PLoS ONE: AZD1480 Blocks Vækst og tumorigenese af Retsinformation Aktiveret kræft i skjoldbruskkirtlen Cell Lines

Abstrakt

Vedvarende RET aktivering er en hyppig begivenhed i papillær skjoldbruskkirtlen carcinom (PTC) og medullært thyroidea carcinom (MTC). I disse kræftformer, RET aktiverer ERK /MAPK, PI3K /AKT /mTOR og JAK /STAT3 veje. Her testede vi effekten af ​​en JAK1 /2-hæmmer, AZD1480, i

in vitro

in vivo

væksten af ​​kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer, der udtrykker onkogen RET. Kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer huser

RET

/PTC1 (TPC-1),

RET

M918T (MZ-CRC1) og

RET

C634W (TT) ændringer, samt TPC-1-xenografter blev behandlet med JAK-inhibitor, AZD1480. Denne inhibitor førte til vækstinhibering og /eller apoptose af skjoldbruskkirtlen cancercellelinier

in vitro

, samt til tumorregression af TPC-1-xenografter, hvor den effektivt blokerede STAT3-aktivering i tumorceller og stromaceller. Denne inhibering var forbundet med nedsat proliferation, nedsat blodkar densitet, kombineret med forøget nekrose. AZD1480 undertrykt Men væksten i STAT3- mangelfulde TPC-1 celler

in vitro

og

in vivo

, viser, at dens virkninger i denne cellelinie var uafhængige af STAT3 i tumorcellerne. I alle cellelinjer, inhibitor JAK reduceret phospho-Y1062 RET niveauer og mTOR effektor phospho-S6, mens JAK1 /2 nedregulering af siRNA ikke påvirkede cellevækst eller RET og S6 aktivering. Afslutningsvis AZD1480 effektivt blokerer proliferation og tumorvækst af aktiverede Retsinformation thyroidea cancercellelinjer, sandsynligvis gennem direkte RET inhibering i cancerceller samt ved modulering af mikromiljøet (fx via JAK /phospho-STAT3 inhibering i endotelceller). Således bør AZD1480 betragtes som et terapeutisk middel til behandling af Retsinformation aktiveret skjoldbruskkirtelkræft

Henvisning:. Couto JP, Almeida A, Daly L, Sobrinho-Simões M, Bromberg JF, Soares P (2012) AZD1480 Blocks vækst og tumorigenese af Retsinformation Aktiveret Thyroid Cancer cellelinier. PLoS ONE 7 (10): e46869. doi: 10,1371 /journal.pone.0046869

Redaktør: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Italien

Modtaget: 18 juni 2012; Accepteret: September 6, 2012; Udgivet: 2 okt 2012

Copyright: © Couto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af den portugisiske Foundation for Science and Technology (FCT). Joana P. Couto er understøttet af en FCT tilskud SFRH /BD /40260/2007. Ana Almeida er understøttet af en FCT tilskud SFRH /BD /79135/2011. J. Bromberg er støttet af R01-CA87637-06, U54: CA148967, Marjorie og Charles Holloway Foundation, Lerner Foundation, Sussman Family Fund og Astra Zeneca. IPATIMUP er en Associate Laboratory i den portugisiske Ministeriet for Videnskab, teknologi og videregående uddannelse, der er delvist støttet af FCT. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller manuskript forberedelse

Konkurrerende interesser:. Jacqueline Bromberg har modtaget forskningsmidler fra AstraZeneca. Hun har haft en rådgivende rolle på AstraZeneca og Mediummune og modtog Honoria til foredrag. Der er ingen patenter eller produkter i udvikling eller markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

omstruktureret i løbet af transfektion (RET) proto-onkogen koder for en af ​​de første receptor (RTK’er), der blev anset for at være involveret i kræft [1]. RET ligander tilhører den glial celle- afledt neurotrofisk (GDNF) -familien og efter indgreb med RET, inducerer autophosphorylering af intracellulære tyrosinrester, som flere adaptere binder [2]. Disse adaptere medierer aktiveringen af ​​flere veje, herunder mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) signaling pathway, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway, c-jun N-terminal kinase (JNK) pathway, p38 pathway, SRC, ERK5, PLC-γ og Signal Transducer og aktivator af transkription (STAT) 3 [3].

den første onkogen rolle RET blev beskrevet i den mest almindelige endokrine kræft, papillær carcinom i skjoldbruskkirtlen (PTC) [4] som følge af genomiske omlejringer har ført til konstitutiv aktivering og øget celleoverlevelse, proliferation og motilitet [5].

