PLoS ONE: interleukin 6 receptor er en uafhængig Prognostisk Factor og en potentiel terapeutisk mål for kræft i æggestokkene

Abstrakt

Kræft i æggestokkene er den mest dødelige gynækologiske kræft og nye målrettede molekylære behandlinger mod denne elendige sygdom fortsat være udfordrende. I denne undersøgelse, vi analyserede udtryksmæssige mønstre af Interleukin-6 (IL-6) og dens receptor (IL-6R) ekspression i kræft i æggestokkene væv, evaluerede virkningen af ​​disse udtryk på kliniske resultater af patienter, og fandt, at en høj niveau af IL-6R-ekspression, men ikke IL-6-ekspression i cancerceller er en uafhængig prognostisk faktor. I

in vitro

analyser ved hjælp af æggestokkene cellelinjer, mens seks (RMUG-S, RMG-1, OVISE, A2780, SKOV3ip1 og OVCAR-3) af syv overudtrykt IL-6R sammenlignet med en primær normal ovarie overflade epitel kun to (RMG-1, OVISE) af syv cellelinjer overudtrykt IL-6, hvilket antyder, at IL-6 /IL-6R-signalering udøver på en parakrin måde i visse typer af ovariecancerceller. Kræft i æggestokkene ascites blev indsamlet fra patienter, og vi fandt, at primær CD11b

+ CD14

+ celler, som var overvejende M2-polariserede makrofager, er den største kilde til IL-6-produktion i en kræft i æggestokkene mikromiljø. Når CD11b

+ CD14

+ celler blev co-dyrket med kræftceller, både invasionen og spredning af kræftceller blev håndfast fremmes, og disse kampagner var næsten helt hæmmet ved forbehandling med anti-IL-6R-antistof (tocilizumab ). Dataene præsenteret heri antyder et rationale for anti-IL-6 /IL-6R-terapi til at undertrykke det peritoneale spredning af ovariecancer, og repræsenterer tegn på det terapeutiske potentiale af anti-IL-6R terapi for ovariecancer behandling.

Henvisning: Isobe A, Sawada K, Kinose Y, Ohyagi-Hara C, Nakatsuka E, Makino H, et al. (2015) interleukin 6 receptor er en uafhængig Prognostisk Factor og en potentiel terapeutisk mål af kræft i æggestokkene. PLoS ONE 10 (2): e0118080. doi: 10,1371 /journal.pone.0118080

Academic Redaktør: Goli Samimi, Garvan Institute of Medical Research, AUSTRALIEN

Modtaget: Oktober 1, 2014 Accepteret: 5 Januar 2015; Publiceret: 6 feb 2015

Copyright: © 2015 Isobe et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning fra Undervisningsministeriet, videnskab, sport og kultur i Japan (21791555 og 23592447 til KS, 22390308 til HK og 23659779 til TK). Dette arbejde blev også delvist støttet af Osaka Medical Research Foundation for Vanskelige Sygdomme (til KS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den hyppigste dødsårsag fra gynækologiske maligniteter. Nylige overbevisende data understøtter involveringen af ​​den inflammatoriske stromal mikromiljø, forårsaget af overekspression af cytokiner eller kemokiner, at fremme æggestokkene tumorigenese, kræft progression og modstandsdygtighed over for kemoterapi. [1] Derfor målrette disse cytokiner fra stromale mikromiljø kan tilbyde en lovende terapeutisk strategi for at forbedre behandlingen af ​​patienter med kræft i æggestokkene

