PLoS ONE: EpCAM aptamer-siRNA Chimera Mål og Regress epithelial Cancer

Abstrakt

Epithelial celleadhæsionsmolekyle (EpCAM), en cancer stamceller (CSC) markør er overudtrykt i epitelial kræft og i retinoblastoma (RB ). Vi fabrikeret en EpCAM målrettet aptamer-siRNA kimære og undersøgt sin anti-tumor ejendom og EpCAM intracellulære domæne (EpICD) medieret signalering i epitelial kræft. Anti-tumor effekt af EpCAM aptamer-siEpCAM kimæren (EpApt-Siep) blev vurderet ved qPCR, northern og Western blotting i Weri-Rb1- RB cellelinie, primære RB tumorceller og i MCF7- brystcancercellelinie. Anti-tumor aktiviteten af ​​EpApt-Siep blev undersøgt

in vivo

hjælp epitelial kræft (MCF7) mus xenograftmodel. Mekanismen og veje er involveret i anti-tumor aktivitet blev yderligere undersøgt ved hjælp af protein arrays og qPCR. EpApt-Siep kimære blev behandlet

in vitro

ved Dicer enzym. Behandling af Weri-RB1 og MCF7 celler med EpApt-Siep afslørede statistisk signifikant nedregulering af EpCAM udtryk (P 0,005) og samtidig reduktion i celleproliferation. I primære RB celler dyrket fra RB tumorer, EpApt-Siep tavshed EpCAM, betydeligt hæmmet (P 0,01) celledeling og induceret cytotoksicitet. Knockdown af EpICD udtrykt i RB primære tumorer førte til undertrykkelse af pluripotens markører, SOX2, OCT4, NANOG, og CD133.

In vivo

undersøgelser viste fuldstændig tumorvækst regression uden toksicitet i dyr (P 0,001) og tumorvæv viste signifikant nedregulering (P 0,05) af EpCAM, MRP1, ABCG2, stathmin, survivin og opregulering af ATM ( P 0,05), der fører til apoptose ved indre vej med mindre ændring i cytokiner. Vores resultater viste, at EpApt-Siep potentielt udryddet EpCAM positive kræftceller gennem CSC markør undertrykkelse og apoptose, mens besparende normal EpCAM negative tilstødende celler

Henvisning:. Subramanian N, Kanwar JR, Kanwar RK, Sreemanthula J, Biswas J , Khetan V, et al. (2015) EpCAM aptamer-siRNA Chimera Mål og Regress epithelial kræft. PLoS ONE 10 (7): e0132407. doi: 10,1371 /journal.pone.0132407

Redaktør: Vittorio de Franciscis, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), ITALIEN

Modtaget: 8. oktober, 2014 Accepteret: 14 Juni 2015; Udgivet: 15 Juli 2015

Copyright: © 2015 Subramanian et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data findes i papiret. Derudover er rå billeder, der anvendes til samling tal deponeret i Figshare. (Link: figshare.com/s/cb264ee0178b11e5be5906ec4b8d1f61)

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af BARC 2010/35/19 /BRNS og dels fra Institut for Biotechnology- Indo-australske tilskuds- BT /Indo-Aus /06/08/2011 og COE-Grant BT /01 /CE1B /11 /V /16-støtteprogram på RB

Konkurrerende interesser.: forfatterne erklærer, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Epithelial celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) er en velkendt cancer stamceller (CSC) markør udtrykt på celleoverfladen og betragtes som en tumor associeret antigen [1]. EpCAM er overudtrykt i epiteltumorer såsom brystcancer og barndommen øje kræft såsom retinoblastoma (RB) [2-4]. EpCAM er forbundet med øget proliferation, migration og invasion i både brystkræft og RB [5, 6] .EpCAM protein differentieret i ekstracellulære domæne (EPEX), transmembrandomæne (EpTM) og intracellulært domæne (EpICD). Det spiller en afgørende rolle i onkogen signalering ved EpCAM proteolyse og EpICD translokation ind i kernen [7, 8] .Proteolysis af EpCAM fører EpICD at danne komplekse withFHL2, β-catenin og LEF1. Dette kompleks binder til theLef1 bindingssted af målgenerne og modulerer deres transkription [7] .EpICD vides at besætte promotorregion og positivt regulere SOX2, OCT4 og NANOG som bidrager til selvfornyelse og pluripotens af cancerceller [9].

