PLoS ONE: Rac1 Målretning blænder Menneskelig Ikke-småcellet Adenocarcinom Cancer Stem Cell Activity

Abstrakt

cancer stamceller (CSC) teori forudsiger, at en lille brøkdel af kræftceller besidder unikke selvfornyelse aktivitet og mægle tumor initiering og udbredelse. Men de molekylære mekanismer, der er involveret i CSC regulering fortsat uklart, der rammer effektiv målretning af CSCS i kræftbehandling. Her har vi undersøgt den hypotese, at Rac1, en Rho GTPase impliceret i cancer celleproliferation og invasion, er kritisk for tumor initiering og metastase af human ikke-småcellet adenocarcinom (NSCLA). Rac1 knockdown af shRNA undertrykt de tumorigene aktiviteter humane NSCLA cellelinjer og primære patient NSCLA prøver, herunder virkninger på invasion, spredning, forankringsuafhængig vækst, sfære dannelse og lunge kolonisering. Isoleret side befolkning (SP) celler, der repræsenterer formodede CSCS fra humane NSCLA celler indeholdt forhøjede niveauer af Rac1-GTP, forbedret

in vitro

migration, invasion, øget

in vivo

tumor initiering og lunge koloniserende aktiviteter i xenotransplanterede mus. Imidlertid blev CSC aktivitet også påvises i den ikke-SP befolkning, hvilket antyder vigtigheden af ​​terapeutiske målretning af alle celler i en tumor. Yderligere, farmakologisk eller shRNA målretning af Rac1 inhiberede de tumorigene aktiviteterne i begge SP og ikke-SP NSCLA celler. Disse undersøgelser viser, at Rac1 er et nyttigt mål i NSCLA, og dets blokade kan have terapeutisk værdi i at undertrykke CSC spredning og metastaser

Henvisning:. Akunuru S, Palumbo J, Zhai QJ, Zheng Y (2011) Rac1 Targeting undertrykker Humant Ikke-småcellet Adenocarcinom Cancer Stem Cell aktivitet. PLoS ONE 6 (2): e16951. doi: 10,1371 /journal.pone.0016951

Redaktør: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasilien

Modtaget: August 13, 2010; Accepteret: 18 januar 2011; Publiceret: 9 feb 2011

Copyright: © 2011 Akunuru et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af NIH R01 CA141341 og T32 HL091805. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft stadig den førende årsag til cancerdødsfald verdensplan. Sygdommen er groft inddeles i to histo-patologiske grupper – småcellet lungecancer (SCLC) og ikke-småcellet lungecancer (NSCLC), med senere gruppe repræsenterer -80% af lungekræfttilfælde. Adenokarcinomer forekommer hos ca. 55% af NSCLC og 40% af alle lungekræft. Trods fortsatte udvikling af kræftmedicin, i øjeblikket den overordnede fem år overlevelsesraten for patienter med lungecancer er mindre end 15% [1]. Ofte eksisterende kemoterapi, strålebehandling eller kirurgi kan kun delvis fjerne tumorbelastning, efterlader terapi resistente kræftceller, kan regenererer tumoren ved det primære sted og /eller metastaserer til sekundære steder at igangsætte nye tumorer.

de seneste udgivelser har rapporteret identifikation af kræft indlede eller cancer stamceller (CSCS) fra blod [2], hjerne [3], bryst [4], kolon [5], [6], hepatisk [7], pancreas [8] , næsegrus [9], [10], samt lungekræft [11], [12], [13]. De CSCS identificeres enten ved unikke celleegenskaber såsom Hoechst farveeksklusion (Hoechst dye-lave side population) eller ved ekspression af specifikke overflademarkører, såsom CD133, ALDH, eller CD24 /CD44, og de er ofte forbundet med kemoterapi og stråleterapi modstand. CSCS defineres ved deres stamceller ligesom selvfornyelse kapaciteter, deres evne til at differentiere til celletyper, der udgør hovedparten af ​​tumoren, og til at initiere tumorer med en væsentligt reduceret dosis i mus xenografundersøgelser [7], [14]. NSCLC initierende celler er blevet isoleret fra humane lunge cancer cellelinjer baseret på øget Hoechst 33342 farvestof efflux aktivitet [12]. Den Hoechst farvestof lave side befolkning (SP) celler er beriget til tumor igangsætte aktivitet sammenlignet med ikke-side befolkning (NSP) celler og udtrykker forhøjede ABCG2 og andre multiresistens transportører, der kan mægle terapeutisk modstand.