Blandt de cytokiner rapporteret hidtil, Interleukin-6 (IL-6) er en af ​​de afgørende immunregulerende cytokiner til stede i kræft i æggestokkene mikromiljø.; Det fremkalder flere veje, der fører til tumor spredning, angiogenese og kemoresistens. [2] Højere serum og ascites niveauer af IL-6 er blevet fundet i patienter med kræft i æggestokkene end hos patienter med andre maligne lidelser, og niveauer har vist sig at korrelere med omfanget af sygdom og dårlig klinisk resultat. [3-5] Selv Rath et al. nylig viste, at IL6-R-ekspression er stærkt udtrykt i kræft i æggestokkene væv sammenlignet med normale væv eller benigne sygdomme [6] den kliniske effekt af IL6-R-ekspression i kræft i æggestokkene arter, der ikke er blevet undersøgt. Derfor vi blev opmuntret til at undersøge de kliniske værdier af IL-6 og IL-6R i ovariecancer væv under anvendelse af væv microarrays (TMAS) Vi konstruerede og de tilsvarende kliniske data.

Det fremgår, at antagonisering IL-6 /IL-6R-signalering kan have terapeutisk aktivitet i patienter med ovariecancer gennem inhibering af en tumor-fremmende cytokin netværk. Faktisk målrettet anti-IL-6-antistof terapi har været anvendt i kliniske forsøg, og fundet at være veltolereret i patienter af flere kræftformer, herunder kræft i æggestokkene. [7] Tocilizumab (Chugai Pharmaceutical, Shizuoka, Japan), er et humaniseret anti human IL-6R-antistof og binder til IL-6-bindingssted af humant IL-6R. Det er kendt til kompetitivt at inhibere IL-6 /IL-6R-signalering og fuldstændigt neutraliserer IL-6-aktiviteter. [8, 9] En række kliniske studier har med succes vist, at suppression af IL-6 /IL-6R signalering ved tocilizumab er terapeutisk effektiv i lindre Castlemans sygdom og leddegigt. [10, 11] i betragtning af dets succes i behandling af disse sygdomme, tocilizumab kan vise sig nyttig i behandling IL-6-relaterede kræftformer, og vi blev motiveret til at belyse det terapeutiske potentiale af tocilizumab mod kræft i æggestokkene.

Selvom ikke kun ovariecancerceller men tumorassocierede makrofager er blevet rapporteret til at producere IL-6, [12, 13] det forbliver diskuteres, om forøget IL-6-niveauer hos patienter med ovariecancer er produceret af tumoren selv eller hovedsageligt af værtens væv. Størstedelen af ​​patienter med ovariecancer på fremskredne stadier stede peritoneale metastatiske sygdomme, ofte ledsaget af massive ascites. [14] Massive ascites hos patienter består af ikke kun cancerceller, men også fibroblaster, endotelceller og overvejende immunceller, som alle er afgørende for kræft vækst, progression og metastase. [15] peritoneale makrofager menes at spille en central rolle i denne sammenhæng, som det fremgår af flere undersøgelser, der makrofag udtynding i peritoneale ovariecancer modeller undertrykker kræft progression og akkumulering af ascites. [16, 17] makrofager, der infiltrere tumorvæv, som der henvises til som tumorassocierede makrofager (TAM), er velkendte bidragydere til tumorprogression og er associeret med dårlig prognose af forskellige kræftformer. [18, 19] da TAM’er vides at frigive forskellige proangiogene cytokiner og vækstfaktorer, vi hypotese, at makrofager kunne være en af ​​potentielle ansvarlige kilder beriget IL-6 ophobning i kræft i æggestokkene ascites.

på denne baggrund vi har forsøgt at analysere udtryksmæssige mønster af IL 6R samt bruge ovariecancer TMA’er og vurdere virkningen af ​​disse udtryk på de kliniske resultater af patienter. Ovariecancer ascites blev opsamlet fra patienter, som gennemgik operation, og vi fandt, at primær CD11

+ CD14

+ -celler, som var overvejende M2-polariseret TAM’er, var den største kilde til IL-6-produktion i en ovarietumor mikromiljø og håndfast forfremmet æggestokkræft invasion og spredning. De data, der præsenteres heri foreslå et rationale for anti-IL-6 /IL-6R terapi for at undertrykke peritoneal spredning af kræft i æggestokkene og fremlægge dokumentation for det terapeutiske potentiale af anti-IL-6R terapi til at helbrede denne elendige sygdom.