EpCAM betragtes som en ideel terapeutisk mål til behandling af kræft på grund af forskellen i dens rumlige fordeling mellem normale celler og cancerceller. EpCAM overudtrykkes i den apikale overflade af tumorcellerne [10] og minimalt i den basolaterale overflade af normale epitelceller og mutationer er ikke beskrevet i EpCAM hidtil i cancerceller [11]. Adskillige anti-EpCAM antistoffer såsom edrecolomab og adecatumumab blev genereret til at målrette kræft og undersøgt i kliniske forsøg [12]. For yderligere at forbedre det terapeutiske potentiale af EpCAM målretning, blev der søgt aptamerer med større specificitet og højere affinitet [13].

Aptamerer er syntetisk oligonukleotid (RNA /ssDNA) eller peptidmolekyler, som binder til et specifikt mål med høj affinitet på grund af deres tredimensionale strukturer [14]. De syntetiseres fra store molekylære biblioteker ved en udvælgelsesproces kaldet “Systemisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse« (SELEX) [15, 16]. Både RNA og ssDNA-aptamerer blev udviklet mod celleoverfladen EpCAM [13, 17]. Da EpCAM RNA aptamer viste sig at blive internaliseret ved endocytose, ville det være i stand til at levere siRNA ind i cellen ved chimerization. Adskillige aptamer-siRNA chimerization strategier blev undersøgt for at målrette kræftceller. RNA aptamerer mod overflademarkører såsom PSMA, EGFR, BAFF-R, integriner og DNA aptamer mod nucleolin blev rapporteret for at levere siRNA i forskellige kræftmodeller (sammenfattet i S1 tabel).

Funktionaliteten af ​​aptamer-siRNA kimære konstrukter kunne forklares i tre trin såsom (i) binding og internalisering, (ii) dicer forarbejdning og (iii) RNAi-medieret inaktivering [18]. Vi har tidligere demonstreret den specifikke målretning af RB under anvendelse aptamer-doxorubicin (EpDT3-dox), der binder celleoverflade EpCAM at levere doxorubicin [19]. Her for første gang, har vi konstrueret EpCAM RNA aptamer-EpCAM siRNA kimære (EpApt-Siep) for at opnå målrettet EpCAM gendæmpning i EpCAM positive celler. Vi har også rapport første gang, at EpICD er overudtrykt i RB, og vælte EpCAM fører til nedregulering af CSC markører såsom SOX2, OCT4 og NANOG udtryk. Vi har også udført

in vivo

undersøgelser under anvendelse af xenograftmodel i nøgne mus med MCF7 brystcancer cellelinje, som proof of concept til faste epitelial kræft, som udtrykker EpCAM. Høje anti-tumor aktivitet blev opnået ved hjælp af vores EpApt-Siep kimære konstruktion uden toksicitet. Desuden undersøgtes den mekanisme involveret i celledød og inhibering af celleproliferation i tumorxenotransplantater ved at undersøge de fuldstændige apoptotiske og cytokiner molekyler under anvendelse proteinarrays.

Metoder

Fabrikation af kimær konstruktion og

In vitro

Dicer kløvningsassay

EpApt-Siep blev konstrueret som beskrevet i dassie

et

.,

al

. 2009 [20]. Den sekundære struktur af konstruktionen blev undersøgt ved RNA struktur V5.3 [21] og Mfold software [22]. De designede konstruktioner blev kommercielt syntetiseret af Dharmacon Inc. (GE biovidenskab, Lafayette, CO).

