PLoS ONE: Murint lungekræft Øger CD4 + T-celle apoptose og Reducerer Gut proliferativ Kapacitet i Sepsis

Abstrakt

Baggrund

Dødeligheden er betydeligt højere i septiske patienter med kræft end i septiske patienter uden en historie af kræft. Vi har tidligere beskrevet en model af pancreascancer efterfulgt af sepsis fra

Pseudomonas aeruginosa

lungebetændelse, hvor kræft septisk mus har højere dødelighed end tidligere raske septiske mus, forbundet med forøget tarm epitel apoptose og nedsat T-celle apoptose. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme, om dette udgør en fælles vært reaktion ved at skabe en ny model, hvor både type kræft og modellen til sepsis ændres.

Metoder

C57BL /6 mus fik en injektion af 250.000 celler af lungekræft line LLC-1 i deres højre lår og blev fulgt tre uger for udvikling af tydelige tumorer. Mus med cancer og mus uden cancer blev derefter udsat for cecal ligering og punktering og aflivet 24 timer efter indtræden af ​​sepsis eller efterfulgt 7 dage for overlevelse.

Resultater Salg

Cancer septisk mus havde en højere dødelighed end tidligere rask septisk mus (60% vs. 18%, p = 0,003). Kræft septisk mus var faldet antallet og hyppigheden af ​​milt CD4 + lymfocytter sekundært til øget apoptose uden ændringer i milten CD8 + tal. Intestinal proliferation blev også reduceret i cancerpatienter septisk mus. Cancer septisk mus havde en højere bakteriebyrden i bughulen, men dette var ikke forbundet med ændringer i lokal cytokin, neutrofil eller dendritiske celle-responser. Kræft septisk mus havde biokemisk tegn på forværret nyrefunktion, men der var ingen histologiske tegn på nyreskade.

Konklusioner

Dyr med kræft har en signifikant højere dødelighed end tidligere raske dyr efter sepsis. De potentielle mekanismer forbundet med denne forhøjede dødelighed varierer betydeligt baseret på modellen af ​​cancer og sepsis udnyttet. Mens lymfocytapoptose og tarm integritet er begge ændres ved kombinationen af ​​kræft og sepsis, varierer mønstrene i disse forandringer i høj grad afhængig af de anvendte modeller

Henvisning:. Lyons JD, Mittal R, Fay KT, Chen CW, Liang Z, Margoles LM et al. (2016) Murine lungekræft Øger CD4 + T-celle apoptose og Reducerer Gut proliferativ Kapacitet ved Sepsis. PLoS ONE 11 (3): e0149069. doi: 10,1371 /journal.pone.0149069

Redaktør: Philip Alexander Efron, University of Florida, USA

Modtaget: 26 august, 2015; Accepteret: 27 januar 2016; Udgivet: 28 mar 2016

Copyright: © 2016 Lyons et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra National Institutes of Health (GM104323, GM095442, GM072808, GM109779, GM113228). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. Coopersmith er formand for Society of Critical Care Medicine. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Sepsis er den førende dødsårsager blandt kritisk syge patienter i USA med mellem 230.000 og 370.000 mennesker dør af sygdommen hvert år [1]. Patienter med malignitet er næsten ti gange større sandsynlighed for at udvikle sepsis end den generelle befolkning [2], og kræft er den hyppigste co-morbiditet i septiske patienter [3-5]. Sepsis er også den førende årsag til ICU optagelse i patienter med cancer [6,7]. Vigtigere, kræft er også co-morbiditet forbundet med den største risiko for død i sepsis, med hospital dødelighed over 50% hos patienter med kræft og enten svær sepsis eller septisk shock [5,7-9].

ætiologien bag den øgede dødelighed ses i cancer patienter, som udvikler sepsis sammenlignet med tidligere raske patienter, som udvikler sepsis er multifaktoriel [2,10]. Mens nogle dødsfald er relateret til immunosuppression forårsaget af kræft behandling såsom kemoterapi eller strålebehandling, andre er sandsynligvis relateret til en reduceret evne til værten på passende reagere på infektion i fastsættelsen af ​​kroniske systemiske ændringer i forbindelse med underliggende malignitet. Dyremodeller for kræft, isoleret, viser, at ikke alene er tumormikromiljøet ændret, men at systemisk T-celle udmattelse og generaliseret immunsuppression er også induceret af cancer [11]. Endvidere er værtens reaktion på en ikke-dødelig infektion markant ændret efter kræft med fænotypisk udmattelse i T-celler associeret med stigende ekspression af co-inhiberende receptorer [12].

