som mulige terapeutiske mål eller som potentiel prognostisk eller prædiktive biomarkører. Disse omfatter VEGF, VEGFR, PDGFR, EGFR eller HER2, PI3K, Akt, mTOR og andre [5], [6], [7], [8]. Tilsvarende vigtigt er aktiveringen af ​​celle signalveje reflekteres af de phosphorylerede former af målet proteiner eller dele af deres respektive nedstrøms signalveje [9], [10], [11].

Det overordnede mål med denne undersøgelse var at vurdere niveauet af heterogenitet af cellesignalering proteinekspression i serøs kræft i æggestokkene. Vi analyserede 36 celle signalering proteiner, herunder 15 fosforylerede proteiner repræsenterer proliferation og angiogenese relaterede veje. Vi har desuden undersøgt de potentielle konsekvenser af heterogenitet på påvisning af differentiel proteinekspression mellem tumor og normalt væv eller mellem tumor undergrupper.

Til sammenligning har vi vurderet den fysiologiske variation af protein-ekspression i normalt serøs epitelvæv mellem forskellige patienter. Æggeleder epitel fra raske individer og fra ikke-involverede kontralaterale rør af cancerpatienter blev anvendt som reference væv, idet tidligere undersøgelser har vist, at serøse kræftformer er molekylært nærmest beslægtet med tubal epitel. Æggeleder epitelceller er blevet foreslået som cellerne oprindelsesbetegnelser for i det mindste nogle high-grade serøse carcinomer [12], [13].

Til analysen af ​​et stort antal prøver og target proteiner anvendes i dette undersøgelse, konventionel immunoblot metode er ikke egnet som man havde brug for mere end 3500 Western blot baner til at foretage en enkelt analyse af samtlige prøver og antistoffer. Omvendt fase-protein array (RPPA) muliggør den samtidige analyse af flere prøver til ekspression af flere proteiner under de samme eksperimentelle betingelser [14], [15]. Analyse af proteiner i dubletter og serielle fortyndinger muliggør reproducerbar kvantitativ påvisning af protein-ekspression. RPPA har åbenlyse sin gennemførlighed for analysen af ​​kryo bevarede kliniske prøver [16], [17], [18]. For nylig, vores gruppe og andre, fastslået, at RPPA teknologi også pålideligt tillader analyse af formalinfikserede og paraffinindstøbte (FFPE) vævsprøver [19], [20], [21], [22] og er et passende redskab til adresse protein heterogenitet inden sådanne prøver [23].

Materialer og metoder

vævsprøver

i alt 88 FFPE prøver fra 13 patienter med primær høj kvalitet serøs kræft i æggestokkene blev undersøgt. 14 prøver af normal æggeleder epitel, herunder 10 raske individer og 4 uengagerede kontralaterale rør fra kræftpatienter blev brugt som reference. En skematisk af patienten kohorte og udvælgelse af prøver er afbildet i figur 1.

I alle 13 tilfælde 5-9 vævsprøver var tilgængelige. I ti patienter med bilaterale tumorer blev prøver opnået fra begge æggestokke

H 70% og 10% inflammatoriske celler. Der var ingen signifikante forskelle i epiteltumor celleindholdet og tumor stroma eller inflammatoriske celleinfiltrater mellem prøver fra den samme patient. Desuden blev der ikke regionale forskelle identificeret i mitotisk aktivitet mellem prøver fra den samme patient.

intratumoralt Heterogenitet af protein niveauer

Alle 36 proteiner analyseret i denne undersøgelse viste betydelig intratumoral heterogenitet med en gennemsnitlig CV 25% (interval 17-53%) (tabel 1 og tabel S2). Omfanget af intratumoral heterogenitet afveg blandt de 36 proteiner analyserede (p = 0,005), med p4EBP1, pp44 /42 MAPK og VEGF viser højeste variabilitet, og EGFR, JNK /SAPK og p38MPK viser mindst variation inden for de enkelte tumorer. Der var ingen signifikant forskel i omfanget af intratumoral heterogenitet mellem phosphoryleret (gennemsnitlig CV 28%) og ikke-phosphoryleret (middelværdi CV 23%) proteiner (p = 0,252). Den intratumoral heterogenitet alle proteiner er sammenfattet i tabel S2. Figur 2 illustrerer intratumoral heterogenitet for de eksemplariske proteiner VEGF, VEGFR p1068EGFR og EGFR.