In vitro

dicer assay blev udført for at vise, at EpApt-Siep kimære behandles af Dicer enzym til frigivelse af siRNA fra det kimære aptamer anvendelse af rekombinant dicer kit (rekombinant human Dicer Enzyme kit Cat No: T510002) efter fabrikantens instruktioner. De reagerede produkter blev elektroforeret og analyseret ved UV transilluminator (detaljeret protokol leveres i S1 File).

cellelinjer og primære RB cellekultur og aptamer optagelse undersøgelse

Menneskelig RBcell line (Weri-RB1) , Breast Cancer cellelinie (MCF7) indkøbt fra Riken cellebank, RIKEN Bioresource center (Ibaraki, Japan) blev inkluderet i undersøgelsen. Cellelinjer var fri for forurening med mycoplasma, som verificeret af udkig efter Mycoplasma kit (Sigma Aldrich, Bangalore). MCF7 andWERI-RB1 celler blev dyrket i Dulbeccos modifikation af Eagles medium (DMEM) og Rosewell parkere Memorial Institute medium (RPMI-1640) mediarespectively med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Life Technologies, Bangalore, Indien). Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C i en 5% CO2 incubator.RB tumorprøver fra enukleeret øje bolde blev indsamlet som en del af terapien og anvendt til forskning formål anonymt. En generel skriftlig tilladelse er indhentet fra forældre /værger patientens gennemgår enucleation. Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med erklæringen fra Helsinki, på Vision Research Foundation, efter at have indhentet godkendelse fra Etisk underudvalg (Institutional Review Board) af Sankara Nethralaya eye hospital [Etisk clearance. ingen. 240-2010-P]. Primære RB tumorceller opnået fra de tømte øjne blev dissocieret ved manuel triturering, og dyrket i RPMI-medium indeholdende 20% FBS. RPMI og DMEM medier blev købt fra Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, Bangalore, Indien). Optagelse af FITC-mærket EpApt-Siep af MCF7 og Weri-RB1 celler blev undersøgt ved anvendelse af flowcytometri og fluorescerende mikroskopi følgende protokol leveres i S1 File.

In vitro

effektivitet af EpApt-Siep i celle linjer

effekten af ​​EpApt-Siep blev evalueret

in vitro

hjælp MCF7 og Weri-RB1 cellelinjer. Kort fortalt 2X10

5-celler blev behandlet med EpApt-Siep eller transficeret med siEpCAM i 48 timer, RNA-isolering efterfulgt af Northern blot, qPCR for mRNA analyse og Western blotting for proteinniveauer (S1 File).

Kvantitativ real-time PCR, nordlige og Western blotting

for at analysere effekten af ​​siEpCAM og EpApt-Siep på EpCAM udtryk blev qPCR og det nordlige blotting udført ved hjælp af total RNA. qPCR blev udført ved at normalisere målgenet til p-2-microgloublin (B2M) ved SYBR green baseret fremgangsmåde under anvendelse af primersekvenserne som anført i S2 tabel. Northern blotting blev udført ved elektroforese det totale RNA i formaldehyd agarosegel, transblottet hjælp SSC puffer, probet med biotin-mærket anti-sense EpCAM RNA-probe og udviklet ved hjælp af kemiluminescens-metoden. Western blotting blev udført for at analysere EpCAM protein niveau ved hjælp af standard-protokol med anti-EpCAM (c-10) antistof (detaljeret protokol leveres i S1 File).

Immunhistokemi

Immunhistokemi (IHC) var udføres ved hjælp af Novolink opdagelser polymer-system (Leica Biosystems, Bangalore, Indien) efter de anvisninger, som producenten bruger de-paraffinized menneskelige RB vævssnit. Kort fortalt blev antigen-genvinding udført under anvendelse trykkoger metode, så væv peroxidase blokering og primær blokering blev udført efterfulgt af inkubation med anti-EpICD antistof (IMGENEX, Indien). Polymer baseret påvisning ved DAB kromogen blev gjort, tørrede slides blev monteret og scorede til ekspressionsniveauerne (detaljeret protokol leveres i S1 File).

MTT proliferation assay

Lige antal MCF7 og Weri -Rb1 celler (10.000 per brønd) blev podet henholdsvis i en plade med 96 brønde. Efter 24, blev cellerne behandlet med 400 nM aptamer-siRNA kimære. Cellerne blev også transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen LifeScience, Bangalore, Indien) med 200 nM EpCAM siRNA (Qiagen, Tyskland). De behandlede celler blev inkuberet i 48hat 37 ° C i 5% CO2 inkubator. Efter 48 timer blev MTT (Sigma Aldrich, Bangalore, Indien) i frisk medium til cellerne og inkuberet i 4 timer. De dannede krystaller blev opløst i DMSO og absorbansen blev aflæst ved 570 nm under anvendelse Spectramax spektrofotometer.