RET

/PTC omrokeringer er den anden mest almindelige genetiske ændringer i PTC, fundet i 30% af tilfældene [6].

RET

punktmutationer blev også fundet i medullært thyroidea carcinom (MTC) [7], [8], der tegner sig for næsten alle arvelige tilfælde og omkring 50% af sporadisk MTC [9].

onkogen RET har været impliceret i mediering tumorassocierede inflammation, som mutantformer af RET inducerede ekspressionen af ​​IL-8 [10] og andre inflammatoriske molekyler [11]. Endvidere RET /PTC opreguleres et sæt inflammation- beslægtede gener i thyrocytter [12], [13], hvoraf mange tilhører IL-6 /JAK /STAT3 pathway [14]. IL-6 /JAK /STAT3 signalering udløses af IL-6 kobling til dets receptor-kompleks, der omfatter en receptor for IL-6 (IL-6R) og signalet transducerende komponent, gp130 [15]. Efterfølgende phosphorylering af receptor-associeret Jaks medierer tyrosinphosphorylering af statistikken, især STAT3. Derudover IL-6 aktiverer ERK /MAPK og PI3K /AKT pathways [16]. Dereguleret JAK /STAT signalering (hyperaktivering) er blevet beskrevet i en lang række sygdomme, herunder cancer [17] – [20]. Selektive JAK1 /2 små molekyler hæmmere, der er udviklet til at behandle JAK- muteret myeloproliferative sygdomme [21], [22] i øjeblikket i kliniske forsøg for en række kræftformer. AZD1480 er en potent lille molekyle JAK1 /2-hæmmer [23], der er under fase I kliniske forsøg til behandling af myeloproliferative sygdomme. Vi undersøgte virkningerne af AZD1480 på IL-6 /JAK og Retsinformation afhængig signalering (STAT3, ERK /MAPK og PI3K /AKT) samt sine biologiske virkninger i humane thyreoideacancer modeller (cellelinjer og en xenograftmodel). AZD1480 effektivt hæmmede væksten og tumorigenese af kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer huser onkogen

RET

ændringer, sandsynligvis gennem hæmning af PI3K /AKT-signalering, der understøtter brugen af ​​denne inhibitor for patienter med kræft i skjoldbruskkirtlen, især dem med avanceret MTC, for hvem der ikke er effektive behandlingsmuligheder.

Resultater

AZD1480 blokerer væksten af ​​kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer huser

RET

onkogene ændringer

i denne undersøgelse vi bestemt følsomhed kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer huser onkogene former for

RET

til JAK1 /2-hæmmer, AZD1480. Konkret har vi analyseret PTC-afledt TPC-1 (

RET

/PTC1 omordning), MTC-afledt MZ-CRC1 (

RET

M918T mutation) og TT (

RET

C634W mutation) cellelinier. Som sammenligning behandlede vi de samme cellelinjer med en MEK1 /2-inhibitor, AZD6244, som har vist sig at have lav effektivitet i

RET

-mutated celler [24], i modsætning til

BRAF

-mutated celler. I overensstemmelse anvendte vi to andre kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer, K1 (PTC-afledt) og C643 (anaplastisk thyroidea carcinoma- afledt), at havnen

BRAF

V600E og

HRAS

G13R mutationer, henholdsvis som kontrol af AZD6244 effekt. Cellerne blev behandlet over 5 på hinanden følgende dage med AZD6244, AZD1480 eller en kombination af begge lægemidler, og celletætheden blev bestemt.

AZD1480 hæmmede væksten af ​​alle

RET

-mutated /omarrangerede cellelinier efter 1 (MZ-CRC1, TT) og 2 dage (TPC-1) behandling (p 0,0001;. figur 1A) og minimalt faldt væksten af ​​C643, og samtidig have nogen virkning på K1 (fig S1.). Vi observerede, AZD6244 minimalt faldt væksten af ​​C643 og MZ-CRC1 efter 4/5 dages behandling (p 0,001;. Figur 1A og S1), havde ingen virkning på væksten af ​​TT (. Figur 1A) og faldt TPC- 1 væksten med 50% efter 5 dages behandling. I modsætning hertil AZD6244 inhiberede effektivt væksten af ​​

BRAF

– mutant K1 cellelinien (. Figur S1). Noget additiv eller synergistisk virkning af kombineret inhibering af MEKs og Jaks blev observeret. AZD1480 ikke hæmme væksten af ​​en ikke-malign rotte skjoldbruskkirtel cellelinje, PCCl3 (fig. 1A). IC50 er for AZD1480 blev bestemt til at være i den høje nM (~200-450 nM) for disse cellelinier (fig. 1B og S2), og nedsat som funktion af tid (48 og 72 timer), hvilket antyder en cytostatisk virkning (fig. 1B).