Box plots viser medianen (linje i boksen), 25. og 75. percentiler, og whiskers viser 1,5 gange interkvartile område.

variation af protein niveauer blandt patienter

variationen af ​​protein-ekspression blandt forskellige patienter svarede til omfanget af intratumoral heterogenitet med en gennemsnitlig CV på 21% (interval 12- 48%). Den inter-patient variation afveg betydeligt blandt de analyserede proteiner. Mens Hif1α, PDGF og PI3K demonstrerede lav variation mellem alle patienter analyseret, p4EBP1, pp44 /42 MAPK og p1068EGFR viste en meget høj inter-patient variation. Variation mellem forskellige patienter var ikke signifikant forskellig for phosphoryleret (gennemsnitlig CV 25%) og ikke-phosphoryleret (middelværdi CV 18%) proteiner (p = 0,072). Tabel S2 opsummerer variation blandt forskellige patienter for alle proteiner. Figur 2 illustrerer variation blandt patienter til de eksemplariske proteiner VEGF, VEGFR, EGFR og p1068EGFR.

interpatient variation af protein-ekspression blev også vurderet for normal serøs epitel af æggelederne fra sunde individer og for morfologisk normale kontralaterale rør af kræftpatienter. Den inter-patient variation af æggelederne epitel fra raske individer (middel CV 27%, interval 14-47%) svarede til inter-patient variation af kontralaterale rør fra kræftpatienter (betyder CV 31%, range 3-78%). Samlet, variation af normale serøs epitel blandt forskellige individer var i en lignende interval sammenlignet med variation mellem tumorer fra forskellige patienter (21%). Variabilitet var ikke forskellig mellem phosphorylerede og ikke-phosphorylerede proteiner i begge typer af henvisning væv. Resultaterne er sammenfattet i tabel 1.

Variation mellem enkelte tumorprøver vurderet af Hierarkisk Clustering

For at vurdere variationen mellem de enkelte tumorprøver vi udførte ikke-overvåget hierarkisk gruppering af alle 88 individuelt taget tumor prøver fra 13 patienter baseret på ekspressionen af ​​alle 36 proteiner analyseres (figur 3). Prøver fra den samme patient grupperet tættere sammen end prøver fra forskellige patienter. Alligevel blev prøverne af fire patienter (patienter 3, 4, 6, 11) spredt gennem alle klynger, og for de resterende patienter to eller flere prøver per patient ikke klynge med resten. Der var ingen patienter, for hvem alle prøver klynge (figur 3).

Forskellige patienter er farvekodede som angivet i figuren legende. Høj relative ekspression af proteiner er vist med rødt og lav ekspression i grøn farve. Grå rum indikerer manglende datapunkter.

relevans af heterogenitet for Distinction mellem Tumor Versus Normal Tissue

Gruppering af tumor versus normalt væv.

Vi vurderede indflydelse heterogenitet på molekylær klassifikation af forskellige vævsprøver som kræft eller normale baseret på hierarkisk klyngedannelse. Der var ingen klar adskillelse af tumor prøver versus normal serøs epitel ved brug alle individuelle tumorprøver pr sag (data ikke vist). I modsætning hertil analyse af middelværdier udtryk værdier for hver tumor resulterede i meget god adskillelse af normale og tumorvæv (figur S1).

Differential proteinekspression i tumor versus normale væv.

Vi næste vurderet forskelle i proteinekspression mellem kræft i æggestokkene og normal serøs epitel ved enten at overtage tilfældigt udvalgte enkelte prøver per sag eller betyde protein udtryk værdier. Analysen blev gentaget tre gange med tre forskellige tilfældigt valgte enkeltprøver per case og resultater blev sammenlignet med de, der opnås ved hjælp af betyde ekspressionsniveauer værdier pr tilfælde som referencestandard.

Seksten proteiner identificeret som differentielt udtrykt under anvendelse betyder udtrykket værdier af alle prøver pr tumor (AKT, Pakt, angiopoietin 2, B-Raf, p1068EGFR, p1148EGFR, FAK, pGSK-3β, pGSK-3β, HIF-1α, JNK /SAPK, mTOR, pmTOR, p38 MAPK, pPRAS40, PRAS40, PTEN , pPDGFR, S6RP) blev ikke påvist, når man analyserer tilfældigt udvalgte enkelte prøver per sag. Ti proteiner, nemlig pB-Raf, EGFR, HER2, 4E-BP1, pPTEN, pVEGFR, VEGF, VEGFR, pS6RP, og VHL blev identificeret som differentielt udtrykt af alle fire tilgange. PI3K og pHER2 blev identificeret som differentielt udtrykt kun i enkelte prøver. P-værdier for alle proteiner identificeret som differentielt udtrykt i mindst én tilgang er opsummeret i tabel 2.