Materialer og metoder

etik Statement

Patient prøver blev opnået med skriftligt informeret samtykke i overensstemmelse med kravene etisk komité fra institutterne og Helsinki-erklæringen. Institutional Review Board (IRB) i Osaka University Graduate School of Medicine godkendt denne undersøgelse protokol om 2011/02/15 (nr 10064). IRB af Gifu University Graduate School of Medicine godkendt det på 2012/07/02 (nr 26-50).

Materialer

Antistoffer mod IL-6 (R-49L), IL 6R (C-20) og total STAT3 (C-20) var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Rekombinant human IL-6 blev opnået fra Chemicon (Temecula, CA) og rekombinant humant sIL-6R var fra R 25%; 1, ≥25%) og intensiteten af farvning (0, ingen; 1, svag; 2, stærk). “Høj” ekspression af IL-6 blev defineret hvis sammensætningen score på tæthed og intensitet var ≥1. “Lav” ekspression blev defineret hvis sammensætningen score på densitet og intensitet scoringer var 0. “Høj” ekspression af IL-6R blev defineret hvis sammensætningen score på tæthed og intensitet blev = 2. “Low” ekspression blev defineret hvis sammensætningen score af tæthed og intensitet scoringer var ≤1.

Real Time Reverse Transcription (RT) -PCR analyse

Totalt RNA blev isoleret med Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA). Et ug totalt RNA blev revers-transkriberet med ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Japan). Til kvantitativ mRNA-ekspression analyse blev TaqMan RT-PCR udført på StepOnePlus ™ Real-Time PCR-system i overensstemmelse med producentens anvisninger. TaqMan Probe-baserede genekspression Assays blev anvendt til IL-6; Hs 00174131_m1 og IL-6R; Hs 01075667_m1 (Applied Biosystems). GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. Relative niveauer af mRNA-genekspression blev beregnet under anvendelse af 2

-.

ΔΔCT

fremgangsmåde som tidligere beskrevet [21]

RT-PCR-analyse

cDNA blev syntetiseret fra 1 pg RNA ved hjælp af en ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Osaka, Japan) med tilfældige primere. For IL-6R-ekspression, blev primerne designet til at anneale til regionen splejsning ud fra IL-6R for at detektere ikke kun en membranbundne form (IL-6R), men også en opløselig form (sIL-6R). Primersekvenserne og de forventede PCR-produkter var som følger; sense IL-6R, 5′-TCCACCCCCATGCAGGCACT-3 ‘(baserne 1419 til 1438) og anti-sense-IL-6R; 5’-GTGCCACCCAGCCAGCTATC-3 ‘(baserne 1840 til 1859), størrelse; IL-6R, 441 bp, sIL-6R, 341 bp. β-actin-sense: 5’-CGTGACATTAAGGAGCTGTG-3 ‘, β-actin-antisense: 5′-GCTCAGGAGGAGCAATGATCTTGA-3’, størrelse 376 bp. Sekvenserne af cDNA blev henvist til GenBank (accessionsnr. X12830 for IL-6R og sIL-6R og NM_001101 for β-actin). CDNA templates blev PCR- amplificeret med Taq PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA) indeholdende 1 mM af hver af dATP, dCTP, dGTP og dTTP og 2,5 U Taq DNA-polymerase, og hver specifik primer ved 0,2 uM under følgende betingelser : 35 cykler ved 94 ° C i 45 sekunder, 60 ° C i 45s og 72 ° C i 60 sek. Produkterne blev elektroforesebehandlet på 2% agarosegeler og visualiseret ved ethidiumbromidfarvning og ultraviolet belysning.

