PLoS ONE: Epiteliale-Mesenchymale Transition (EMT) induceret af TNF-α Kræver AKT /GSK-3β-medieret Stabilisering af Snail i kolorektal Cancer

Abstrakt

Kronisk betændelse-forfremmet metastaser har været betragtet som en væsentlig udfordrer i kræftbehandling. Pro-inflammatorisk cytokin TNFa kan fremkalde kræft invasion og metastase i forbindelse med epitelial-mesenkymale overgang (EMT). Men de underliggende mekanismer er ikke helt klart. I denne undersøgelse viste vi, at TNFa inducerer EMT i humane HCT116-celler og dermed fremmer kolorektal cancer (CRC) invasion og metastase. TNFa-induceret EMT blev karakteriseret ved at erhverve mesenkymale spindel-lignende morfologi og øge ekspressionen af ​​N-cadherin og fibronectin med et samtidigt fald af E-cadherin og Zona occludin-1 (ZO-1). TNF behandling steg også udtryk for transskription faktor Snail, men ikke Slug, ZEB1 og Twist. Overekspression af Snail inducerede et skift fra E-cadherin til N-cadherin-ekspression i HCT116-celler, som er karakteristisk for EMT. Omvendt knockdown af sneglen betydeligt svækkede TNFa-induceret EMT i HCT116-celler, hvilket antyder, at sneglen spiller en afgørende rolle i TNFa-induceret EMT. Interessant, udsættelse for TNF hurtigt forøget Snail proteinekspression og Snail nukleare lokalisering men ikke mRNA-niveau opregulering. Endelig viste vi, at TNF forhøjede Snail stabilitet ved at aktivere AKT vej og efterfølgende undertrykke GSK-3β aktivitet og faldende sammenslutningen af ​​Snail med GSK-3β. Knockdown af GSK-3β yderligere bekræftet vores konklusion. Samlet set viser disse resultater viste, at AKT /GSK-3β-medieret stabilisering af sneglen er påkrævet for TNFa-induceret EMT i CRC-celler. Vores undersøgelse giver en bedre forståelse af inflammationsinduceret CRC metastase

Henvisning:. Wang H, Wang H-S, Zhou B-H, Li C-L, Zhang F, Wang X-F, et al. (2013) Epithelial-Mesenchymale Transition (EMT) induceret af TNF-α Kræver AKT /GSK-3β-medieret Stabilisering af Snail i kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (2): e56664. doi: 10,1371 /journal.pone.0056664

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: August 13, 2012; Accepteret: 14 januar 2013; Publiceret: 19 feb 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af National Basic Research Program Kina (973 Program, No. 2011CB935800), og National Natural Science Foundation of China (nr 30.873.032 og nr 81.071.712). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kronisk inflammation er blevet identificeret til at være tæt forbundet med tumorigenese [1], [2]. Stigende beviser har vist, at den inflammatoriske tumormikromiljøet spiller en afgørende rolle i tumorudvikling og metastase [3]. Tumormikromiljøet er i vid udstrækning organiseret af inflammatoriske celler, som letter ekstracellulær matrix opdeling, angiogenese og vævsremodellering, således fremme tumorcellemotilitet [4]. Endvidere tumorceller selv kan udskille proinflammatoriske cytokiner, som bidrager direkte til maligne [5] progression. De komplekse interaktioner mellem tumor og inflammatoriske celler medieret af inflammatoriske cytokiner er et væsentligt aspekt af tumor mikromiljø [6]. Tumornekrosefaktor α (TNFa), et proinflammatorisk cytokin overvejende produceres af makrofager, er et centralt molekyle regulerer de inflammatoriske processer i tumorpromotion. Montering beviser antydede, at TNFa medierer mange kritiske processer på tumorudvikling, herunder onkogen aktivering, DNA-skader, og tumormetastase [7].