Discussion

Vi fandt betydelig intratumoral heterogenitet i ekspressionen af ​​protein biomarkører relateret til celle signalveje i høj kvalitet serøs ovariecancer. Alle 36-proteiner analyseret ved omvendt fase-protein array (RPPA) viste en markant heterogenitet i primær ovariecancer med en gennemsnitlig variationskoefficient (CV) på 25% (interval 17-53%) inden for de enkelte tumor. blev fundet mellem forskellige patienter med en gennemsnitlig CV på 21% (interval 12-48%) En lignende grad af variation. Vores resultater antyder, at væsentlig prøveudtagning skævhed kan indføres ved analysering enkelt prøver af en primær tumor til vurdering af protein biomarkører. Selvom alle 36 kandidatlande proteiner viste betydelig intratumoral heterogenitet, det samlede omfang af heterogenitet var anderledes for specifikke proteiner med p4EBP1, pp44 /42 MAPK og VEGF viser højeste variabilitet og EGFR, JNK /SAPK og p38MPK viser mindst variabilitet. Der var ingen forskel i graden af ​​heterogenitet mellem phosphorylerede og ikke-phosphorylerede proteiner, hvilket antyder, at aktiverede former af celle signalering proteiner kan vurderes med tilsvarende pålidelighed.

En tidligere undersøgelse i brystcancer registreret en lignende grad af intratumoral heterogenitet i proteinekspression (gennemsnitlig CV 31%) [23]. I modsætning hertil variationen af ​​proteinekspression blandt forskellige patienter var betydeligt lavere i ovariecancer sammenlignet med brystcancer (gennemsnitlig CV 21% vs. 51%). En mulig forklaring er en mere homogen patientgruppe i vores undersøgelse, der udelukkende indeholder high-grade serøse carcinomer, der deler et fælles patogenetisk vej og derfor genetisk mindre heterogen end forskellige typer af brystkræft [28]. Den brystkræft undersøgelse omfattede forskellige morfologiske og molekylære undertyper, såsom hormon receptor positiv, Her2-positive og tredobbelt negative brystkræft, som kan have tegnede sig for en større variation i proteinekspression mellem tumorer fra forskellige patienter.

forekomsten af ​​forskellige tumor celle kloner er en potentiel kilde til intratumoral heterogenitet i proteinekspression. En nylig undersøgelse viste betydelig klonal intratumoral heterogenitet af ovariecancer baseret på selvfornyelse og tumordannende differentiering af tumorceller afledt af en enkelt ovarie- clear cell carcinoma [29]. En anden undersøgelse rapporterede klonede intratumoral heterogenitet og variation mellem primære tumorer og metastaser for tab af heterozygositet af kromosomer 17q og 18q i avancerede serøse ovariecarcinomer [30]. Tilsvarende blev omfattende klonal heterogenitet nylig påvist for renalcellekarcinom [31]. En omfattende analyse af tumorceller klonalitet ville kræve integrerede data for DNA, RNA og protein niveauer, som var uden for rammerne af denne undersøgelse. Men en enkelt forklaring på de betydelige variationer i ekspressionen af ​​celle- signalering proteiner, der findes i vores undersøgelse er mindre sandsynligt. High-grade serøse carcinomer er generelt kendetegnet ved en høj proliferativ og mitotisk aktivitet [28]. Selvom forskelle i tumorvækst og celledeling kan have til en vis grad bidraget til intratumoral heterogenitet, vi ikke identificere regionale forskelle i tumorcelleproliferation baseret på morfologisk vurdering af Mitoser. En anden potentiel forklaring på intratumoral heterogenitet er den cellulære sammensætning af serøse ovariecancere. Vi fandt imidlertid ingen signifikante forskelle i epitelial tumor celle indhold og tumor stroma eller inflammatorisk celle infiltrerer mellem prøver fra den samme patient.

Tidligere undersøgelser rapporteret en lavere grad af intratumoral variation af protein-ekspression i kræft i æggestokkene. To undersøgelser fra 1990’erne fundet lav variation af protein-ekspression mellem forskellige områder af 9 primære ovariecarcinomer [32] eller mellem primære og metastatiske steder af 12 epitelial ovariecancer [33] ved hjælp af to-dimensionel gelelektroforese og immunhistokemi, hhv. Men antallet af tumorer i begge studier var, relativt lille. En nylig serier, herunder 123 high-grade serøse ovariecarcinomer med parrede ovarietumorer og oment metastaser vurderet ekspression af ti proteiner ved immunhistokemi, herunder markører for tumor subtype, mikromiljø, og celleadhæsion [34]. Forfatterne viste, at hovedparten af ​​proteiner, herunder almindeligt anvendte diagnostiske markører, såsom p53, WT1, CA125, og p16 ikke viser signifikante forskelle i ekspression mellem primær ovariecancer og peritoneal eller oment metastaser. To markører for stromale tumor respons (PDGFRB, SPARC) viste markant forskellig ekspression mellem primær æggestokkene og metastatisk tumor prøver [28]. Men en direkte sammenligning af vores studie med tidligere rapporter begrænset af manglen på ensartede kriterier for vurdering af heterogenitet og mangel på statistiske foranstaltninger for intratumoral variation. Desuden har tidligere undersøgelser ofte sammenlignet primær ovariecancer og metastatiske læsioner mens vores undersøgelse udelukkende er fokuseret på variation inden for en enkelt primær cancer. En mulig forklaring på den højere grad af intratumoral heterogenitet i proteinekspression observeret i denne undersøgelse kan være mere omfattende prøvetagning af primære tumorer i æggestokkene i 5-9 forskellige steder, samt den højere kvantitativ opløsning af RPPA analyse.