Western blot-analyse

I alt 4 × 10

5-celler blev udpladet på 6- brønd plader og lyseret med 1 × Cell Lysis Buffer (Cell Signaling). Lysater (30 ug) blev separeret ved 5-20% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membraner efterfulgt af inkubering med de primære antistoffer (p-STAT3, 1: 1000 i 5% bovint serumalbumin (BSA), STAT3, 1 : 1000 i 5% BSA; p-ERK, 1: 2000 i 5% BSA, ERK, 1: 2000 i 5% BSA; p-actin, 1: 10000 i 5% BSA) og derefter med en tilsvarende sekundære peberrodsperoxidasekonjugeret IgG. Proteinerne blev visualiseret med vestlige Lightning Plus ECL (PerkinElmer Life Science, Waltham, MA).

celleproliferationsassay

SKOV3ip1 eller RMG1 celler blev udsået i 24-brønds plader (1 x 10

4 celler /brønd) i 10% FBS /DMEM i 24 timer og derefter inkuberet i 0,1% BSA /DMEM i nærvær eller fravær af IL-6 med eller uden anti-IL-6R-antistof i 72 timer. Celleproliferation blev vurderet ved en modificeret MTS-assay under anvendelse af en celle Titer 96AQ kit (Promega, Madison, WI) i overensstemmelse med producentens anvisninger. I co-kultur eksperimenter, polycarbonatfiltre med 1 um porer (celler kan ikke passere gennem filtrene) blev anbragt på plader med 24 brønde og lige mange af primære celler blev podet som en stimulans. Celleproliferation blev udtrykt som forholdet mellem antallet af levedygtige celler.

Matrigel invasion assay

Kort fortalt blev polycarbonatfiltre med 8 um porer overtrukket med 25 ug matrigel (BD Biosciences). SKOV3ip1 eller RMG1 celler (1 x 10

5 celler /brønd) blev podet på de øvre kamre i 0,1% BSA /DMEM og inkuberet i det samme medium indeholdende IL-6 som en kemoattraktant i bundkammeret i 72 h.Thereafter , filtre blev fikseret og farvet med Carazzi s hematoxylinopløsning. Noninvading celler blev fjernet med en vatpind, og invaderende celler på undersiden af ​​filteret blev talt under anvendelse af et omvendt mikroskop. Fem orbital mikroskopiske felter fra hvert filter blev tilfældigt udvalgt. I co-kultur eksperimenter blev lige antal primære celler podet i bundkammeret som kemoattraktant.

Enzymbundet immunosorbant assay (ELISA)

I den kvantitative assay af human VEGF-A, SKOV3ip1 celler (1 x 10

5 celler) blev dyrket under serum-frit medium i nærvær eller fravær af IL-6 i 72 timer. Anti-IL-6R-antistof (10 ug /ml) eller en tilsvarende mængde kontrol IgG blev samtidig anvendt. Derefter blev konditionerede dyrkningsmedier opsamlet og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Human VEGF-A Platinum ELISA-kit (eBiosecience, SanDiego, CA) blev anvendt til at bestemme koncentrationen af ​​VEGF-A, i overensstemmelse med producentens protokol, med en følsomhed på 7,9 pg /ml. Til den kvantitative assay af human IL-6 eller humant sIL-6R, 1 x 10

5 i SKOV3ip1 celler og primære celler blev dyrket under serum-frit medium i 72 timer, og disse koncentrationer i dyrkningsmediet blev målt ved anvendelse af humant IL- 6 ELISA Ready-SET-GO med en følsomhed på 2 pg /mL eller human sIL-6R Øjeblikkelig ELISA (eBioscience) med en følsomhed på 10 pg /mL.