Epithelial-mesenchymal overgang (EMT), en væsentlig fænotypisk omdannelse under fosterudviklingen, væv remodeling, og sårheling, spiller en uundværlig rolle i tumorinvasion og metastase [8] – [10]. EMT er en reversibel proces, der ofte forekommer ved den invasive foran mange metastatiske cancere [11]. EMT kan udløses af forskellige signaler modtaget fra tumormikromiljøet, såsom TGFp, EGF, WNTs og Notch [12]. Under processerne EMT, epitelceller tab intercellulær adhæsion, erhverve fibroblastlignende egenskaber og øge vandrende og invasive egenskaber [13]. En af de mest veldefinerede funktioner i EMT er tabet af E-cadherin ekspression [8]. En gruppe af transkriptionsfaktorer, herunder Snail, Slug, ZEB1, Twist, har været impliceret i kontrollen af ​​EMT [14]. Snegl, en zink-finger transkriptionsfaktor først identificeret i Drosophila, har vist sig som en central EMT regulator [15]. Undersøgelser viste, at Snail undertrykker E-cadherin transkription ved binding til E-box-sted i promotoren for E-cadherin [16] – [18]. Roller Snail i EMT regulering er blevet rapporteret i mange typer af kræft, såsom mammacancer, ovariecancer, etc. [14], [18], [19]. Silencing af Snail ved stabil RNA-interferens inducerer komplet mesenchymale til epitel overgang (MET) i MDCK-Snail celler, der associerer med inhibering af invasion [20]. Desuden høj ekspression af Snail korrelerer også med tumor kvalitet, gentagelse, nodal metastaser og dårlige resultater hos patienter [21] – [25]. Adskillige inflammatoriske mediatorer, såsom TGFp, hypoxi og IL-6 kan opregulere Sneglen og derfor udløse EMT [3]. Disse resultater understreger betydningen af ​​den mikromiljø i reguleringen af ​​Snail og i indledningen af ​​EMT.

kolorektal cancer (CRC) er et stort verdensomspændende sundhedsproblem. De fleste dødsfald fra CRC skyldes metastaser, der er resistente over for konventionelle behandlinger. EMT er et stort problem, at CRC metastaser [26]. Imidlertid er rollen af ​​TNFa i EMT af CRC sjældent undersøgt, og den underliggende molekylære mekanisme er stadig uklar. Her viste vi, at TNFa-induceret EMT ved at stabilisere Snail i HCT116 og Caco-2-celler. Vi viste også, at TNF stabiliserer Snail ved at aktivere AKT vej og derved hæmmer GSK-3β aktivitet og faldende sammenslutningen af ​​GSK-3β og Snail.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

NF-KB inhibitor BAY11-7082, ERK inhibitor PD98059, p38 MAPK inhibitor SB-203580, PI3K-inhibitor LY294002, GSK-3β-inhibitor lithium (LiCI) og proteasominhibitor MG132 blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . Primære antistoffer mod E-cadherin, Zona occludin-1 (ZO-1), snail, ZEB1, p-GSK-3β (Ser9), GSK-3β, p-Akt (Ser473), Akt, og β-catenin blev opnået fra Cell Signaling Technology (MA, USA). Primært antistof mod histon H2A.X blev opnået fra Bioworld (Bioworld Technology, Minneapolis, MN, USA). Protein A /G Sepharose og primære antistoffer mod N-cadherin, ubiquitin, β-actin, α-tubulin blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Primært antistof til fibronectin blev opnået fra Boster Biological Engineering. Peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof, Alexa Fluor 488/594 konjugeret sekundært antistof, DAPI og Lipofectamine 2000 blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Rekombinant humant TNFa-protein blev købt fra PeproTech. PrimeScript® RT reagens Kit og SYBR® Premix Ex Taq ™ var produkter af TaKaRa. E.Z.N.A® HP Total RNA Kit blev købt fra Omega Bio-Tek (Doraville, USA). Smart pool siRNA mod humant Sneglen og GSK-3β var fra RIBOBIO.

Cell Culture

HCT116 og Caco-2 kolorektal karcinom cellelinjer blev opnået fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). HCT116 celler blev holdt i McCoy’5a dyrkningsmedium (Gibco BRL) suppleret med 10% føtalt bovint serum, og Caco-2 celler blev dyrket i DMEM dyrkningsmedium (Gibco BRL) suppleret med 10% føtalt bovint serum under en befugtet 5% CO

2 atmosfære ved 37 ° C i inkubatoren.