(a) TPC-1 blev MZ-CRC1 og TT-cellelinier behandlet med AZD6244 (1 uM), AZD1480 (1 uM), og en kombination af begge lægemidler (1 pM hver) i den angivne tid. En rotte- afledt non malign thyroid cellelinie, PCCl3, blev behandlet med AZD1480 (1 uM) eller kontrol DMSO. Væksten blev bestemt ved sulphorhodamin B assay. (B) cellelinjer blev behandlet i 48 eller 72 timer med forskellige koncentrationer af AZD1480 (0,1, 0,5 og 1 um) og celletæthed blev bestemt. Data er vist som gennemsnit ± SE af tre uafhængige eksperimenter. *** P. 0,0001

I betragtning af følsomheden af ​​

RET

-mutated /omarrangeret cellelinjer til AZD1480, vi yderligere analyseret cellecyklus profil TPC-1, MZ- CRC1 og TT behandlet i 72 timer med AZD1480 (fig. 2A). JAK-inhibitor medførte en G1 arrest i TPC-1 (94% mod 79% i kontrolgruppen, p = 0,01). I de tre cellelinjer blev procentdelen af ​​celler i S-fase faldt efter AZD1480 behandling (TPC-1: 2% vs. 8% i kontrolgruppen, p = 0,01; MZ-CRC1: 4% vs. 11%, p = 0,004; TT: 6% vs. 11%, p = 0,09). Tilsvarende er andelen af ​​celler i G2 /M blev også reduceret i TPC-1-celler behandlet med JAK inhibitor (1% vs. 13% i kontrolgruppen, p = 0,01). I MZ-CRC1 og TT, en betydelig stigning i subG1 population (betegnende for celledød ved apoptose) blev påvist (18% vs. 2%, i DMSO-behandlede, p = 0,04 og 11% vs. 0,6%, p 0,0001 henholdsvis) efter 72 timers AZD1480 behandling. For at bekræfte virkningen af ​​AZD1480 i apoptose, blev cellelinierne behandlet med AZD1480 i 48 timer og farvet med TUNEL reagens, afslører en stigning i antallet af apoptotiske MZ-CRC1 (p = 0,02) og TT (p = 0,1) -celler sammenlignet at DMSO behandlede celler (fig. 2B). Som forventet havde AZD1480 fremprovokere nogen apoptose i TPC-1 (fig. 2B). Sideløbende observerede vi forøgede niveauer af cyclin-afhængige kinase inhibitor, p27, og reducerede niveauer af cyclin D1 og af anti-apoptotisk protein, BCL-2, i AZD1480- behandlede celler (fig. 2C).

(A) TPC-1, MZ-CRC1 og TT blev behandlet med AZD1480 (1 uM; +) i 72 timer. Celler blev udsat for cyklusprofil analyse ved flowcytometri. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg (gennemsnit ± SE). (B) Celler blev behandlet med AZD1480 (1 uM) i 48 timer og apoptotisk celledød blev bestemt ved TUNEL. (C) AZD1480 inducerer p27 opregulering og cyklin D1 og BCL-2 nedregulering i skjoldbruskkirtlen kræft cellelinjer. TPC-1, MZ-CRC1 og TT cellelinjer blev behandlet med AZD1480 (1 uM) i 24 timer. Cellelysater blev probet med de angivne primære antistoffer, ved Western-blotting. * P 0,05; *** P. 0,0001

AZD1480 inducerer regression af TPC-1-xenografter

Virkningerne af JAK-hæmmer på

in vivo

vækst TPC- 1-celler blev vurderet ved subkutan injektion i flankerne af nøgne mus. Når tumorerne nåede -0,5 cm