Der er talrige ligheder i værtens respons til både kræft og sepsis [13]. I et forsøg på at forstå, hvorfor værter med kræft har øget mortalitet efter sepsis sammenlignet med tidligere raske værter, har vi beskrevet en model af pancreascancer efterfulgt af sepsis fra

Pseudomonas aeruginosa

lungebetændelse [14]. Mortaliteten var højere hos cancer septisk mus end tidligere raske mus og dette var forbundet med et fald i T-lymfocyt apoptose og en stigning i både gut epithelial apoptose og bakteriæmi. Interessant, forhindrer lymfocytapoptose-en strategi i forbindelse med ensartet succes i andre prækliniske modeller af sepsis-var forbundet med øget dødelighed i kræft septisk mus [15].

Trods en større forståelse af patofysiologien af ​​sepsis end nogensinde før [16-18], har der været en bemærkelsesværdig evne til at oversætte prækliniske modeller af sepsis i effektive behandlinger på sengekanten, hvor ledelsen er generelt understøttende endnu ikke-selektive, med undtagelse af målrettede antimikrobiel terapi [19]. En af grundene (af mange) for svigt af præ-kliniske forsøg for at oversætte til effektive terapier for sepsis er, at dyreforsøg udføres i en homogen tidligere sund befolkning, mens humane undersøgelser er udført på heterogene patienter ofte med flere komorbiditeter. Som sådan, vi søgte at afgøre, om vores tidligere prækliniske fund i kræft og sepsis ville være generaliseres, hvis vi ændrede både type kræft og modellen til sepsis. For at undersøge dette, har vi udviklet en ny klinisk relevant model for lungekræft efterfulgt af sepsis fremkaldt af cecal ligation og punktering.

Materialer og metoder

Dyr

Mandlige og kvindelige C57BL /6 mus blev anvendt i alle eksperimenter med køn matchning mellem eksperimentelle og kontrolgrupper. Dyr var 6-8 uger gamle inden påbegyndelse af eksperimenterne. En undergruppe af dyr blev derefter injiceret med tumorceller (detaljer nedenfor), og alle mus blev derefter overvågede i yderligere tre uger før en delmængde blev underkastet cecal ligering og punktering (CLP, også beskrevet nedenfor), på hvilket tidspunkt de blev overvåget i 1 7 dage, afhængigt af om de blev brugt til ikke-overlevelse eller overlevelse eksperimenter. dyr var således et minimum af 9 uger gammel og højst 12 uger gamle på tidspunktet for aflivning. Eksperimenter blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer for anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Emory University School of Medicine (Protokol DAR-2001875-082815BN). Alle dyr blev opstaldet i et godkendt universitet dyr facilitet og fik fri adgang til mad og vand hele vejen igennem. Dyr, der blev injiceret med tumorceller blev overvåget for at sikre, at tumorer ikke danne sår og ikke hindrer dyr ambulation ifølge Emory IACUC retningslinjer for tumorbyrde. Efter CLP modtog alle dyr buprenorphin postoperativt i et forsøg på at minimere dyrenes lidelser. For ikke-overlevelse undersøgelser blev dyrene aflivet 24 timer postoperativt via kvælning med CO2 eller forblødning under dyb ketamin anæstesi. En anden undergruppe af dyr blev fulgt for overlevelse i 7 dage efter operationen. Under denne overlevelse eksperiment blev dyrene kontrolleret to gange dagligt. Ud over at observere de samme endepunkter over omgivende tumorvækst skitseret, blev dyrene også kontrolleres for at afgøre, om de var døende relateret til driften. Dyr, der enten mødte tumor endpoints eller var døende blev aflivet ved hjælp af humane endepunkter. Døende dyr blev identificeret som følger: a) kirurgiske komplikationer reagerer øjeblikkelig intervention (sår dehiscens, blødning, infektion), b) medicinske tilstande reagerer på behandling, såsom selv-lemlæstelse, svær åndedrætsbesvær, icterus, større organsvigt eller umedgørlig diarré, eller c) kliniske eller adfærdsmæssige symptomer ikke reagerer på passende intervention vedvarende for 1 dag, herunder væsentlig inaktivitet, besværet vejrtrækning, indsunkne øjne, foroverbøjet kropsholdning, hårrejsning /sammenfiltret pels, en eller flere unresolving sår, og unormal vokalisering, når de håndteres. Dyr, der overlevede 7 dage postoperativt blev ofret ved afslutningen af ​​dette eksperiment ved hjælp kvælning med CO2.