Transwell Migration og invasion Assay

Migration og invasion blev udført i Boyden kamre. De polycarbonatfiltre (8 um porestørrelse, Corning) præ-overtrukket med Matrigel Matrix (BD Biosciences) blev anvendt til invasion assay og uovertrukne filtre blev anvendt til migration assay. Celler (1 x 10

5) i 300 pi medium (indeholdende 0,1% FBS) med eller uden 20 ng /ml TNFa blev podet i det øvre kammer. Derefter 600 ml medium med 10% FBS blev tilsat til det nederste kammer og tjente som et kemotaktisk middel. Efter 24 timers inkubation, for migration, cellerne migreret og klæbet på det nederste kammer blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 20 min, farvet med hematoxylin og talt under opretstående mikroskop (5 felter pr kammer). For invasion blev cellerne i det øvre kammer fikseret i 4% paraformaldehyd i 20 min. Derefter matrigel blev mekanisk fjernet fra filteret med en vatpind. Cellerne klæber til under-side af filteret blev farvet med hæmatoxylin og talt under opretstående mikroskop (5 felter pr kammer). Hver migration og invasion assay blev gentaget i tre uafhængige forsøg.

Gene overekspression og RNA Interference

Cellerne blev podet på en 6-brønds plade (2 × 10

5 celler /brønd) og efterladt i kultur indtil den næste dag. De blev derefter transficeret med 2 ug plasmid vektor eller 100 pmol siRNA oligomer blandet med lipofectamin 2000-reagens i serum reduceret medium ifølge producentens anvisninger. Medium blev ændret for at fuldføre dyrkningsmedium 6 timer senere, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en CO

2 inkubator i yderligere 24 til 48 timer før høst.

Kvantitativ realtids-PCR

Samlet mRNA af cellerne blev ekstraheret efter behandling i den angivne tid. Første streng cDNA-syntese blev dannet fra 500 ng totalt RNA. Kvantificering af mål og referencepunkter (GAPDH) gener blev udført i tre eksemplarer på LightCycler® 480 II (Roche Applied Science). De anvendte primere i hver reaktion var som følger: E-cadherin fremadrettet 5′-TACACTGCCCAGGAGCCAGA-3 ‘og revers 5′-TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3′; N-cadherin, fremadrettet 5’-CGAATGGATGAAAGACCCATCC-3 ‘og revers 5′-GGAGCCACTGCCTTCATAGTCAA-3’; Snail, frem 5’GACCACTATGCCGCGCTCTT-3 ‘og omvendt 5′-TCGCTGTAGTTAGGCTTCCGATT-3′; ZEB1, frem 5’-TACAGAACCCAACTTGAACGTCACA-3 ‘og omvendt 5’GATTACACCCAGACTGCGTCACA-3′; Twist, fremadrettet 5’-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3 ‘og revers 5′-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3′; Slug, fremadrettet 5’-TTCGGACCCACACATTACCT-3 ‘og revers 5′-GCAGTGAGGGCAAGAAAAAG-3’; GAPDH, frem 5’GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ‘og omvendt 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’. Efter normaliseret til GAPDH-genet, blev ekspressionsniveauer for hver målgen beregnet ved hjælp af sammenlignende tærskelcyklus (CT) metode. De ACt-værdierne blev beregnet i overensstemmelse med formlen ACt = ct (genet af interesse) -Ct (GAPDH) i korrelationsanalyse, og 2-ΔΔct blev beregnet i overensstemmelse med formlen ΔΔct = ACt (kontrolgruppe) -Δct (forsøgsgruppe) til bestemmelse af relativ. Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD) fra tre uafhængige forsøg.

Western blotting-analyse

Cellerne blev vasket tre gange med iskold phosphatpufferopløsning (PBS) og derefter lyseret i lysepuffer indeholdende 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,5% Na-deoxycholat, 5 ug /ml aprotinin, 5 ug /ml leupeptin og 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid. Lysater blev klaret ved centrifugering og denatureret ved kogning i Laemmli buffer. Lige mængder af proteinprøver blev påført per brønd og separeret på SDS-polyacrylamidgeler, og derefter elektroforetisk overført til PVDF-membraner. Efter blokering med 5% fedtfri mælk ved stuetemperatur i 2 timer blev membraner inkuberet med primære antistoffer (1:1,000 fortynding) ved 4 ° C natten over og derefter inkuberet med HRP-konjugerede sekundære antistoffer (1:5,000 fortynding) for 2 timer ved stuetemperatur. Specifikke immunkomplekser blev påvist ved anvendelse af Western blot Plus Kemiluminescens Reagent (Life Science).