3 blev musene behandlet med vehikel, AZD1480 eller AZD6244 i 16 på hinanden følgende dage (fig. 3A). Tumorerne fra kontrolmus og behandlede mus AZD6244- fortsatte med at vokse indtil dag 9 og på grund af deres store størrelse, blev musene aflivet. I modsætning hertil viste AZD1480- behandlede mus tegn på tumor regression efter 4 dage og efter 16 dage, de målte ~23% af deres oprindelige størrelse (fig. 3A). Immunhistokemisk farvning af repræsentative tumorsektioner viste signifikant phospho-STAT3 nedregulering af AZD1480 i tumorceller og stromale celler (endotelceller). MEK-inhibitor, AZD6244 reduceret phospho-ERK1 /2 niveauer i tumorer (fig. 3B). Histologisk fleste af tumormassen (90%) ud fra AZD1480- behandlede tumorer var sammensat af nekrotisk væv, mens størstedelen af ​​tumorer celler af kontrol- og AZD6244 grupper var levedygtige og aktivt prolifererende, som ses ved Ki67-farvning (fig. 3C) . Yderligere karakterisering af disse tumorer afslørede en reduktion i endotelceller (Meca-32) efter AZD1480 behandling, sammenlignet med kontrol og AZD6244 grupper (p = 0,06 og p 0,0001, fig. Figur 3C). Ingen signifikante forskelle blev påvist i antallet af apoptotiske celler (TUNEL), hvis andel var lav i hele tumorerne.

(A) TPC-1-celler (10

6) blev injiceret subkutant i flankerne af nøgne mus. Efter tumor engraftment (-0,5 cm

3), mus fordelt i fire grupper (n = 5 /gruppe) med lignende gennemsnitlige tumor mængder. Grupper blev behandlet med lægemiddelvehikel (ubehandlet), AZD6244, ved 25 mg /kg en gang om dagen, eller AZD1480, ved 30 mg /kg, hver anden dag. Tumorvolumener blev bestemt hver anden uge (gennemsnit ± SE). (B) AZD1480- og AZD6244- behandlet TPC-1 tumor snit blev immunfarvet for phospho-STAT3 og phospho-ERK1 /2-ekspression hhv. Phospho-STAT3-positive stromaceller er skitseret med en stiplet linje (forstørrelse: 400x). (C) JAK-hæmmer formindskes proliferation og vaskulogenese af TPC-1-xenografter. H 0,001; *** P. 0,0001

AZD1480- medierede væksthæmning er uafhængig af STAT3

Jaks er de vigtigste mediatorer af IL-6 /gp130 /STAT3-signalering, og i flere kræft modeller, er JAK inhibitorer ‘anti-tumorigene effekter medieret af STAT3. For at afgøre, om STAT3 var nødvendig for JAK-inhibitor-medieret vækst anholdelse, vi stabilt reduceret STAT3 i TPC-1 celler ved hjælp af en kort hårnål, som bestemt ved western-blot og immunhistokemi (fig. 4A, C2). Cellerne blev behandlet med AZD1480 i fire konsekutive dage og

in vitro

cellevækst blev overvåget, afslører signifikant vækstinhibering af TPC-1 shSTAT3 celler (p 0,0001;. Figur 4B).

In vivo

vækst blev vurderet ved at injicere shSTAT3 celler subkutant og, efter at have nået -0,5 cm

3 blev tumorbærende mus behandlet med vehikel eller AZD1480, i 21 dage. Kontrolgruppen blev aflivet efter 8 dage på grund af den store størrelse af tumorerne. AZD1480 behandling inducerede regression (tumorvolumen var ~24% af den oprindelige størrelse; p 0,0001) af TPC-1 shSTAT3 tumorer (Fig 4C1.). Phospho-STAT3 blev bekræftet at blive reduceret i tumorceller af de køretøj og behandlede mus, men ikke i stromale celler, medens tumor- og stromal- phospho-STAT3 blev væsentligt reduceret i AZD1480- behandlede mus (fig. 4C2).

(a) STAT3 blev knockdown i TPC-1-celler ved en kort hårnål. Phospho-STAT3 og STAT3 nedregulering blev bekræftet ved western-blotting. (B) TPC-1 shSTAT3 celler blev behandlet med DMSO eller AZD1480 (1 uM) og vækstinhibering blev bestemt ved SRB-assayet. Resultaterne er gennemsnit ± SE af tre uafhængige eksperimenter. (C) TPC-1 shSTAT3 celler blev injiceret subkutant i begge flanker af nøgne mus. Når tumorerne nåede -0,5 cm

3, mus var ligeligt fordelt i to grupper: en var kontrolgruppen (bærestof) og den anden blev behandlet med AZD1480 ved 30 mg /kg, hver anden dag. (C1) Tumorvolumen blev målt ved de angivne tidspunkter. Resultaterne repræsenterer middelværdi ± SE. (C2) Repræsentant H 0,0001