Kræft model

En murine lunge carcinom cellelinje (LLC1, American Type Culture Collection, Manassas , VA) blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1% glutamin, 1% penicillin-streptomycin og 1% 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre. Begrundelsen for at bruge en lungekræft cellelinje er, at lungekræft har den næsthøjeste dødelighed for solide tumorer i septiske patienter (2) (bugspytkirtelkræft er det højeste og blev brugt til vores tidligere eksperimenter i sepsis og kræft). Efter ekspansion blev cancerceller dissocieret fra vækst kolber via inkubation med 0,25% trypsin, vasket, centrifugeret i 10 minutter ved 1500 RPM og derefter resuspenderes i phosphatbufret opløsning (PBS) til en slutkoncentration på 250.000 celler pr 0,2 ml (levende celler valgt via trypanblåt undersøgelse). Mus randomiseret til at modtage kræft havde en enkelt subkutan injektion af 250.000 tumorceller langs højre inderlåret (kræft gruppe) og blev fulgt i 3 uger før CLP at give mulighed for tumorvækst. Kontrol mus umanipulerede og havde således ingen intervention før CLP (tidligere rask gruppe), men blev overvåget for en identisk tid som kræft mus så dyr ville være alder matchede.

Sepsis model og forsøgsgrupper

en undergruppe af kræft mus og tidligere raske mus blev derefter udsat for CLP, en etableret model af polymikrobielle peritonitis [20]. Kort beskrevet under isofluran-narkose blev en lille midtlinje abdominal incision, og coecum blev blotlagt og ligeret under ileocecal ventil, undgå tarmobstruktion. Coecum blev punkteret to gange med en 25 gauge nål og presses forsigtigt at ekstrudere en lille mængde afføring. Efter placering coecum tilbage i maven, blev den abdominale væg lukket i lag. Umiddelbart efter CLP, mus modtog subkutane injektioner af a) væsker (1 ml 0,9% saltvand), som vedrører umærkelige tab, b) antibiotika (50 mg /kg ceftriaxon, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO og 35 mg /kg metronidazol, Apotex Corp, Weston, FL) at efterligne den kliniske situation, hvor septiske patienter får antimikrobiel behandling og c) smertestillende medicin (0,1 mg /kg Buprenorfin, McKesson Medical, San Francisco, CA) for at minimere smerte og lidelse. Dyrene blev enten fulgte 7 dage for overlevelse eller aflivet på 24 timer for prøvetagning. Antibiotika blev re-doseret med 12, 24 og 36 timer efter operation i overlevelse studier.

Vi har tidligere udgivet en omfattende immunologisk vurdering af lungekræft i umanipulerede mus [11] så ikke gentage disse undersøgelser. Men vi ikke tidligere har data om mange af de resultater analyseret i denne undersøgelse og så udførte eksperimenter i både septisk og ikke-septiske dyr, hvor passende, med henblik på at forstå konsekvenserne af kræft i isolation, sepsis i isolation, og kombinationen af cancer og sepsis. Det følgende er terminologien for hver forsøgsgruppe: a) umanipulerede (mus, der fik hverken kræft eller sepsis), b) kræft (mus, som modtog tumorcelleinjektion alene), c) tidligere rask septisk (mus, der undergik CLP alene uden forudgående intervention), og d) kræft septisk (mus med tumorceller injektion fulgte tre uger senere ved CLP).