In vivo

antitumoreffektivitet af EpApt-Siep i epitelcancer xenograft model

at studere

in vivo

effekten af ​​EpApt-Siep, MCF7, blev epitelial kræft model valgt, fordi den

in vitro

effektivitet var bedre end Weri-RB1 cellelinje. Denne undersøgelse blev udført i lokaler Syngene International Pvt. Ltd., kommercielt. Alle dyr blev håndteret på en måde at minimere eller eliminere smerte og lidelse ved at bruge isofluran baseret bedøvelse. Animal pleje var i overensstemmelse med anbefalingerne fra Udvalget for formålet med kontrol og tilsyn med dyreforsøg (CPCSEA), Indiens regering og Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care International (AAALAC). Den “Formular B ’til at udføre dyreforsøg blev revideret og godkendt af Syngene International Pvt. Ltd, Institutional Animal Ethics Committee (IAEC Protokol Godkendelse nr: Syngene /IAEC /430 /10-2013). Dyr blev opretholdt under kontrollerede og aseptiske tilstand og forsynet med majskolber, RO vand autoklaveret ad libitum og med lys /mørke cyklus på 12 timer hver. MCF7cells blev suspenderet ved en koncentration på 5×10

6cells i 200 pi serumfrit medium indeholdende 50% Matrigel og injiceret subkutant i ryggen af ​​athymiske nøgne-Foxn1

nuovariectomized hunmus af 7-8 uger gamle implanteret med 17β- estradiol pellets. Når tumorerne blev palpable, blev dyrene tilfældigt inddelt baseret på tumorvolumen (TV≈80mm

3) og doseringen blev påbegyndt. Behandlingsplanen fulgt er givet i S3 tabel. kropsvægt og tumorvolumen den blev målt en gang hver tredje dag og% ændring i kropsvægt blev beregnet. Under offer blev blod opsamlet under isofluran anæstesi fra alle grupper til klinisk vurdering af leverfunktionen (SGOT, SGPT) nyrefunktion (BUN, urinstof), perifert blod smear for differential leukocyttal. Tumor væv og organer blev skåret ud og analyseret histo-patologisk ved haemotoxylin og eosin farvning.

Protein array til apoptotiske markører og cytokiner

Proteome profilering blev udført for at undersøge mekanismen for EpApt-Siep konstruere Mediated anti-tumor aktivitet og studere dens virkning på apoptose debut og inflammatorisk respons. De proteinarrays-Human apoptose array, katalog # ARY009 og mus cytokin-array panel Et katalog # ARY006 (R

in vitro

dicer medieret forarbejdning og celleoptagelse

EpCAM aptamer siRNA kimæren blev fremstillet efter de tidligere optimerede strukturer af PSMA aptamer siRNA kimære konstrukt [20]. I den tidligere undersøgelse, stamme og sløjfe aptamer kimæren med streng swap udviste bedre silencing sammenlignet med de andre kimære former. Derfor har man i den aktuelle undersøgelse, vi fabrikeret aptamer kimæren ved at udvide aptamer sekvens med siRNA sekvens ved dens 5′-ende og 3′-ende. Den fabrikerede EpApt-siRNA gennemført siRNA rettet mod EpCAM. stilk og løkke struktur er designet manuelt ved at inkorporere siRNA sekvens målretning EpCAM. Derudover aptamerer-siRNA gennemføres nukleaseresistente modifikation (2’F) i pyrimidinerne. 5′-enden af ​​aptamer var enden mærket med FITC at overvåge aptamer binding og optagelse af celler og 3′-enden af ​​aptameren nærede to uridin udhæng, der hjælper med anerkendelse og lastning af Dicer enzym [23]. Den EpApt og fremstillet aptamer kimære strukturer blev forudsagt under anvendelse af RNA struktur V5.3 og Mfold og fremlagt i figur 1A og 1B. De EpApt hjælpemidler i binding til EpCAM, internalisering og frigivelse i celle cytoplasma. Den EpApt-Siep under indflydelse af dicer, generates21bp siRNA, der indlæses i RISC-komplekset, orchestrates hæmning af oversættelse EpCAM mRNA spaltning.