Isolering af primære celler fra kræft i æggestokkene ascites

Patientprøver blev opnået med skriftligt informeret samtykke i overensstemmelse med Osaka University Hospital krav etiske udvalg og Helsinki-erklæringen. Ascites blev opsamlet aseptisk, og cellerne blev isoleret ved standard Ficoll-Paque density-gradient (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige). Derefter blev CD11-positive (CD11

+) celler samt CD14-positive (CD14

+) celler renset ved positiv selektion under anvendelse af magnetiske cellesortering (MACS) teknologi (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland). Endelig CD11b

– celler, CD11b

+ CD14

– celler og CD11b

+ CD14

+ celler blev indsamlet. Celler blev dyrket i 20% FBS RPMI 1640-medium og anvendt til eksperimenter ved passager 2 til 3. Salg

Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) -analyse

I celleoverfladefarvning, encellede suspensioner blev inkuberet med phycoerythrin (PE) -konjugeret anti-CD11b monoklonalt antistof (ICRF44) (BD Biosciences), allophycocyanin (APC) -konjugeret anti-CD14 monoklonalt antistof (M5E2) (BD Biosciences), Alexa Fluor-488 konjugeret anti-CD68 monoklonalt antistof (y1 /82A) (Miltenyi Biotec) og eFluor-450 konjugeret anti-CD206-antistof (19,2) (eBioscience, San Die gå, CA) i 30 minutter ved 4 ° C. Efter vask blev cellerne resuspenderet i 500 pi af 1% BSA /PBS. De farvede celler blev kørt på en FACSCanto II flowcytometer (BD Biosciences). Data blev analyseret ved hjælp af FlowJo software program (TreeStar, Ashland, OR).

Statistisk analyse

Statcel version 3 (OMS-Publishing Inc., Saitama, Japan) og JMP-version 10.0.2 (SAS Institute Japan Ltd., Tokyo, Japan) blev anvendt til statistiske analyser. Forskelle blev analyseret ved anvendelse af Mann-Whitney U test. Overlevelsesestimaterne blev beregnet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden, og sammenligninger mellem grupper blev analyseret under anvendelse af log-rank test. Multivariable analyse blev udført ved hjælp af en Cox proportionel-farer regressionsmodel. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant på tosidede

P

0,05 niveau.

Resultater

Høj udtryk af IL-6-receptor er en uafhængig prognostisk markør for æggestokkene kræftpatienter

For at vurdere det terapeutiske potentiale af IL-6R, vi etableret TMA lysbilleder fra 94 japanske æggestokkene kræftpatient. Karakteristikaene for patienter er opsummeret i tabel 1. IL-6R-ekspression blev vurderet ved immunohistokemi og hver prøve blev scoret baseret på procentdelen af ​​positive celler og intensiteten af ​​farvningen. Typisk blev klar membranøs farvning ses i forbindelse med positiv IL-6R-ekspression (fig. 1A). Af 94 patienter, 32 (34,0%) viste “høj” IL-6R udtryk, herunder 14 i 34 serøs (41,1%), 3 af 16 mucinøs (18,8%), 1 af 11 endometrioide (9,1%), 10 ud af 20 klar celle (50,0%) og 4 af 13 andre (30,8%) ovariecarcinomer. I modsætning hertil 62 (66,0%) patienter udtrykte “lav” eller negativ IL-6R-ekspression. Blandt patienter med kræft i æggestokkene, dem, der havde “høj” IL-6R udtryk viste signifikant dårligere PFS end dem, der havde “lav” eller negativ IL-6R udtryk (PFS, 23,8 vs. 32,3 måneder,

P

= 0,0029, fig. 1B). Tilsvarende blev IL-6-ekspression vurderet ved immunohistokemi og hver prøve blev scoret. Cytoplasmisk farvning blev set i de tilfælde af positive IL-6-ekspression (fig. 1C). Af 94 patienter, 39 (41,4%) viste “høj” IL-6-ekspression, herunder 13 i 34 serøs (38,2%), 8, 16 mucinøs (50,0%), 5 i 11 endometrioide (45,5%), 11 ud af 20 klar celle (55,0%) og 2 af 13 andre (15,4%) ovariecarcinomer. I modsætning hertil 55 (58,5%) tilfælde udtrykte “lav” eller negativ IL-6-ekspression. Selvom den prognostiske værdi af IL-6 blev undersøgt ved Kaplan-Meier-metoden og sammenligninger udføres ved hjælp af log-rank test, IL-6-ekspression ikke påvist nogen væsentlige korrelationer med prognoser for patienter (Fig. 1d). For en multivariat analyse blev udført for at vælge en model for overlevelse med flere prædiktorer. Age, blev FIGO stadie, histologisk type, residual tumor på tidspunktet for kirurgi, “høj” IL-6 udtryk og “høj” IL-6R udtryk indtastes i denne model. Den endelige model inkluderet “høj” IL-6R udtryk, men ikke IL-6-ekspression er en betydelig uafhængig prædiktor for reduceret PFS i æggestokkene kræftpatienter (