leukocyt analyse

Fænotypisk flowcytometrisk analyse af leukocytter blev udført på forarbejdede cellulære suspensioner af splenocytter (hele milt fjernet på tidspunktet for aflivning) eller peritoneal væske (2,5 ml PBS injiceret i bughinden og trukket tilbage efter 5 sekunders forsigtig rystning). Antallet af celler pr ml suspension blev beregnet under anvendelse af en Nexcelom Auto Cellometer, hvis resultater blev anvendt til at bestemme absolutte celleantal. Følgende antistoffer blev anvendt til at farve celler før analyse: for peritonealvæske, anti-GR1.1 FITC (BD Bioscience, San Jose, CA), anti-CD11 PerCP (BioLegend, San Diego, CA), anti-CD11 c PeCy7 ( eBioscience, San Diego, CA), og anti-MHC II APC Cy7 (eBioscience); for splenocyt fænotypebestemmelse, anti-F4 /80 PerCP (BioLegend), anti-CD11 c PeCy7 (eBioscience), anti-CD11 APC (eBioscience), anti-B220 Alexa700 (BD Bioscience), og anti-MHC II APC Cy7 (eBioscience).

for at bestemme hyppigheden af ​​apoptotiske lymfocytter blev splenocytter indsamlet fra ofrede dyr og behandles til en suspension af 1×10

7cells /ml, og 1×10

6 splenocytter blev derefter behandlet på en kommercielt tilgængelig Annexin V og 7-AAD kit (BioLegend) efter producentens instruktioner. Celler blev derefter farvet med anti-CD4-PO (Invitrogen, Carlsbad, CA), anti-CD8-PB (eBioscience) for at bestemme frekvensen af ​​pro-apoptotiske CD4 og CD8 T-celler. En gating strategi udelukket døde celler farves positive for 7-AAD fra analysen.

For prøver undergår intracellulær cytokin-farvning, 1x 10

6 splenocytter blev udpladet i en 96-brønds plade. Celler blev suspenderet og inkuberet i RPMI 1640 dyrkningsmedium og stimuleret i fire timer under anvendelse af phorbol 12-myristat 13-acetat (30 ng /ml) og ionomycin (400 ng /ml) med 10 ug /ml Brefeldin A ved 37 ° C. Efter stimulering blev cellerne farvet med anti-CD4 PacBlue (BD Bioscience), anti-CD8 PacOrange (Life Technologies Carlsbad, CA), anti-IL-2 FITC (BD Bioscience), anti-IL-4 PE (eBioscience), anti-CD44 PerCP (BioLegend), anti-CCR4 PeCy7 (BioLegend), anti-CXCR3 APC (eBioscience), og anti-IFNy Alexa700 (BD Bioscience). En LSR II flowcytometer (BD Biosciences) blev anvendt til at køre alle prøver og FlowJo 10.0.8r1 software (Tree stjerne, San Carlos, CA) blev anvendt til at analysere alle data.

Intestinal permeabilitet

ved 19 timer efter CLP blev mus tvangsfodret med 0,5 ml fluoresceinisothiocyanat-dextran (FD4) ved en koncentration på 22 mg /ml i PBS (Sigma-Aldrich) [21,22]. Plasma opsamlet på tidspunktet for aflivning 5 timer senere blev derefter fortyndet med et tilsvarende volumen PBS, og FD4 koncentrationen blev bestemt ved flourospectrometry med excitation /emission bølgelængder på 485/520 nm med en standardkurve af serielle fortyndinger (BioTex Synergy HT, Winooski, VT).

Intestinal proliferation

Prolifererende intestinale epitelceller blev farvet med 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU). Ved 90 minutter inden aflivning modtog mus intraperitoneale injektioner af BrdU (5 mg /ml i 0,9% saltvand, Sigma-Aldrich) at mærke S-fase celler [23,24]. Jejunal Vævet blev derefter fikseret i 10% formalin i 24 timer, før den indlejret i paraffin og slide-monteret i 5 um sektioner. Objektglas blev derefter afparaffiniseret, rehydratiseret, og inkuberet i 1% hydrogenperoxid i 15 minutter før den blev opvarmet i en trykkoger i antigen decloaker (Biocare Medical, Concord, CA) i 45 minutter. Protein Block (Dako, Carpinteria, CA) blev udført i 30 minutter ved stuetemperatur, og objektglas blev inkuberet natten over ved 4 ° C med monoklonalt rotte-anti-BrdU (1: 500; Accurate Chemical og Scientific, Westbury, NJ). Prøver blev derefter inkuberet med gede-anti-rotte-antistof (1: 500; Accurate Chemical Scientific) og streptavidin peberrodsperoxidase (1: 500; Dako), hver i en time ved stuetemperatur. Diaminobenzidin (DAB) blev anvendt til at udvikle objektglassene i 2-3 minutter, og kontrastfarvning udførtes med hematoxylin. BrdU-positive celler blev kvantificeret i 100 sammenhængende, godt orienteret tarm krypter