for yderligere at vurdere variationen mellem de enkelte tumorprøver vi udførte ikke-overvåget hierarkisk klyngedannelse. Selvom vi havde observeret en lignende grad af heterogenitet inden for en tumor og mellem tumorer fra forskellige patienter baseret på variationskoefficient, prøver fra den samme patient grupperet tættere sammen end prøver fra forskellige patienter. Dette kunne tyde på, at på trods af en høj grad af heterogenitet i kvantitative protein udtryk værdier, en rangordning tilgang som gruppering kan være mindre påvirket. Ligeledes en omfattende analyse af proteiner i en signalering netværk under hensyntagen til relativ udtryk og rangordning af de enkelte proteiner, kan være mindre påvirket af heterogenitet.

Angivelse af celle signalering proteiner bliver også brugt som et diagnostisk biomarkør til skelne tumor fra associerede normalt væv. Vi fandt ingen signifikant forskel i celle signalering proteinekspression mellem ovariecancer og normal serøs epitel. Men når udtrykket værdier af flere prøver pr tumor blev kombineret, blev påvist en signifikant forskel i ekspression mellem kræft og normalt epitel for de fleste proteiner. Dette understreger betydningen af ​​flere prøveudtagninger. En praktisk tilgang i fremtidige undersøgelser kan være at samle flere prøver fra forskellige regioner i en individuel tumor før analyse.

Til sammenligning vurderede vi også den fysiologiske variation af protein-ekspression i normal serøs tubal epitel. Af tekniske årsager og begrænset tilgængelighed af normale vævsprøver, kunne vi ikke sammenligne forskellige prøver af den samme patient. Mellem normal serøs epitel fra forskellige patienter, vi observerede en lignende variation (betyder CV 27-31%) sammenlignet med variationen mellem ovariecancer fra forskellige patienter (gennemsnitlig CV 21%).

For at udelukke skævhed på grund af tekniske variationer vi tidligere vurderet den tekniske reproducerbarhed af protein kvantificering. Høj reproducerbarhed af protein målinger fra uafhængige ekstraktioner og fra uafhængige RPPA analyser blev demonstreret [23], og derfor fandt vi ingen grund til at tro, at heterogenitet i proteinekspression påvist i denne undersøgelse skyldtes tekniske variationer.

Begrænsninger den aktuelle undersøgelse omfatter antallet af sager og individuelle tumor prøver (n = 88). Vi analyserede makroskopisk heterogenitet, mens forskelle på et cellulært niveau ikke blev vurderet. En vigtig styrke er meget homogen patientgruppe omfatter udelukkende high-grade serøse ovariecancere vides at dele fælles patogenetiske veje, samt den omfattende prøvetagning af tumorerne i 5-9 forskellige områder. Vi analyserede forskellige regioner inden for hver primær ovariecancer og ikke sammenligne primære og metastatiske læsioner.

Som konklusion kan intratumoral heterogenitet føre til prøveudtagning bias, og pålidelig vurdering af celle signalering proteinekspression i kræft i æggestokkene til vurdering af prognostisk eller prædiktive biomarkører bør omfatte stikprøver af den primære tumor i flere forskellige steder.

Støtte Information

Figur S1. Sammenligning

tumor versus normale væv af ikke-overvåget hierarkisk gruppering af 13 tumorer og 14 prøver af normal serøs epitel, baseret på gennemsnitlige protein udtryk værdier pr tumor. Forskellige patienter er farvekodede som angivet i figuren legende. Hovedgrupper identificeres af softwaren er navngivet klynger A og B. High relative ekspression af proteiner er vist med rødt og lav ekspression i grøn farve. Grå rum indikerer manglende datapunkter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0077825.s001

(DOC)

tabel S1.

Antistoffer og betingelser anvendt for protein detektion

doi:. 10,1371 /journal.pone.0077825.s002

(DOC)

tabel S2.

intratumoral heterogenitet og variation mellem patienterne til ekspression af 36 proteiner vurderes ved omvendt fase proteinarrays (CV, variationskoefficient)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0077825.s003

(DOC)

tak

forfatterne vil gerne takke München Biobank Alliance af M4 klynge og Claudia Wolff til nyttige diskussioner og kommentarer og Simone Keller for at yde JNK /SAPK antistof.