Immunofluorescens

Cellerne blev dyrket på kammerobjektglas, serum sultet i 12 timer, derefter eksponeret for TNFa for det angivne tid. Celler blev vasket tre gange med PBS, fikseret med 4% paraformaldehyd i 20 minutter og permeabiliseret med 0,3% Triton X-100 i 10 min. Efter blokering med gedeserum i 2 timer ved stuetemperatur blev celler inkuberet med antistoffer mod E-cadherin, N-cadherin, fibronectin, ZO-1 eller snail (1:100 fortynding) ved 4 ° C natten over. Objektglas blev vasket tre gange med PBS og inkuberet med Alexa Fluor 488 eller Alexa Fluor 594-konjugerede sekundære antistoffer (1:1,000 fortynding) i 1 time ved stuetemperatur. Kerner blev farvet med DAPI (10 ug /ml) i 10 minutter. Prøverne blev undersøgt med Konfokal Laser Scanning Microscopy (Zeiss) at analysere ekspressionen af ​​E-cadherin, N-cadherin, fibronektin, ZO-1 og nuklear translokation af Snail.

Immunopræcipitation

Cellerne blev vasket tre gange med iskold PBS og høstet ved 4 ° C i immunpræcipitering lysepuffer indeholdende 50 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM Na

3VO

4, 1 mM NaF, 1 mM dithiothreitol, 1 mM 4- (2-aminoethyl) benzensulfonylfluorid, 1 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin og 1 pg /ml aprotinin. Lige store mængder protein blev immunpræcipiteret under anvendelse af anti-Snail eller anti-GSK-3β-antistof, og immunkomplekserne blev bundet til protein A /G Sepharose. Perlerne blev vasket med lyseringspuffer og underkastet western blotting med anti-ubiquitin, anti-Snail eller anti-GSK-3β-antistof.

Statistical Analysis

Resultater blev udtrykt som gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg, medmindre andet er angivet. Data blev analyseret ved to-halet uparret t-test mellem to grupper. Envejs ANOVA variansanalyse blev anvendt til at vurdere forskellen af ​​midler mellem grupper. Disse analyser blev udført ved anvendelse af GraphPad Prism Software version 5.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). En P-værdi på 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

TNF Fremmer Migration og Invasion af HCT116 Celler

Tumor celler med en aggressiv fænotype erhverve vandrende og invasiv. kapaciteter. Dette vil fremme udbredelsen af ​​tumorer celler til fjerne organer [8]. migration og invasion evner HCT116 celler ramt af TNFa de blev målt ved anvendelse af Transwell migration og invasion-assays. Som vist i figur 1A og C, TNFa behandling resulterede i en signifikant stigning i cellemigrering og invasion. Sammenlignet med kontrol, antallet af migrerede og invasive celler steg ca. 4 gange (migration) og 20-fold (invasion) efter behandling med TNFa (Fig. 1B og D).

(A) HCT116 celler blev lov til at migrere transwell kamre i 24 timer i nærvær eller fravær af TNFa (20 ng /ml). Efter 24 timer blev de migrerede celler fikseret, farvet og fotograferet. Forstørrelse, 100 ×. (B) Antallet af migrerede celler. Data viser gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. (C) efter behandling med eller uden TNFa (20 ng /ml) i 48 timer blev HCT116 celler, der var spredt gennem matrixgel og ind i under-side af filteret fikseret, farvet og fotograferet. Forstørrelse, 200 ×. (D) Antallet af invasive celler. Data viser gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. * P. 0,05 sammenlignet med kontrol