avancement af kræft stamceller teori har ført til forslaget om, at målrette CSCs kan føre til udryddelse af de resterende terapi resistente tumorceller i patienter. Senest Gupta

et al

foreslog, at inducere differentiering af CSC ved hjælp salinomycin, kan en selektiv kalium ionofor blokere mamma CSC aktivitet og metastase [15]. Imidlertid har flere nylige rapporter vist, at CSCS og ikke-CSCS kan være af plast og inter-konvertible karakter [16] – [17]. For eksempel blev JARID1 negative celler vist at repræsentere en forbigående langsom cykling ikke-CSC befolkning, der kan give anledning til hurtig cykling JARID1 positive CSCS i melanom (13). Der er beviser for, at ikke-CSCS kan konvertere til CSCS gennem interaktion med ekstracellulære matrix og andre miljømæssige signaler (14). Dette rejser muligheden for, at nærmer udelukkende rettet mod CSCS ikke er tilstrækkelige til kræftbehandling, fordi de resterende ikke-CSCS kan omprogrammeres til CSCS at reinitiere tumorigenese.

Rac1 er en intracellulær molekylær switch, der transducerer signaler i en række forskellige oncogene pathways. Det er ofte fundet at være forhøjet i ekspression og /eller aktivitet i en række tumorceller og regulere vigtige cellulære processer for cancercellelinjer adfærd, herunder genekspression, celleproliferation, aktincytoskelettet remodeling og er afgørende for celle retningsbestemt migration og adhæsion. Rac1 aktivitet kan påvirke cellecyklusprogression og overlevelse, og det viste sig at være nødvendig i K-ras-medieret lunge tumorvækst i en murin spontan lungekræft model [18]. Men om Rac1 bidrager til human vækst NSCLA tumor og /eller metastase, især hvis Rac1 spiller en rolle i reguleringen CSCS, kræver yderligere undersøgelse. I det nuværende arbejde viser vi, at Rac1 er kritisk involveret i NSCLA celle migration, invasion og lunge metastase af SP celler, derfor tjener som en nyttig terapeutisk target ved at hæmme tumor initiering og metastase af CSC befolkning NSCLA.

Materialer og metoder

Cell kultur

A549, H23, H1299 og H441 celler blev dyrket i overensstemmelse med retningslinjerne fra ATCC. Humane bronchieepithelceller (HBEC) var generøse gave fra Dr. Jeffery Whitsett (Cincinnati Børnehospital Medical Center). Primære patient lunge adenocarcinom prøver blev opnået med skriftlig tilladelse fra patienter under en godkendt institution Review Board protokol ved University of Cincinnati Videnskabelige Komité anmeldelse (IRB # 01-09-27-07), og blev anvendt i forsøgene i henhold til Cincinnati Børnehospital Medical center Videnskabelige Komité anmeldelse (IRB # 07-06-57), at identiteten af ​​patienterne forbliver anonym. Tumorer blev hakket og resuspenderet i DMEM indeholdende 0,5 mg /ml Liberase (Roche) og 1% penicillin og streptomycin. Efter 45 minutters inkubering blev opslæmning af celler passeret gennem 100 mikrometer filter og totale celler blev vasket, udpladet i 10% kalvefosterserum indeholdende vækstmedium. Epitelcancerceller blev beriget ved at dyrke celler i sfære dyrkningsbetingelser.