Intestinal apoptose

Apoptose af intestinale epitelceller blev kvantificeret ved hjælp af to komplementære teknikker:. Aktiv caspase-3 farvning og morfologisk analyse af hæmatoxylin-eosin farvede snit [25,26]. Sektioner blev behandlet som ovenfor med antigen decloaker og blev derefter blokeret med 20% normalt gedeserum (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Objektglas blev inkuberet natten over ved 4 ° C med kanin-anti-caspase-3 (1: 100; Cell Signaling, Beverly, MA) og derefter med gede-anti-kanin biotinyleret antistof (1: 500; Vector Laboratories) og streptavidin peberrodsperoxidase ( 1: 500; Dako) i en time hver ved stuetemperatur. Objektglas blev fremkaldt med DAB og derefter modfarvet. Caspase-3 positive celler blev talt i 100 sammenhængende tarm krypter.

Apoptotiske celler blev identificeret på hæmatoxylin-eosin-farvede sektioner ved at identificere karakteristiske morfologiske ændringer, herunder celle svind med kondenseret og fragmenterede kerner og kvantificere dem i 100 sammenhængende krypter .

villus længde

villus længde blev målt som afstanden i um fra krypten hals til villus spids i 12 på hinanden følgende godt orienteret jejunal villi hjælp Nikon Elements imaging software- EIS-Elements BR 3,10 (Nikon Instruments, Melville, NY).

Bakteriekulturer Salg

Kvantitative kulturer af fuldblod og peritonealvæske blev fremstillet ud fra serielle 10 gange fortyndinger af prøver i sterilt 0,9% saltvand. En 100 pi portion af ufortyndede prøve og hver fortynding fra 10

-1 til 10

-3 blev udpladet på blodagarplader (Remel, Lenexa, KS) og inkuberet ved 35 ° C i en CO 5%

2 atmosfære i 24 timer. Kolonitællinger blev opnået fra plader indeholdende færre end 300 kolonier. Antallet af kolonidannende enheder (CFU’er) pr ml oprindelige prøve blev bestemt ved at multiplicere antallet af kolonier ved den reciprokke af fortyndingen talt og korrigeret for mængden af ​​prøven belagt.

Cytokiner

fuldblod, peritonealvæske og bronchoalveolær lavage (BAL) væske blev opsamlet og derefter centrifugeret ved 10.000 rpm i 10 minutter. Supernatanten fra hver blev derefter opsamlet og analyseret for cytokinkoncentrationer med en 6-plex cytokin bead-array i overensstemmelse med producentens instruktioner (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Nyrefunktion

Hele blodet blev centrifugeret ved 10.000 rpm i 10 minutter. Serumkreatinin blev derefter målt ved hjælp af en kreatinin mikroplade assay (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, MI), mens blod urea nitrogen (BUN) blev bestemt ved hjælp af en urea kolorimetrisk detektion kit (Arbor Analyser, Ann Arbor, MI). Hele nyrer blev fjernet og fikseret i 10% formalin i 24 timer før paraffin fiksering og udskæring. Efter hæmatoxylin-eosin farvning blev snit vurderet for skade ved en patolog blindet for prøve identitet (ABF). Animal vægte blev målt på tidspunktet for CLP og umiddelbart før aflivning til vurdering af potentielle vægttab på grund af dehydrering.