AZD1480 hæmmer RET Y1062 phosphorylering og nedstrøms PI3K /AKT /mTOR signalering

oncogen RET effektor veje omfatter ERK /MEK, PI3K /AKT og STAT3 [ ,,,0],3]. I betragtning af de betydelige vækst undertrykkende handlinger JAK-hæmmer på den onkogene

RET

– transformeret TPC-1 xenograft uafhængigt af STAT3, vi hypotese, at AZD1480 kan have en direkte virkning på RET-medieret signalering. Vi behandlede TPC-1, MZ-CRC1, TT (fig. 5A) samt en model af inducerbar RET /pTC3 ekspression i PCCL3 (fig. 5B), med AZD1480 og /eller AZD6244, i 24 timer. Ekspressionsniveauerne og phosphorylering niveauer af RET samt af de vigtigste effektorer af JAK /STAT3, ERK /MAPK og PI3K /AKT pathway, nemlig phospho-STAT3 Tyr705, phospho-ERK1 /2 Thr202 /Tyr204 og phospho-AKT Ser473 /phospho -s6 Ser235 /236 henholdsvis blev undersøgt ved western-blot-analyse. AZD1480 og AZD6244 effektivt faldt niveauerne af deres downstream mål phospho-STAT3 og phospho-ERK1 /2, henholdsvis i alle cellelinjer (fig. 5A, B). MZ-CRC1 udtrykte ikke phospho-ERK1 /2 ved basale niveauer (fig. 5A). Derudover AZD1480 reducerede niveauerne af phospho-ERK1 /2 i PCCl3-RET /pTC3 og TT, samt phospho-AKT, phospho-S6 og phospho-RET i alle cellelinjer (fig. 5A, B). I modsætning hertil AZD6244 behandling øget phospho-STAT3 i TPC-1-celler, forøget phospho-AKT og phospho-S6 i MZ-CRC1 celler og forøget phospho-RET i PCCl3-RET /pTC3 celler (fig. 5A, B). Der er ingen beviser til dato viser en funktionel sammenhæng mellem RET og Jaks. For at bestemme om den faldt phospho-RET skyldtes ikke-tilsigtede virkninger AZD1480, vi knockdown JAK1 /2-ekspression i TPC-1, MZ-CRC1 og TT-celler ved lille interfererende (si) RNA. Efter 48 timer blev JAK1, JAK2 og phospho-STAT3 niveauer nedreguleret i alle cellelinjer, med nogen virkninger på phospho-RET, phospho-ERK1 /2 og phospho-S6 (fig. 6A). I modsætning til AZD1480, havde JAK1 /2 knockdown ikke nedsætte proliferationen af ​​nogen af ​​cellelinierne, som ses ved BrdU-inkorporering (fig. 6B). Vi udførte et in vitro kinase assay og kontrolleret, at AZD1480 direkte hæmmet RET-aktivitet:. 40% hæmning ved 0,001 pM, 90% hæmning 0.1 uM og 99% ved 1 pM (. Fig S3)

(A ) TPC-1, MZ-CRC1, TT og a (b) PCCl3-RET /pTC3 doxycyclin-inducerbar cellelinie blev behandlet i 24 timer med AZD1480 (1 uM), AZD6244 (1 uM), eller en kombination af begge lægemidler. Totalt celleprotein ekstrakter blev probet med antistoffer for de angivne effektorer af JAK /STAT3, ERK /MAPK og PI3K /AKT signalveje samt for phospho-RET Y1062. I det nedre panel af TPC-1, DMSO (D) lane er ikke-sammenhængende med AZD6444 (6244) lane, i samme gel. (C) TPC-1-xenografter repræsentative snit blev probet for aktiveringen af ​​STAT3 (phospho-STAT3), ERK /MAPK (phospho-ERK1 /2) og PI3K /AKT (phospho-S6) signalveje. Kvantificering er repræsenteret grafisk (gennemsnit ± SE). * P 0,05; ** P. 0,001

(A) Udtrykket af JAK1 eller /og JAK2 blev nedreguleret af siRNA i TPC-1, MZ-CRC1 og TT-cellelinjer. bestemtes niveauerne af de angivne proteiner og deres phosphoryleringsstatus efter 48 timer, ved western-blot-analyse. (B) Celleproliferation blev målt ved BrdU inkorporering, 48 timer efter transfektion med en kombination af siRNA’er rettet mod både JAK1 og JAK2. Resultaterne repræsenterer middel ± SE af tre uafhængige eksperimenter. * P. 0,05