TNF inducerer EMT i HCT116 Celler

Den øgede migration og invasion evner tumorceller minder om begivenhederne i EMT, hvorunder den epitel beslutningstagere E-cadhein og ZO-1 er nedreguleret, mens mesenkymale markører N-cadherin og fibronectin er opreguleret [27]. EMT af HCT116 celler blev observeret efter stimulering med 20 ng /ml TNFa i 4 dage. Celler resulterede i en signifikant ændring i morfologi, fra brosten morfologi til mesenchymale spindel-lignende og tenformede funktioner (Fig. 2A). Immunofluorescens viste, at dette morfologisk ændring var forbundet med nedregulering af epiteliale egenskaber E-cadherin, ZO-1-ekspression og opregulering af mesenchymal egenskaber fibronectin og N-cadherin ekspression (fig. 2A). Tilsvarende western blotting-analyse bekræftede yderligere forøgelse af ekspression af fibronectin og N-cadherin, og den faldende ekspression af E-cadherin og ZO-1 ved proteinniveauer (fig. 2B). Endvidere viste QRT-PCR-analyse, at TNFa behandling nedreguleret E-cadherin og opreguleret N-cadherin på mRNA-niveauer (fig. 2C). Kollektivt, disse observationer antydede, at HCT116 celler havde gennemgået en EMT efter behandlet af TNFa.

(A) HCT116-celler blev behandlet med eller uden TNFa (20 ng /ml) i 4 dage. Cell morfologiske ændringer forbundet med EMT er vist i fase kontrast billede. Ekspression af E-cadherin, ZO-1, fibronectin, N-cadherin blev analyseret ved immunfluorescensfarvning. Kerner blev visualiseret med DAPI-farvning. Scale bars: 20 uM. (B) HCT116-celler blev behandlet med eller uden TNFa (20 ng /ml) i 4 dage, og ekspressionen af ​​E-cadherin, ZO-1, fibronectin, N-cadherin, snail, ZEB1, Twist, Slug blev analyseret ved western blotting. p-actin servere som lastning kontrol. (C) HCT116-celler blev behandlet med eller uden TNFa (20 ng /ml) i 4 dage. De mRNA niveauer af E-cadherin, N-cadherin, sneglen, ZEB1, Twist, blev Slug analyseret af QRT-PCR. * P. 0,05 sammenlignet med kontrol

Snail er afgørende for TNF-medieret EMT

Da transskription faktorer Snail, ZEB1, Twist og Slug spille vigtige roller i reguleringen af ​​EMT [14] så undersøgte vi, hvorvidt deres udtryk blev opreguleret i HCT116 celler efter behandlet med TNFa. Sammenlignet med ubehandlede celler, TNFa signifikant forøget snail proteinniveauet, men ikke mRNA-niveau (fig. 2B og C). Men TNF behandling ændret hverken mRNA eller protein niveauer af ZEB1, Twist, Slug (fig. 2B og C).

Vi overudtrykt Snail for yderligere at undersøge sine roller i TNF-induceret EMT af HCT116 celler. Celler blev transficeret med pcDNA-Sneglen og kontrol vektor pcDNA-3,1 hhv. Ekspression af Snail og EMT markører blev detekteret ved immunfluorescens og western blotting. Resultaterne viste, at øget snail ekspression induceret EMT-lignende morfologiske ændringer og forårsagede et skifte fra E-cadherin til N-cadherin ekspression i HCT116-celler (fig. 3A og B). Disse resultater viste, at ektopisk ekspression af Snail kan udløse EMT i HCT116-celler. Baseret på disse observationer, vi vurderet, at Snail opregulering kan være afgørende for TNF-induceret EMT i HCT116 celler.

(A) pcDNA-Snail (Snail) eller kontrol pcDNA-3.1 (Vector) blev udtrykt i HCT116-celler i 48 timer. Cell morfologiske ændringer forbundet med EMT er vist i fase kontrast billede. Ekspression af E-cadherin og N-cadherin blev analyseret ved immunfluorescensfarvning. Kerner blev visualiseret med DAPI-farvning. Scale bars: 20 uM. (B) Ekspressionen af ​​E-cadherin, N-cadherin og snail fra HCT116-celler transficeret med pcDNA-Snail eller kontrol vektor blev undersøgt ved western blotting. p-actin servere som lastning kontrol. (C) HCT116 celler transficeret med Snail specifik si-RNA (si-Snail) eller negativ kontrol si-RNA (si-NC) blev stimuleret med eller uden TNFa (20 ng /ml) i 48 timer, og de morfologiske ændringer blev observeret med en fase-kontrast mikroskopi. (D) HCT116 celler transficeret med si-Snail eller si-NC blev stimuleret med eller uden TNFa (20 ng /ml) i 4 dage, og ekspressionen af ​​E-cadherin og snail blev detekteret ved western blotting. β-actin servere som lastning kontrol.