P

= 0,017,

HR

; 2,388 ( 1,171-4,895), tabel 2) sammen med klinisk udvikling og operationer.

(A) immunhistokemisk farvning af væv microarrays med maligne æggestokkene vævssnit. Repræsentative områder af fire forskellige ovariecancere farvet ved anvendelse af et anti-humant IL-6R-antistof og bedømt som “Lav” eller “Høj”. Efterbyrd kompliceret med chorioamnionitis blev anvendt som en positiv kontrol. Pile viser membranøs farvning i trophoblaster. En negativ kontrol er ikke-immun sera. (B) IL-6-receptor-ekspression korrelerer med dårlig prognose for patienter med ovariecancer. Kaplan-Meier kurver for progressionsfri overlevelse (

venstre

) og samlet overlevelse (

højre

) af patienter med ovariecancer behandlet på Gifu Universitetshospital (n = 94). (C) Repræsentative områder af fire forskellige ovariecancere farvet ved anvendelse af et anti-humant IL-6-antistof og bedømt som “Lav” eller “Høj”. Efterbyrd kompliceret med chorioamnionitis blev anvendt som en positiv kontrol. Pile viser cytoplasmatisk farvning i villøse mesenchymale celler. En negativ kontrol er ikke-immun sera. (D) IL-6-ekspression påvirkede ikke prognosen for patienter med kræft i æggestokkene. Kaplan-Meier kurver for progressionsfri overlevelse (

venstre

) og samlet overlevelse (

højre

) af patienterne. Original forstørrelse, × 200. Scale bar i hvert panel repræsenterer 50 um. Vejviser

IL-6-receptor, men ikke IL-6 er stærkt udtrykt i æggestokkene kræftceller

Siden “høj “ekspression af IL-6R, men ikke IL-6 påvirket prognosen hos patienter med ovariecancer, vi kvantificeret udtrykkene for IL-6 og IL-6R i æggestokkene cancer cellelinjer ved real-time RT-PCR. Ekspressionsniveauet af primære OSE-celler blev sat til 1,0. Mens kun to (RMG-1 og OVISE) af syv cellelinier udtrykte høje niveauer af IL-6 sammenlignet med OSE celler (Fig. 2A), seks (RMUG-S, RMG-1, OVISE, A2780, SKOV3ip1 og OVCAR-3 ) af syv cellelinjer udviste markant høj ekspression af IL-6R (11,0-270,1 gange) (fig. 2B). Lignende tendenser blev bekræftet ved Western blot (fig. 2C). Den membranbundne form af IL6R ekspression er stort set begrænset til hepatocytter, immunceller og nogle tumorceller. [6] Derfor er det opløselige isoform (sIL-6R) anses for at spille en vigtig rolle i inflammatoriske sammenhænge ved at tillade en øget respons på IL -6 i alle celletyper. For at afgøre, om æggestokkene cancercellelinier overvejende udtrykke fuld-længde (IL-6R) eller differentielt splejset isoform, der mangler transmembrandomænet (sIL-6R), vi designede primere, kode splejsning læsioner og udført RT-PCR (Fig . 2D). I alle cellelinjer undtagen OSE, fandt vi, at både IL-6R og sIL-6R blev udtrykt. Ekspressionen af ​​sIL-6R blev yderligere bekræftet ved kvantitativ ELISA. Alle ovariecancer testede cellelinjer frembragte en vis mængde sIL-6R (6,3-94,0 pg /10