A. EpCAM aptamer sekundær struktur forudsigelse fra Mfold online. B. EpCAM aptamer siRNA kimære konstruktion bærer targeting EpCAM siRNA (EpApt-Siep) er foldet ved hjælp Mfold online og aptameren er angivet i blå boks og siRNA inde røde felt. C. EpCAM aptamer siRNA kimære konstruktion blev inkuberet med den rekombinante dicer enzym ved 37 ° C i 18 timer. Reaktionerne blev udført uden dicer som kontrolreaktion. Polyacrylamidgelelektroforese af reaktionerne med og uden Dicer enzym blev kørt på 15% gel og farvet med EtBr. Det forarbejdede 21BP siRNA og uforarbejdede konstruktion blev observeret. D. EpCAM aptamer siRNA kimær konstruktion sattes til Weri-RB1 og MCF7-celler i bindingsbuffer og analyseret ved flowcytometri. Den overlay graf viser optagelsen af ​​det kimære aptamer. E. Scatter plot, der viser optagelsen af ​​EpApt-Siep af RB cellelinie, Weri-RB1 og RB primære tumorceller. F. EpCAM aptamer siRNA kimære konstrukt blev tilsat til primære RB celler i medium uden serum i 2 timer ved 37 ° C efterfulgt af vask med 1X PBS. Mikroskopiske billeder blev taget ved 20X objektiv under fase og FITC kanaler kontrol celler alene og celler med EpApt-Siep. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. Forsøg blev gentaget 3 gange uafhængigt med lignende resultater. ** P-værdi på fra 0,01 til 0,001; * P-værdi på 0,05-0,01.

For funktionaliteten af ​​syntetiserede EpApt-Siep, dicer anerkendelse er nødvendig. Dette blev testet ved at udføre

in vitro

Dicer kløvningsassay. Den EpApt-Siep konstruktion blev inkuberet med rekombinant human dicer i 18 timer og efterfølgende elektroforese på agarosegel. Resultaterne viste 21BP og 19merproducts svarende til siRNA og aptamerer henholdsvis (S1 Fig). Dette blev yderligere bekræftet ved at køre et ikke-denaturerende PAGE blev spaltede fragmenter af ~ 20-22bp længde opnået (Fig 1C). Vi yderligere forsøgt at undersøge stabiliteten af ​​konstruktionen under fysiologiske efterligne betingelser. Konstruktionen resulterede i minimal nedbrydning ( 10% nedbrydning) Til 72h i medier uden og med 10% FBS hhv. Konstruktionen i 100% FBS var stabil indtil 96 h, selv om en mindre nedbrydning var tydelig ved 48h varighed. konstruktionerne kunne således være stabil under fysiologiske efterligner betingelser indtil 72h (S1A Fig).

cellulære optagelse er nødvendige for at underbygge internalisering af aptamer gennem receptor endocytose studier af EpApt-Siep. EpCAM aptamer (EpDT3 /EpApt) allerede blevet belyst for receptoren endocytose [13] .Earlier undersøgelser og aktuelle undersøgelse anvendte EpCAM scramble aptamer (ScrApt), med 2’OMe modifikation i EpApt backbone hindrer binding til EpCAM [13 , 19]. Svarende til EpApt-Siep blev ScrApt kimære (ScrApt-Siep) konstrueret. Den ScrApt-Siep upon chimerization resulterede i ikke-specifik binding til MCF7-celler (S1B Fig) og ikke undersøgt yderligere. Vi fandt højere cellulære optagelse af EpApt-Siep konstruere i MCF7 end Weri-Rb1cells (Fig 1D). De primære RB celler og Weri-RB1 cellelinje viste optagelse af kimære. De primære RB celler viste sig at udvise højere bindingseffektivitet end cellelinier, som følge af højere niveauer af EpCAM-ekspression i tumorerne (Fig 1E). Fra de mikroskopiske undersøgelser 75% af primære RB celler viste optagelse af EpApt-Siep (Fig 1F).