Vi yderligere udført Knockdown assays for at verificere, at Snail er en vigtig regulator i TNF-induceret EMT. HCT116-celler blev transficeret med ikke-målretning kontrol si-RNA eller si-sneglen i 24 timer og derefter behandlet med TNFa for forskellige tidspunkter. blev observeret morfologiske ændringer under et fasekontrastmikroskop. Udtrykkene for Sneglen og E-cadherin blev påvist ved western blotting. Sammenlignet med kontrolgruppen, blev spindel-lignende morfologiske ændringer ikke observeret ved TNFa tilføjelse i si-snail transficerede celler (fig. 3C). Silencing af Snail også svækket TNF-induceret nedregulering af E-cadherin, som ikke blev observeret i kontrol si-RNA-transfekterede celler (fig. 3D). Tilsammen disse observationer viste, at sneglen er afgørende for TNF-induceret EMT i HCT116 celler.

TNF Regulerer Stabilisering og Subcellulær Lokalisering af Snail

Vi har tidligere fundet, at TNF øget Snail proteinniveau, men ikke mRNA-niveau (fig. 2B og C). Dette resultat antydede, at opregulering af Snail af TNF foregik på post-transkriptionel niveau. For yderligere at verificere dette synspunkt blev HCT116 og Caco-2-celler behandlet med TNFa for 0-8 timer, og sneglen protein og mRNA blev detekteret ved western blotting og QRT-PCR hhv. Resultaterne viste, at proteinniveauet af Snail blev forbedret efter 1 time af TNFa-stimulering og forøget tidsafhængigt (fig. 4A). Men mRNA niveau af Snail ikke have en betydelig ændring efter TNF behandling (fig. 4B). Disse resultater antydede, at opregulering af sneglen ved TNFa kan skyldes, at proteinstabilisering.

(A-B) HCT116 og Caco-2-celler blev behandlet med TNFa (20 ng /ml) i de angivne tidspunkter, og proteinet (A) og mRNA (B) niveauer af Snail blev undersøgt ved western blotting og QRT-PCR henholdsvis; (C) HCT116-celler blev behandlet med eller uden TNFa (20 ng /ml) i 6 timer. Efter fiksering blev den cellulære placering af sneglen (grøn) undersøgt ved immunfluorescensfarvning og kerner blev farvet med DAPI (blå). Scale barer: 20 pm

Da transkriptionsfaktorer kun kan træde i kraft, når de overfører ind i kernen [28], vi også bestemt det nukleare translokation aktivitet Snail ved immunfluorescens.. Den nukleare lokalisering af Snail blev vurderet i HCT116 celler stimuleret med eller uden TNFa i 8 timer. Som vist i fig. 4C, sammenlignet med kontrolgruppen, TNF steget markant den nukleare translokation af Snail.

TNFa formidler Snail Stabilisering via Aktivering af AKT og hæmning af GSK-3β

For at undersøge de molekylære mekanismer der ligger til grund TNF -medieret snail stabilisering blev inhibitorer af NF-KB (BAY11-7082), PI3K /AKT (LY294002), MAPK (PD98059), p38 (SB-203580), der anvendes, da TNFa kan inducere aktivering af disse veje. HCT116 og Caco-2-celler blev forbehandlet med inhibitorer i 1 time før TNFa-stimulering, og derefter ekspression af Snail blev bestemt ved western blotting. Vi fandt, at PI3K /AKT-inhibitor (LY294002), men ikke de andre, helt blokeret TNFa-stabiliseret sneglen (fig. 5A), hvilket antyder, at aktivering af PI3K /AKT pathway er ansvarlig for TNFa-medieret snail stabilisering.