5-celler, fig. 2E). Således behandlingen med IL-6 (100 ng /ml) alene drastisk inducerede phosphorylering af STAT3, et centralt nedstrøms molekyle i IL-6 /IL-6R-signalvejen, såvel som den for ERK i SKOV3ip1 celler (Fig. 2F), og tilføjelsen af ​​eksogene sIL-6R var ikke nødvendig for disse phosphoryleringer. Forbehandlingen af ​​anti-IL-6R-antistof inhiberede disse reaktioner i en dosis-afhængig måde, hvilket indikerer, at IL-6R i høj grad udtrykkes i visse typer af ovariecancerceller og at IL-6 /IL-6R-signalering udøver på en parakrin måde disse celler, selv om cellerne ikke producerer IL-6.

Real-time RT-PCR af IL-6 (A) og IL-6R (B). Total RNA blev opsamlet fra syv forskellige ovariekræft cellelinjer under anvendelse af TRIzol og underkastet real-time RT-PCR. De 2

-ΔΔCT metode blev anvendt til at beregne den relative forekomst i forhold til GAPDH-ekspression. Relative fold forskelle med hensyn til primær æggestokkene overflade epitel (OSE) præsenteres. (C) Western Blot. Cellelysater fra syv ovariecancerceller blev opløst ved SDS-PAGE og immunblottet med et antistof mod IL-6 og IL-6R. p-actin blev anvendt som en loading kontrol. (D) RT-PCR. RNA blev opsamlet og udtrykkene for fuld-længde IL-6R (IL-6R) og opløselig IL-6R (sIL-6R) ekspression i æggestokkene cancercellelinier blev undersøgt. PCR-betingelser var som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. (E) ELISA-assay af sIL-6R. Syv ovariecancerceller (1 x 10

5 hver) blev udpladet på plader med 24 brønde og dyrket med 1 ml serum-frit medium i 72 timer. Konditionerede medier blev opsamlet, og koncentrationen af ​​humant sIL-6R blev målt ved ELISA. Forsøg blev gentaget tre gange. n.d .; ikke fundet. (F) Western Blot. Eksogen behandling af IL-6 aktiverer IL-6 /IL-6R signalering i æggestokkene cancercellelinier. SKOV3ip1 celler blev stimuleret med IL-6 (100 ng /ml) i 30 minutter med eller uden forbehandling under anvendelse RAnti-IL-6R-antistof (1-100 pg /ml) ikke-immunt IgG som kontrol. Cellelysater blev opsamlet og lige så stor mængde cellelysater (30 ug) blev opløst ved 10% SDS-PAGE og immunblottet med anti-phosphoryleret STAT3 (p-STAT3) antistof og anti-phosphoryleret p44 /42 MAPK (p-ERK1 /2) antistof. Membranerne blev strippet og rehybridiseret med antistoffer detekterer de samlede former af proteinet. Blots er repræsentative for tre forsøg.

Eksogen behandling af IL-6 inducerer proliferation, invasion og VEGF-produktion af ovariecancerceller