Leverskade

Leverskade blev bedømt ved både serum leverenzymer og histologi. Alaninaminotransferase (ALAT) blev målt på en Beckman AU480 kemi auto-analysator (Beckman Diagnostics, LaBrea, CA) efter producentens anvisninger. Desuden blev portioner af hele leveren fjernet og fikseret i 10% formalin i 24 timer før paraffinindlejring. Sektioner blev skub derefter monteret og farvet med hematoxylin-eosin til analyse af en patolog (ABF) blindet at prøve identitet.

Lunge skade

For histologisk analyse, lunger dyr blev skyllet med 1 ml 10% formalin, og snit blev derefter fjernet og fikseret i 10% formalin i 24 timer, inden den indlejret i paraffin. Lung sektioner blev derefter farvet med hæmatoxylin-eosin og undersøges af en patolog (ABF) blindet at prøve identitet.

Myeloperoxidase (MPO) aktivitet blev også vurderet i BAL væske. Trachea blev overrislet med 1 ml PBS, og væske blev derefter udtaget og centrifugeret ved 10.000 rpm i 10 minutter. Substratbuffer indeholdende 0,0005% hydrogenperoxid og O-dianisidin sattes til supernatanten, og MPO-aktivitet blev analyseret i løbet af 6 minutter ved bølgelængde 460 (BioTek Synergy HT, Winooski, VT). MPO-aktivitet blev beregnet som optisk densitet /minut pr pi BAL fluid.

Lunge koncentration fluid protein blev målt ved at analysere prøver behandlet med protein assayreagens (Thermo Scientific, Rockford, IL) ved 660 nm i forbindelse med en standardkurve af bovint serumalbumin.

Komplet blodtælling

Fuldblod indsamlet på tidspunktet for aflivning blev indsamlet i antikoagulerende-foret blod rør og blev analyseret for hæmoglobinkoncentrationen, leukocyttallet, og trombocyttal på en Heska HemaTrue

® veterinær hæmatologianalysator ifølge producentens retningslinjer (Heska, Loveland, CO).

Statistik

Alle data blev analyseret ved hjælp af den statistiske software program Prism 6.0 (GraphPad , San Diego, CA) og er præsenteret som gennemsnit ± SEM. Data blev testet for normalfordeling hjælp af D’Agostino-Pearson omnibus normalitet test. To -vejs sammenligninger på data med en Gauss fordeling blev udført ved hjælp af t-test. Tovejs sammenligninger af data, der ikke har en Gauss-fordeling blev udført ved anvendelse af Mann-Whitney-test. Multi-gruppe sammenligninger blev analyseret via envejs ANOVA efterfulgt af Tukey post-test. Overlevelse blev analyseret under anvendelse af log-rank test. En p-værdi på 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant i hele

Resultater Salg

Mus, som modtog subkutane injektioner af murine lungecancerceller udviklede godt afgrænsede ensomme tumorer på injektionsstedet tre. uger senere (gennemsnitlig størrelse 1,5 cm i diameter). Post-mortem undersøgelse af lunge histologi viste mikroskopisk metastatisk sygdom i nogle dyr, selv om ingen brutto tumor spredning blev set i nogen dyr på aflivningstidspunktet.

Tilstedeværelsen af ​​eksisterende lungekræft forværres dødelighed efter sepsis

Seven-dages dødeligheden var 18% i tidligere raske septisk mus. I modsætning hertil syvdages mortalitet var 60% i cancer septisk mus (figur 1).

tidligere raske mus og dem givet en injektion af LLC1 celler tre uger tidligere (n = 15-17 /gruppe) blev underkastet til CLP. Kræft septisk mus havde signifikant højere dødelighed end tidligere rask septisk mus (p = 0,003).

Tilstedeværelsen af ​​eksisterende lungekræft falder CD4 + lymfocytter, men ikke CD8 + lymfocytter efter sepsis