pathway. (A) HCT116-celler blev forbehandlet med SB-203580 (20 uM), PD98059 (20 uM), BAY11-7082 (10 uM), LY294002 (20 uM) i 1 time henholdsvis efterfulgt af stimulering med TNFa (20 ng /ml) i 6 timer. Ekspressionen af ​​Snail blev undersøgt ved Western blotting. Caco-2-celler blev forbehandlet med SB-203580 (20 uM), BAY11-7082 (10 uM), LY294002 (20 uM) i 1 time henholdsvis efterfulgt af stimulering med TNFa (20 ng /ml) i 6 timer. Ekspressionen af ​​Snail blev undersøgt ved Western blotting. (B) HCT116-celler blev forbehandlet med eller uden LY294002 (20 uM) i 1 time, efterfulgt af stimulering med eller uden TNFa (20 ng /ml) i 6 timer. Ekspressionen af ​​Sneglen og aktiveringen af ​​AKT og GSK-3β blev undersøgt ved western blotting. (C) HCT116 og Caco-2-celler blev behandlet med TNFa (20 ng /ml) i de angivne tider. Ekspressionen af ​​pGSK-3β og GSK-3β blev undersøgt ved western blotting. (D) Kontrol og GSK-3β si-RNA blev udtrykt i HCT116-celler i 42 timer, efterfulgt behandlet med eller uden TNFa (20 ng /ml) i yderligere 6 timer. Ekspressionen af ​​Sneglen og GSK-3β blev undersøgt ved western blotting. (E) HCT116-celler blev behandlet med TNFa (20 ng /ml) eller LiCI (40 mM) i 6 timer. Ekspressionen af ​​Snail, pGSK-3β, GSK-3β, og β-catenin blev analyseret ved Western blotting. (F) Efter behandlede HCT116-celler med eller uden TNFa (20 ng /ml) i 6 timer, Sneglen og β-catenin placeret på membranen og nuklear blev isoleret henholdsvis og derefter analyseret ved Western blotting.

Snail er et primært reguleret af GSK-3β, en kinase placeret nedstrøms for PI3K /AKT-vejen [24], [29], [30]. GSK-3β opretholder en aktiv tilstand i dephosphorylerede formular. For at bestemme om stabiliseringen af ​​sneglen ved TNFa medieres af regulering af GSK-3β-aktivitet, behandlede vi HCT116 celler med LY294002 før TNFa behandling, og derefter ekspression af p-AKT, p-GSK-3β, og sneglen blev bestemt ved western blotting. Vi fandt, at niveauerne af p-AKT, p-GSK-3β, og sneglen blev forøget efter TNFa behandling efter 6 timer, mens disse virkninger var reversible efter behandling med LY294002 alene eller i kombination med TNFa (Fig. 5B). Vi målte næste tidsforløbene for GSK-3β phosphorylering og fundet, at ekspressionen af ​​p-GSK-3β steg på en tidsafhængig måde ved TNFa-stimulering i HCT116 og Caco-2-celler (fig. 5C). Disse resultater viste, at stabiliseringen af ​​sneglen ved TNFa skyldes inhibering af GSK-3β-aktivitet. For yderligere at bekræfte vores resultater, vi bankede ned ekspression af GSK-3β i HCT116 celler via bestemte GSK-3β si-RNA (fig. 5D). Sammenlignet med kontrol, nedregulering af GSK-3β markant forhøjet niveauerne af sneglen ekspression (fig. 5D). Imidlertid blev TNFa-medieret snail stabilisering ikke yderligere forhøjet efter knockdown af GSK-3β (fig. 5D). Tilsvarende, når vi behandlet HCT116 celler med LiCI, en potent GSK-3β-inhibitor, i overensstemmelse med TNFa behandling, udtrykkene for sneglen, p-GSK-3β, og β-catenin (et protein reguleres af GSK-3β) blev forøget ( fig. 5E). Men den opregulering af β-catenin var ikke så indlysende som sneglen. Det kan skyldes intracellulære lokaliseringer mellem β-catenin og snail er forskellige. For at verificere denne hypotese, vi isoleret Sneglen og β-catenin fra membran og nuklear af HCT116 celler behandlet med eller uden TNF. Resultaterne viste, at forskellige til sneglen, eksisterer β-catenin i plasmamembranen, og TNFa øger nuklear translokation af Sneglen og β-catenin, men påvirker ikke membran β-catenin (fig. 5F). Tilsammen viste disse resultater, at TNF opreguleret Snail i HCT116 celler ved at aktivere AKT-signalering, der fører til phosphorylering af GSK-3β og efterfølgende stabilisere Snail.