EpApt-Siep afbryder EpCAM specifikt i cellelinjer og primære RB tumorceller

mål specifik levering, siRNA generation og lyddæmpende kapacitet blev undersøgt ved hjælp Weri-RB1 og MCF7 cellelinjer. Da ekspressionsniveauet af EpCAM er højere i MCF7 celler end Weri-RB1 [24], det kimære konstrukt blev først bedømt for inaktivering af EpCAM i MCF7-celler. De nordlige blotting Resultaterne viste tavshed af EpCAM omkring 40% i EpApt-Siep behandlede celler og omkring 25% i Siep transfekterede celler normaliseret til 28s rRNA (Fig 2A og panelet lige til det). En kvantitativ analyse af mRNA-ekspression ved qPCR udviste bedre inhibering af EpCAM-ekspression, -1,8 og -3,4 fold nedregulering (73% og 90% inhibering af mRNA-ekspression) i MCF7-cellelinie (P 0,01) og -1.4 og -1.0 fold nedregulering (63% og 51% inhibering af mRNA-niveauer) i Weri-Rb1cell linie (P 0,05) (fig 2B). EpCAM nedregulering blev også observeret på de proteinniveauer (Fig 2C), Weri-RB1 celler udviste 47% og 43% og MCF7 udviste 65% og 49% af nedregulering af EpCAM-protein (P 0,05) (Fig 2D). De uforarbejdede nordlige og Western blots er vist i S2 Filer.

A. EpCAM mRNA niveauer blev påvist fra det totale RNA af kontrol, Siep og EpApt-Siep behandlede MCF7-celler ved northern blotting. Den totale RNA blev elektroforeret i formaldehyd-agarose-gelelektroforese, blottet og udviklet af kemiluminescens baserede metode. EpCAM målretning siRNA blev anvendt til syntese af sonden. På sin højre, blev densitometrianalyse af de bands udføres ved hjælp ImageJ software og plottet som graf med% mRNA-ekspression mod 28s rRNA. B. EpCAM-mRNA-niveauer blev kvantificeret ved SYBR green baseret qPCR fra cDNA af kontrol, Siep og EpApt-Siep behandlet Weri-RB1 og MCF7-celler. C. Western blotting blev udført på den Siep transficerede og EpApt-Siep behandlet Weri-RB1 og MCF7-celler til EpCAM og b-tubulin. EpCAM målretning siRNA blev anvendt til syntese af sonden. D. densitometri analyse af de vestlige blotting bands blev udført ved hjælp af ImageJ software og plottet som graf med% protein (EpCAM) udtryk normaliseret til p-tubulin. E. Den procentvise celledeling blev kvantificeret ved at udføre MTT assay om kontrol, Siep transficerede, EpApt-Siep, EpApt og ScrApt behandlet Weri-RB1 og MCF7-celler. Grafen viser% celleproliferation normaliseret med kontrolceller. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. Forsøg blev gentaget 3 gange uafhængigt med lignende resultater. ** P-værdi på fra 0,01 til 0,001; * P-værdi på 0,05-0,01.

Effekten af ​​kimære konstruktion blev testet i RB primære tumorceller til lyddæmpning. Den funktionelle /metaboliske activityof primære celler wasevaluated bytransfecting pGFP plasmid. 24 timer efter flertal transfektion af cellerne udviste meget høj ekspression (S2A Fig). Dette bekræftede den metabolisk aktive tilstand af de primære celler, vi derpå, at analysere effekten af ​​EpApt-Siep og Siep på disse celler. De primære tumorceller viste inhibering af EpCAM-ekspression med -0.5 fold og -2.4 fold i siRNA og kimær konstruktion behandlede celler henholdsvis (S2B Fig). Den cellulære cytotoksicitet som målt ved LDH-assay viste 37% og 35% stigning i LDH-aktivitet efter silencing af EpCAM hjælp siRNA og EpApt-Siep. Den EpApt-Siep konstruere signifikant (P 0,01) nedreguleret EpCAM mRNA-niveauer og forårsagede cytotoksicitet i primær RB tumorceller (S2C Fig). Celleproliferationen som en skrivebeskyttet ud af metabolisk aktivitet blev målt ved MTT-assayet. TheWERI-RB1 og MCF7-celler viste signifikant celledeling hæmning med EpApt-Siep, mens EpApt eller ScrApt alene ikke viste nogen effekt i celleproliferation (Fig 2E)