cancer septisk mus havde et fald i både hyppighed og absolutte antal milt CD4 + lymfocytter sammenlignet med tidligere rask septisk mus (fig 2A og 2B). Desuden cancer septisk mus havde en højere frekvens af annexin-positiv farvning CD4 + lymfocytter sammenlignet med tidligere raske septic mus, hvilket tyder på forøget apoptose var ansvarlig for tabet af CD4 + -celler (fig 2C og 2D). I modsætning hertil mens frekvensen af ​​milt-CD8 + -lymfocytter var højere i cancer septisk mus (Fig 3A), var dette sandsynligvis på grund af faldet i CD4 + -celler, da ingen forskel blev set i CD8 + celleantal (fig 3B) eller annexin-farvning (Fig 3C og 3D) mellem kræft septisk mus og tidligere raske septiske mus. CD4 + celle ekspression af Th1 markør CXCR3 blev forøget i cancer septisk mus (Fig 4A og 4C), medens ekspression af Th2 markør CCR4 ikke var forskellig mellem tidligere raske septic mus og cancer septisk mus (Fig 4B og 4C). Stimuleret produktion af Th1 effektor cytokin IFN-γ af CD4 + T-celler blev ikke påvirket af cancer (Fig 4D, 4F og 4G), medens produktionen af ​​Th2-effektor IL-4 var væsentlig mindre i cancer septisk mus (Fig 4E, 4F og 4G) .

Cancer septisk mus havde en signifikant lavere hyppighed af CD4 + -T-celler som en procentdel af total CD3 + T-celler (a, p = 0,02, n = 7-9) samt et fald i det samlede antal CD4 + T-celler (B, p = 0,03, n = 8-10) sammenlignet med tidligere raske septiske mus. Dette blev forbundet med en stigning i annexin-positive CD4 + -T-celler i cancer septisk mus (C, p = 0,04, n = 7-8). En repræsentativ flowcytometri histogram demonstrerer øget annexin farvning i cancer septisk (blå) CD4 + -T-celler sammenlignet med tidligere rask septisk (rød) CD4 + T-celler (D).

Cancer septisk mus havde en signifikant øget frekvens af CD8 + T-celler som en procentdel af de samlede CD3 + T-celler (a, p = 0,007, n = 8-10). Men der var ingen statistisk signifikant ændring i den totale antal CD8 + celler (B, p = 0,10, n = 8-10) eller annexin-positive CD8 + T-celler (C, p = 0,31, n = 7-10), hvilket antyder ændringen i procentdelen af ​​CD8 + -celler var relateret til faldet i CD4 + -celler. En repræsentativ flowcytometri histogram viser ingen forskel i annexin farvning i cancer septisk (blå) og tidligere rask septisk (rød) CD8 + -T-celler (D).

Cancer septisk mus havde en beskeden stigning i CD4 + T celle ekspression af Th1 markør CXCR3 (a, p = 0,01, n = 9-10), men havde ikke en statistisk signifikant ændring i ekspression af Th2 markør CCR4 (B, p = 0,21, n = 9-10). En repræsentativ flowcytometri plot for begge markører er inkluderet (C). Stimuleret produktion af IFN-γ var ikke statistisk forskellig i CD4 + T-celler fra cancer septisk mus (D, p = 0,17, n = 9-10); imidlertid stimuleret produktion af IL-4 var lavere i CD4 + T-celler fra cancer septisk mus (E, p = 0,006, n = 9-10). Repræsentative flowcytometri grunde til både ikke-stimulerede og stimuleret IFN-γ og IL-4 er vist for tidligere rask septisk mus (F) og cancer septisk mus (G).

Tilstedeværelsen af ​​allerede eksisterende lunge kræft falder evne til at rydde lokal infektion

Peritoneal bakteriel byrde blev højere i kræft septisk mus end tidligere rask septisk mus (fig 5A). Dette blev ikke forbundet med ændringer i interleukin (IL) -1β, IL-6, IL-10, IL-13, MCP-1, TNF-α eller IFN-γ i den peritoneale væske (Fig 5B-5H). Peritonealvæske indeholdt også lignende procentdele af neutrofiler (fig 6a) og dendritiske celler (Fig 6B) mellem tidligere raske septic mus og cancer septisk mus. Dendritiske celle-aktivering som bestemt ved MHC II-ekspression på celler fra peritonealvæske var også lignende mellem grupperne (fig 6C). Milt-dendritiske celle frekvens og aktivering var også upåvirket af tilstedeværelsen af ​​cancer (Fig 6D og 6E). Der var ingen forskel i absolutte antal neutrofiler eller dendritiske celler (data ikke vist).