Vi undersøgte phosphoryleringsniveauerne af STAT3, ERK og S6 i TPC-1-xenografter behandlet med køretøj, AZD1480 og AZD6244. I lighed med, hvad der observeres i TPC-1 og de andre RET-aktiverede cellelinjer

in vitro

, JAK-hæmmer førte til et betydeligt fald i phospho-S6 og phospho-STAT3 niveauer (p 0,001) i tumoren, mens der blev observeret noget fald i køretøjet eller AZD6244- behandlede tumorer (fig. 5C). Phospho-ERK niveauer var uændret mellem kontrol og AZD1480 grupper og blev signifikant reduceret (p = 0,01) i AZD6244- behandlede gruppe (fig. 5C).

Diskussion

RET

genændringer er onkogene “drivere” i kræft i skjoldbruskkirtlen patogenese, især i MTC og PTC. Onkogen RET er en potent aktivator af ERK /MAPK og PI3K veje og kan inducere ekspressionen af ​​inflammatoriske mediatorer, såsom CCL2, CXCL-1, GM-CSF, IL-1β og IL-6 [5], [25] – [ ,,,0],27]. Desuden kan RET /PTC og mutant RET inducerer phosphorylering af STAT3 enten direkte [14], [28], eller i en JAK-afhængig måde [29]. Jaks er tyrosinkinaser som medierer IL-6- afhængig STAT3-aktivering, som har vist sig at fremme udviklingen af ​​kræft i talrige eksempler på faste tumorer. Vigtigere, JAK2 aktiverende mutationer er kritiske i patogenesen af ​​myeloproliferative lidelser og som har ført til udviklingen af ​​Jaks småmolekylære inhibitorer [22], [23]. Heri undersøgte vi de biologiske virkninger af en JAK1 /2-hæmmer, AZD1480, på væksten af ​​PTC- og MTC afledt kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer huser aktivering

RET

/PTC omrokeringer og

RET

mutationer, henholdsvis. Vi observerede, at AZD1480 hæmmede væksten af ​​TPC-1, MZ-CRC1 og TT med IC

50’erne 500 nM, hvilket er 2 til 10 gange lavere end rapporteret for andre kræft cellelinjer [23], [30]. Blokken i væksten skyldtes en G1 cellecyklusstop i TPC-1-celler, mens den i MZ-CRC1 og TT, JAK inhibering signifikant øget apoptose. På den anden side, en MEK1 /2-inhibitor, AZD6244, ikke påvirkede

in vitro

væksten af ​​MZ-CRC1 og TT. Ingen additive eller synergistiske virkninger på

in vitro

vækst blev observeret ved at kombinere begge hæmmere. Tværtimod AZD6244 (men ikke AZD1480) hæmmede effektivt væksten af ​​en

BRAF

V600E- mutant cellelinje, K1. Både AZD1480 og AZD6244 havde en minimal effekt på væksten af ​​en

RAS

– mutant cellelinie, C643. Ufølsomhed Ret-aktiverede skjoldbruskkirtlen cancerceller til MEK-inhibering er tidligere blevet påvist, i modsætning til den høje følsomhed af thyreoidea cancerceller udtrykker

BRAFV600E

[31]. Denne modstand kan afspejle evne onkogen RET at aktivere alternative signalveje, især PI3K /AKT /mTOR pathway [32]. Desuden AZD6244 forårsagede opregulering af phospho-RET Y1062 i PCCl3-RET /pTC3 model samt af mTOR effektorer, phospho-S6 og phospho-AKT, i MZ-CRC1. Overaktivering af mTOR pathway som reaktion på MEK-inhibering kan muligvis forklares ved lindring af feed-back-inhibering og forud er rapporteret i andre modeller [33], hvor den medierer celle resistens over for AZD6244 [34], [35].