EpICD i primære RB tumorer:. Regulering af stilken kræft cellemarkører

EpCAM har vist sig at være overudtrykt i cancerceller initierende celler eller cancer progenitor /stamceller (CPC /CSCS) [25-27]. Mekanismen bag dette hotel blev reguleret af intramembrane proteolyse af EpCAM fører til EpICD frigivelse og fortrænge at nucleus [7] .Vi rapporterede tilstedeværelsen af ​​EpCAM tidligere i 2004 og i den aktuelle undersøgelse, vi søgte at undersøge ekspressionen af ​​EpICD i primær RB tumorer [28]. IHC Resultaterne viste intens nuklear farvning og intensiteten af ​​kernefarvning varierede blandt de undersøgte tumorer. Tumorerne viste 40-60% af cellerne positive og nogle tilfælde viste 70-80% af cellerne er positive for nuklear farvning. Den normale retina undersøgte afslørede ikke nogen indlysende nuklear farvning (Fig 3A). Intensiteten og den procentvise fordeling af de EpICD positive celler i tumoren er præsenteret i tabel 1.

A. Immunhistokemi af den normale retina snit, der viser ingen indlysende EpICD i kernen, RB vævssnit viser intens farvning af nucleus. Ekspressionen af ​​EpICD blev majorly observeret i kernen af ​​tumorcellerne som vist med hvide pile. B. gange ændring i mRNA-niveauer af SOX2, OCT4, Nanog, CD44S, CD133 og Survivin (BIRC5) blev kvantificeret ved SYBR grøn baseret qPCR fra Siep og EpApt-Siep behandlede Weri-RB1 celler og normaliseret til p-2-mikroglobulin som husholdning gen. C. gange ændring i mRNA-niveauer af SOX2, OCT4 og Nanog blev kvantificeret ved SYBR grøn baseret qPCR fra Siep og EpApt-Siep behandlede MCF7 celler og normaliseret til p-2-mikroglobulin som husholdning gene.Data repræsenterer gennemsnit ± SD. Forsøg blev gentaget 3 gange uafhængigt med lignende resultater ** P-værdi på 0,01 til 0,001.; * P-værdi på 0,05-0,01.

Den frigivne EpICD danner nukleare proteinkompleks ved at interagere med FHL2, β-catenin og LEF1 medierer gen transskriptioner og hjælpemidler i celleproliferation. Reguleringen af ​​EpICD på ekspressionen af ​​pluripotens markører blev rapporteret tidligere [9], og vi var interesseret i at studere graduering af EpCAM bag udtryk for OCT4, SOX2, NANOG, CD133, CD44s. Vi har desuden studeret udtryk for survivin niveauer ved nedregulering af EpCAM i RB cellelinje, Weri-RB1. EpCAM lyddæmpning ved hjælp af siRNA transfektion eller EpApt-Siep viste højere nedregulering af SOX2, OCT4 og NANOG i siRNA transficerede celler sammenlignet med EpApt-Siep, hvorimod CD133, CD44s og survivin niveauer blev mere nedreguleret i EpApt-Siep transfekterede celler (Fig 3B ). Vi har desuden studeret udtryk for SOX2, OCT4 og NANOG i MCF7-celler og fandt nedregulering af SOX2 og NANOG men ikke OCT4 på lyddæmpende EpCAM hjælp siRNA eller EpApt-Siep konstruere (fig 3C). Således var vi i stand til at belyse reguleringen af ​​stamcelle markører ved EpCAM gennem EpICD

EpApt-Siep relatere brystkræft:.

In vivo

xenograft undersøgelse

Anti-tumor effekt af EpApt-Siep blev undersøgt ved hjælp af brystkræft

in vivo

model. MCF7-celler blev injiceret i bilateralt ovarieektomiserede nøgne mus suppleret med ekstern østrogen. Doseringen af ​​EpApt-Siep blev udført hver anden dag fra Dag 0 til day14 og på day20 blev dyrene doseret, 24h senere n = 4 blev aflivet fra hver gruppe. De tumorvækst kinetik udviste signifikant reduktion (P 0,01) i tumorvolumen viste vehikelkontrol 584mm