Da IL-6 /IL-6R-signalering er kendt at handle på en række måder at forøge udviklingen af ​​kræft, undersøgte vi, om det exogene behandling af IL-6 forbedrer proliferation, invasion og VEGF-relateret angiogenese i ovariecancerceller. Til dette formål har SKOV3ip1 Celler, som ikke udtrykker påviselige protein niveauer af IL-6 og RMG-1-celler, der udtrykker et vist niveau af IL-6 blev anvendt. Begge cellelinier har høje niveauer af IL-6R ekspression som bekræftet i fig. 2A. Eksogen behandling af IL-6 robust induceret celleinvasion af ovariecancerceller på en dosisafhængig måde (IL-6 100 ng /ml; SKOV3ip1, 4,27 ± 0,53 gange, RMG-1, 2,99 ± 0,46 gange), hvorimod induktionen var næsten helt inhiberet af den forudgående behandling med anti-IL-6R-antistof (fig. 3A). Tilsætningen af ​​exogent sIL-6R ikke yderligere at fremme invasion af ovariecancerceller induceret af IL-6, hvilket antyder, at IL-6RS (IL-6R og sIL-6R) fremstillet af cancerceller er nok til at aktivere IL-6 /IL -6R signalering. Eksogen behandling af IL-6 også signifikant forbedret spredning af begge ovariecancerceller på en dosisafhængig måde (IL-6 100 ng /ml; SKOV3ip1, 1,60 ± 0,29 gange, RMG-1, 1,64 ± 0,39 gange) og forbehandling af anti -IL-6R antistof næsten afskaffet disse forbedringer (fig. 3B). Dernæst undersøgte vi VEGF produktion fra SKOV3ip1 celler. Eksogen behandling af IL-6 (100 ng /ml, 72 timer) signifikant stimuleret VEGF produktion fra kræftceller (kontrol; 239,4 ± 16,3 pg /1x 10

5 celler, IL-6, 322,4 ± 11,8 pg /1×10

5-celler) og forbehandlingen af ​​cancerceller med anti-IL-6R-antistof signifikant inhiberede VEGF-produktion (fig. 3C). Kollektivt, blev eksogent behandling med IL-6-induceret proliferation, invasion og VEGF-produktion af ovariecancerceller, selv om de ikke udtrykker IL-6, og co-behandling med opløseligt IL-6R ikke påkrævet. Disse data tydede på, at i visse typer af ovariecancerceller, kan IL-6 /IL-6R-signalering forøge cancer progression i en parakrin måde.

(A) En matrigel invasion assay blev udført under anvendelse af en modificeret Boyden kammer-system . 1 x 10

5 i SKOV3ip1 (

venstre

) eller RMU’er-S (

højre

) celler blev anbragt på den øverste kammer i serum-frit medium og fik lov til at invadere i 72 timer . Forskellige koncentrationer af IL-6 (1-100 ng /ml) eller 60 ng /ml sIL-6R blev anvendt i det nederste kammer som en kemoattraktant. 10 ug /ml anti-IL-6R-antistof eller ikke-immunt IgG blev co-behandlet. Ikke-invaderende celler blev fjernet med en vatpind, og invaderende celler på undersiden af ​​filteret blev talt. Relative antal af invaderende celler i forhold til kontrol (ingen IL-6 behandling) er vist. (B)

In vitro

celleproliferationsassay. 1 x 10

4 celler af SKOV3ip1 (

venstre

) eller RMG1 (

højre

) celler blev udpladet i plader med 24 brønde i 10% FBS /DMEM i 24 timer og derefter inkuberet i serumfrit medium i nærvær eller fravær af forskellige koncentrationer af IL-6 (1-100 ng /ml) med eller uden anti-IL-6R-antistof eller ikke-immunt IgG som kontrol i 72 timer. Celleproliferation blev vurderet ved en modificeret MTS assay. Celleproliferation blev udtrykt som forholdet mellem antallet af levedygtige celler. (C) ELISA-assay af VEGF-A. 1 x 10

5 SKOV3ip1 celler blev udpladet på plader med 6 brønde og dyrket med 2 ml serumfrit medium i nærvær eller fravær af 100 ng /ml IL-6 i 72 timer. Anti-IL-6R-antistof eller kontrol IgG blev co-behandlet. Konditionerede medier blev opsamlet, og koncentrationen af ​​human VEGF-A blev målt ved ELISA. Forsøg blev gentaget tre gange, og værdier er middelværdier ± SD af tredobbelte. n.s .; ikke signifikant, *; P 0,05, **; P 0.01.

CD11

+ CD14

+ celler forbedrede invasion og spredning af kræft i æggestokkene celler gennem IL-6 produktion

Da IL-6 /IL-6R signalering