Desuden AZD1480 inhiberede kraftigt

in vivo

væksten af ​​TPC-1-xenografter, hvilket resulterer i tumorregression, mens tumorerne fra AZD6244- behandlede mus voksede lidt mere end kontrol- tumorer, hvilket antyder, at behandling

RET

-mutated skjoldbruskkirtelkræft med denne inhibitor kan fremme tumorvækst. I TPC-1 tumorer, og på samme måde som de virkninger,

in vitro

, AZD1480 blokeret spredning, mens ikke væsentligt påvirker apoptose. Imidlertid

in vivo

observerede vi markant tumorregression, med tumorer, der udviser store områder af nekrotisk væv og et betydeligt fald i antallet af blodkar. Sidstnævnte kan have forårsaget en nedgang i næringsstof og iltforsyning til tumorerne, sandsynligvis forklarer accentueret nekrose og dermed tumor reduktion. Sådanne virkninger på tumorvækst er tidligere blevet dokumenteret i andre kræft modeller (lunge, bryst, prostata, hjerne) [23], [36], [37]. I disse modeller JAK inhibering var særlig effektiv i phospho-STAT3-positive tumorer /cellelinier. Imidlertid AZD1480 har også vist, at inhibere væksten af ​​cancercellelinier uafhængigt af STAT3-aktivering, især ved højere doser [23], muligvis på grund ikke-tilsigtede virkninger af lægemidlet. I en nylig rapport, AZD1480 blokeret både JAK /STAT3 og FGFR3 signalering i myelomaceller [30]. For at teste om de væksthæmmende effekter af AZD1480 var afhængige af STAT3 i vores modeller, vi bankede-down STAT3 i TPC-1-celler. STAT3 mangel i disse celler ikke påvirkede deres følsomhed over for JAK inhibering sammenlignet med kontrolceller. Desuden AZD1480 var ligeledes effektive til at blokere væksten af ​​STAT3- deficient TPC-1-xenografter, som udviste omfattende nekrose, i lighed med AZD1480-behandlede parentale TPC-1 tumorer. Desuden har vi bankede-down JAK1 og JAK2 ekspression i TPC-1, MZ-CRC1 og TT-cellelinier ved siRNA, som ikke havde nogen virkning på deres proliferation. Disse data viser, at AZD1480 hæmmer væksten af ​​RET-aktiverede kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer

in vitro

in vivo

, uafhængigt af JAK /STAT3 signalering i kræftceller.

Vi søgte at identificere de mekanismer, forklarer væksthæmmende effekter af AZD1480

in vitro

in vivo

. I alle cellelinjer, AZD1480 effektivt reduceret phospho-STAT3 plan, herunder C634W mutant TT cellelinje, selv om dette onkogene form af RET blev beskrevet som aktivering STAT3 uafhængigt af Jaks, gennem to docking sites på RET (Tyr752 og Tyr928) [28] . Vi foreslår, at vores resultater er forskellige på grund af brugen af ​​et andet JAK-hæmmer, med forskellige styrker, end den, der anvendes af Schuringa

et

al

.

Indtil videre ingen data har vist en rolle for Jaks i RET aktivering (Y1062 phosphorylering) eller om aktivering af dens downstream MAPK og PI3K veje. Vi bestemt, at AZD1480 blokeret RET Y1062 fosforylering i TPC-1, MZ-CRC1, TT, samt i en betinget model af

RET /pTC3

udtryk. Selv AZD1480 ikke har forhindret ERK /MAPK-vejen i de fleste af vores cellelinjer, det blokerede aktiveringen af ​​PI3K effektorer AKT og S6. Lignende resultater blev opnået i AZD1480- behandlede TPC-1-xenografter, hvor der blev påvist nogen forskelle i ERK /MAPK-niveauer, og phospho-S6 blev signifikant nedreguleret. Vi viste, at disse effekter var uafhængige af Jaks, som phospho-RET, phospho-ERK og phospho-S6-niveauer ikke ændre på JAK1 /2 knockdown af siRNA. Vi viste, at AZD1480 direkte inhiberer kinaseaktiviteten af ​​rekombinant RET på en dosis-afhængig måde, hvilket sandsynligvis understreger de inhibitoriske og mutant-ret specifikke effekter af AZD1480 på væksten og overlevelsen af ​​skjoldbruskkirtlen cancerceller. Faktisk

in vitro

kinase analyser fra en tidligere rapport har vist, at AZD1480 kan hæmme -50% og 90% af RET aktivitet 0.1 og 1 pM koncentrationer, henholdsvis [23].