3, mens det behandlede dyr viste 52mm

3 betyder tumorvolumen. Resten af ​​n = 4 i vehikelkontrolgruppe og EpApt-Siep gruppe blev doseret på day22 og day24, yderligere studeret indtil day33. De gennemsnitlige tumorvolumener på day33, for vehikelkontrolgruppe og EpApt-Siep var 922mm

3 og 64mm

3 hhv. Tumorvækst profil for begge grupperne i denne periode er vist i fig 4A. Den% tumorvækst inhibering (TGI) for EpApt-Siep gruppe ved den testede dosisniveau viste sig at være 102% (Day33,

#indicates p 0,001). På day33 blev musene (Fig 4B) aflivet, og tumorerne blev udskåret (Fig 4C) efterfulgt af analyse af ekspressionen af ​​EpCAM og cancer stamcellemarkører, apoptotiske beslutningstagere og lægemiddelresistente proteiner blev udført.

tumorvækst kinetik MCF7 xenograft behandlet med EpApt-Siep. Kvindelige nøgne mus (Hsd: athymiske Nøgen-Foxn1

nu, bilateralt ovarieektomiserede) opstaldet i Individuelt Ventilerede Bure (IVCs) blev anvendt til denne undersøgelse. Tumorigeniciteten af ​​MCF7-celler i mus er østrogen-afhængige. Tyve timer før MCF-7 celle injektion blev dyr implanteret med 17p-estradiol pellets (0.36mg /pille; 60-dages release, Innovative Research of America, Sarasota, FL) i dorsal skulderblad region af mus ved hjælp af trokar. MCF-7 tumorceller (5 x10

6 celler /dyr) blev injiceret subkutant i flankerne af dyrene. Efter 7-10 dage efter injektion af celler blev dyrene randomiseret baseret på tumorvolumen (TV≈80mm3) og dosering blev påbegyndt. Graf, der viser (A) Tumor køretøjets volumen kontrolgruppen injiceret med PBS subkutant nær tumorstedet, EpApt-Siep subkutant injiceret nær tumorstedet hver anden dag. De orange pile angiver EpApt-Siep injektioner givet og den blå stjerne angiver dagen for offer. På dag 21 og 33, som følge af forsøg og etiske grunde dyr fra begge grupper blev aflivet 50% på hvert tidspunkt. Fotografier af de repræsentative mus (B) og udskårne tumorer (C) af køretøjer kontrol og behandlede grupper. D. Ændringer i proteinekspression ved Western blotting af proteiner ekstraktion fra repræsentative væv af kontrol mus eller mus behandlet med EpApt-Siep (0.6nmol) og afsluttet ved 21 og 33 dage henholdsvis (på sin højre, graf, der repræsenterer den relative ekspression beregnet ved ImageJ software. E. graf over udviklingen i MCF7 xenograft tumorvæv EpCAM, CD44s, CD24 og MRP1 mRNA niveauer efter behandling med EpApt-Siep konstruere. Styringen køretøj blev anvendt til at normalisere folden udtryk og β-2 mikroglobulin blev anvendt som interne kontrol. F. graf over udviklingen i STMN, BIRC5, Bcl2, Bax og ATM mRNA niveauer efter behandling med EpApt-Siep aptamer konstruere normalisering blev gjort med både køretøj kontrol /ingen behandling gruppe. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SE for

in vivo

forsøg (n = 8) og gennemsnit ± SD for andre eksperimenter eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og signifikans blev beregnet ved t-test # P. . 0,001; ** P-værdi på 0,01 til 0,001; * P-værdi af 0,05-0,01.

effekten af ​​EpApt-Siep konstruere på ekspressionen af ​​EpCAM og andre CSC markører blev undersøgt mellem køretøj kontrol og behandlede gruppe (n = 2) tumor sektioner indsamlet fra day21 og day33 henholdsvis. For at kontrollere effekten af ​​EpCAM dæmpning fremkaldt af EpApt-Siep opføre, blev udtryk for EpCAM analyseret ved Western blot på proteinniveau, blev desuden ABCG2 protein inkluderet. Den densitometrianalyse viste 55% og 60% af EpCAM-protein nedregulering i day21and day33 gruppe, mens ABCG2 protein viste 60% og 85% af nedregulering i day21 og day33 henholdsvis EpApt-Siep behandlede prøver sammenlignet med vehikelkontrol (fig 4D). H &