TNFa Undertrykker ubiquitylering af Snail ved at hæmme Sammenslutningen af ​​Snail og GSK-3β

Fordi protein stabilitet Snail reguleres via ubiquitin-medieret proteasomalaktivitet nedbrydningsprocesser, vi spekulerede om stabiliseringen af ​​Snail af TNF medieres af undertrykkelse af Snail ubiquitylering. For at teste denne hypotese blev HCT116-celler behandlet med TNFa eller proteasominhibitor MG132 i 6 timer, og derefter sneglen blev immunopræcipiteret fra samme mængde af lysater. Ubiquitinering tilstand af Snail blev detekteret ved western blotting med et anti-ubiquitin antistof. Resultaterne viste, at sammenlignet med MG132, TNFa dramatisk undertrykte ubiquitylering af sneglen, selvom de samlede stabiliserede snail proteiner var parallelle (fig. 6A). Da GSK-3β er det vigtigste kinase, der phosphorylerer Sneglen og derefter inducerer protein nedbrydning af Snail [24], vi næste undersøgt sammenslutning af Sneglen og GSK-3β. HCT116-celler blev behandlet med TNFa eller MG132 i 6 timer, og derefter sneglen blev immunopræcipiteret fra samme mængde af lysater, og den tilknyttede GSK-3β blev målt ved Western blotting. Som vist i fig. 6B, sammenslutningen af ​​Snail med GSK-3β blev formindsket i celler behandlet med TNF, sammenlignet med celler behandlet med MG-132. Tilsvarende, når GSK-3β blev immunopræcipiteret fra HCT116 celler, de associerede sneglen blev markant nedsat i celler behandlet med TNFa sammenlignet med celler behandlet med MG-132 (fig. 6B). Tilsammen disse resultater viste, at TNF hæmmede sammenslutning af Snail med GSK-3β og efterfølgende undertrykt ubiquitylering af Snail.

(A) HCT116 celler blev behandlet med TNF (20 ng /ml) eller MG132 (10 uM ) i 6 timer. Efter Snail blev immunpræcipiteret fra samme mængde lysater (to nederste paneler) blev ubiquitinering af Snail undersøgt af western blotting. (B) HCT116-celler blev behandlet med TNFa (20 ng /ml) eller MG132 (10 uM) i 6 timer. Snail eller GSK-3β blev immunpræcipiteret henholdsvis fra lige store beløb af lysater og den tilhørende GSK-3β eller Snail blev påvist ved western blotting.

Diskussion

En stor udfordring under kræftbehandling er metastase induceret af kronisk inflammation. Imidlertid er de underliggende mekanismer ikke helt vist. Adskillige inflammatoriske mediatorer, såsom TGFp og IL-6, har vist sig at bidrage til invasion og metastase af cancere [3]. TNFa er en vigtig proinflammatorisk cytokin, som har en bred vifte af biologiske aktiviteter, herunder inflammation, apoptose, celleproliferation og differentiering [31]. Selvom TNFa er blevet betragtet som et middel mod cancer, er det i øjeblikket anerkendt, at kronisk forhøjet TNF i væv kan fremme tumorvækst, invasion og metastase [32]. Der er nogle rapporter om, at TNFa ekspression er forøget i serum fra CRC patienter [33]. TNFa ekspression er også forbundet med tumor progression af colorektale adenocarcinomer [34]. Desuden er High TNF udtryk stærkt forbundet med tumor tilbagefald hos CRC patienter med positiv lymfeknude metastase [34]. TNFa kan være nyttig som en maker for tidlig diagnosticering af CRC. I denne undersøgelse undersøgte vi et vigtigt signal akse, der styrer inflammatoriske cytokiner og inducerer EMT. Trods den væsentlige rolle af NF-KB i inflammatoriske processer, vi demonstreret, at AKT /GSK-3β-medieret stabilisering af sneglen er påkrævet for TNFa-induceret EMT i CRC-celler. Baseret på vores resultater, vi foreslået en model, hvor TNFa opregulerer sneglen via aktivering af AKT signalering og derved inhiberer GSK-3β-aktivitet. TNF hæmmer også sammenslutningen af ​​Sneglen og GSK-3β. Og så TNF stabiliseret Snail overførsel ind i kernen, falder epitel beslutningstagere E-cadherin og ZO-1 udtryk, øger mesenkymale beslutningstagere N-cadherin og fibronektin udtryk endelig inducerer EMT og fremmer tumor metastase.

EMT er blevet betragtet som det første trin i tumorinvasion og metastase. Nylige undersøgelser viste, at udtrykket profiler af EMT er korreleret med tumor kvaliteter og metastase af mammacancer [35], [36].