I konklusion, viste vi, at JAK1 /2-hæmmer, AZD1480, kan blokere væksten og inducere celledød af kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer huser forskellige former for onkogene

RET in vitro

in vivo

. I disse celler AZD1480 sandsynligt inhiberer RET direkte, hvilket fører til den deraf følgende blokade af PI3K /AKT /mTOR pathway, som synes at være den præferentielle onkogene kraft drivende Ret-aktiverede celler. Selv om disse effekter var uafhængige af STAT3 i skjoldbruskkirtlen cancerceller, AZD1480 inhiberes effektivt phospho-STAT3 i stroma, især i endotelceller. Faktisk er JAK inhibitorer kendte modulatorer af mikromiljøet gennem hæmning af angiogenese og myeloid celle tilvejebringelse i en STAT3- afhængig måde [36], [38]. I betragtning af den betydelige nedgang i vaskularisering af AZD1480- behandlede tumorer og deraf følgende tumor nekrose, foreslår vi, at phospho-STAT3 hæmning i mikromiljø (endotelceller) samarbejder med RET hæmning i kræftceller til at fremkalde tumorregression. Derudover kan vi ikke kassere at andre RET-uafhængig tyrosinkinaser (såsom FLT1, FGFR [23]) kan påvirkes af AZD1480, bidrager til væksten anholdelsen af ​​Retsinformation aktiverede celler og tumorer.

Det er vigtigt, MZ -CRC1, der huser M918

RET

mutation associeret med MEN2B syndrom, var meget følsomme over for de væksthæmmende effekter af AZD1480. Patienter diagnosticeret med MEN2B udvikle sig hurtigt fremadskridende, multifokal MTC med lymfeknudemetastaser, normalt kræver total thyroidectomy før 1 års alderen [39]. Den større følsomhed MZ-CRC1 til AZD1480 sammenlignet med TT (huser mindre aggressiv C634W mutation), kan forklares med forskellige kapaciteter af MEN2A- og MEN2B- RET mutanter til at aktivere nedstrøms veje, nemlig PI3K /AKT-vejen [40]. Tilsammen disse resultater understøtter brugen af ​​AZD1480 at behandle aggressive former for kræft i skjoldbruskkirtlen, især MEN2B- MTC.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle procedurerne i dyr forskning blev inkluderet i en protokol (antal 0.011.091) godkendt af MSKCC Institutional Animal Care og brug Udvalg (IUAC) efter forsøgsdyr Welfare Act, vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr og retningslinjerne og politikker for gnaver eksperiment.

Cell kultur og narkotika

TPC-1, 1 r, C643 (leveret af prof Marc Mareel, Belgien) og TT (købt fra American Type Culture Collection – ATCC) [29], [ ,,,0],41] cellelinier blev opretholdt i RPMI, 10% FBS, 1% PenStrep. PCCl3-RET /pTC3 blev leveret af Dr. James Fagin og blev dyrket som tidligere beskrevet [13]. MZ-CRC1 (leveret af Dr. Robert Hofstra, Nederlandene) [29] og 293T (ATCC) blev holdt i DMEM, 10% FBS, 1% PenStrep. Alle cellekulturreagenser var fra GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, USA. AZD1480 [23] og AZD6244 [24] var gaver fra Dennis Huszar og Michael Zinda (AstraZeneca, London, UK).

Lentivirale infektioner og generering af stabile cellelinier

STAT3 shRNA lentiviral konstruktion er tidligere blevet beskrevet [42]. Virale partikler, der bærer konstruktionerne blev dannet i 293T-celler. De virale partikler i supernatanten blev udfældet ved hjælp af en polyethylenglycol virus nedbør løsning (System Biosciences LLC, Mountain View, CA, USA). Lentivirale konstruktioner omfattede en transkriptionskassetten kodning forbedret grønt fluorescerende protein [42], der tillod udvalg af celler ved at sortere.

Hele celle protein ekstrakter og vestlige blotting

Celler blev lyseret i radio-immunopræcipitationsassay buffer, suppleret med protease og phosphataseinhibitorer (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Proteiner blev kvantificeret under anvendelse af et modificeret Bradford assay (Biorad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), opløst ved SDS-PAGE og overført til Hybond ECL-membraner (GE Healthcare, Little Chalfont, England). De primære antistoffer til phospho-STAT3 (Tyr705), STAT3, phospho-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) ERK1 /2, phospho-AKT (Ser473), AKT, phospho-S6 (Ser235 /236), og S6 var fra cellesignalering Technologies, Inc., Danvers, MA, USA. Cyclin D1 antistof var fra NeoMarkers, Fremont, CA, USA. Actin antistof, phospho-RET (Y1062), total RET (C-19) og p27 var fra Santa Cruz BT, Santa Cruz, USA, BCL-2-antistof var fra DAKO, Glostrup, Danmark, og α-tubulin var fra Sigma Aldrich , St. Louis, MO, USA. Peroxidase- konjugerede sekundære antistoffer var fra Santa Cruz BT.