Kræft septisk mus havde højere niveauer af bakterier i deres peritoneale hulrum end tidligere sund septisk mus (A, p = 0,005, n = 8-9). Denne ændring var ikke forbundet med forskelle i koncentrationen af ​​peritoneal IL-1β (p = 0,32), IL-6 (p = 0,18), IL-10 (p = 0,52), IL-13 (p = 0,97), MCP-1 (p = 0,67), TNF-α (p = 0,40) eller IFN-γ (p = 0,27) (BH, n = 8 for alle grupper).

Cancer septiske mus og tidligere rask septisk mus havde lignende frekvenser af neutrofiler (A, p = 0,52, n = 7 /gruppe) og dendritiske celler (B, p = 0,52, n = 7 /gruppe) i deres peritonealvæske, og der var ingen forskel i hyppigheden af dendritiske celle MHC II-ekspression mellem de to grupper (C, p = 0,52, n = 7 /gruppe). Cancer septisk mus og tidligere raske septiske mus havde også lignende frekvenser af dendritiske celler (D, p = 0,73, n = 9-10) og aktiveret dendritiske celler (E, p = 0,83, n = 9-10) i splenocytter.

Serum cytokiner var ens mellem kræft septisk mus og tidligere raske septisk mus undtagen en stigning i MCP-1 i kræft septisk mus (Fig 7). Ingen forskel i bakteriebyrden blev identificeret i kvantitative blodkulturer mellem tidligere raske septic mus og cancer septisk mus (data ikke vist).

Ingen signifikante forskelle blev bemærket i IL-1β (p = 0,10), IL-6 (p = 0,63), IL-10 (p = 0,24), IL-13 (p = 0,07), eller TNF-α (p = 0,99) (BF, n = 7-8 /gruppe). I modsætning hertil steg MCP-1 blev påvist i serum fra cancerpatienter septisk mus sammenlignet med tidligere rask septisk mus (E, p = 0,04, n = 7-8).

Tilstedeværelsen af ​​præ- eksisterende lungekræft falder krypt spredning, men ændrer ikke andre komponenter i tarm integritet efter sepsis

kræft i isolation nedsætter krypt spredning i forhold til umanipulerede mus. Sepsis isoleret mindsker også krypt proliferation sammenlignet med umanipulerede mus. Kombinationen af ​​cancer og sepsis forårsager en yderligere uforholdsmæssig fald i krypt proliferation sammenlignet med sepsis alene som kræft septisk mus har lavere proliferation end tidligere rask septisk mus (Fig 8A-8C).

tidligere raske septisk mus (A) havde kvalitativt højere spredning end kræft septisk mus (B, BrdU-positive kryptceller pletten brun). Kvantitativt, både kræft i isolation og sepsis isoleret faldet krypt proliferation (C, p = 0,02 og 0,008 sammenlignet med umanipulerede mus). Kombinationen af ​​kræft og sepsis faldt yderligere intestinal spredning, moreso end blev set med enten variabel i isolation (p 0,001 tidligere rask septisk vs. kræft septisk, n = 8-10 for alle grupper i panelet C). I modsætning hertil blev mens villus længde faldt med sepsis (men ikke kræft) isoleret (p = 0,008), var der ingen forskel i villus længde mellem tidligere rask septisk og kræft septisk mus (D, s 0,99, n = 8-9 for alle grupper).

i modsætning hertil er villus længde ikke påvirket af cancer i isolation, er reduceret som tidligere er blevet vist ved sepsis (26), men er ikke forskellig mellem tidligere raske septiske mus og cancer septisk mus (fig 8d). Kræft og sepsis heller ikke påvirke tarm gennemtrængelighed eller krypt apoptose sammenlignet med sepsis alene (data ikke vist).

Tilstedeværelsen af ​​eksisterende lungekræft forværres biokemisk nyrefunktion uden at forårsage leverskader efter sepsis

Hverken cancer eller sepsis i isolation påvirket nyrefunktion som BUN og Cr-niveauer var ens i umanipulerede, kræft og tidligere raske septiske mus. I modsætning hertil både BUN og Cr var højere i cancer septisk mus (fig 9A og 9B); dog nyrer optrådte groft normalt histologisk (data ikke vist).