A549, H23, H1299, H441, HBEC eller primær adenocarcinomceller blev inficeret med lentivirus udtrykker YFP tagged krypteret shRNA (SCR) eller Rac1 shRNA1 eller Rac1 shRNA2 tidligere beskrevet [19]. Scrambled shRNA konstruktion var generøse gave fra Dr. Lee Grimes (Cincinnati Børnehospital Medical Center) og Rac1 shRNA konstruktioner var generøse gave fra Dr. Jim Mulloy (Cincinnati Børnehospital Medical Center). Efter 72 timers infektion blev YFP positive celler sorteret under anvendelse af FACS og anvendt til forskellige eksperimenter.

I Rac1 mutante redningsforsøg blev fire mismatch punktmutationer fremsat i shRNA bindingssteder af Rac1 cDNA i MIEG3 vektoren under anvendelse site-directed mutagenese (Stratagene, Agilent Technologies) ifølge producentens anvisninger. A549-celler blev inficeret med Rac1 mutant udtrykkende retrovirus og efter 72 timer blev GFP-positive celler sorteret under anvendelse af FACS. Cellerne blev efterfølgende inficeret med lentivirus udtrykker scr shRNA eller Rac1 shRNA. Efter 72 timer GFP

+ YFP

+ celler blev anvendt til at udføre flere funktionelle assays.

celleproliferation assays

Celler blev udpladet (2000 celler /brønd) på 96 brønd plade i triplikater. Antal levende celler på hver dag blev bestemt ved ikke-radioaktivt MTS proliferation assay (Promega).

I BrdU-inkorporering assay, BrdU (10 ug /ml) blev tilsat til celler ved 60% konfluens i 2 timer ved 37 ° C. Celler blev opsamlet, fikseret, farvet og FACS-analyse blev udført som tidligere [20] beskrevne. For at detektere BrdU positive celler i CD133

+ og CD133

– populationer, cellerne blev farvet med CD133 /2-APC-antistof (Miltenyi Biotechnologies Inc.) efter BrdU farvning. BrdU positive celler blev gated fra både CD133

+ og CD133

-. Celler

blød agar-kolonidannelse assayet

Celler blev podet (10.000 celler /brønd) i 0,3% agarose med lavt smeltepunkt fremstillet i vækstmedier indeholdende 10% føtalt bovint serum og lagt oven på 0,6% agarose i vækstmedier. Antal kolonier dannet efter enten 2 uger (A549, H1299) eller 3 uger (H441, H23) blev talt under lysmikroskop.

Sphere dannelse assay

Celler (10.000 celler /ml) var udpladet i suspension dyrkningsbetingelser i serumfrit sfære medier (DMEM: F12 indeholdende 0,4% BSA, 10 ug /ml insulin, 10 ng /ml EGF, 10 ng /ml FGF) på plader med 6 brønde præ-coatet med 1% agarose at forhindre cellevedhæftning. Medier blev udskiftet hver 2-3 dage, og antallet af kugler dannet i 2 uger blev talt under lysmikroskop.

Vedhæftning assay

Plader blev belagt med 50 ug /ml fibronectin natten over ved 4 ° C og blokeret med 2% BSA i 2 timer ved 37 ° C. Efter blokering blev celler udpladet (10.000 celler /brønd) og inkuberet ved 37 ° C i 60 minutter. Ikke-adhærente celler blev aspireret, og pladerne blev vasket tre gange med PBS. Antallet af celler, der er knyttet til brøndene efter vaskene blev bestemt ved hjælp af ikke-radioaktivt spredning MTS analysen.

Migration og invasion analyser

For trans-brønd migration assay, 50.000 celler blev føjet til øverste kammer i serumfrit medie og migration ved 37 ° C i retning 10% FBS indeholdende vækstmedium blev bestemt enten efter 24 timer (A549, H1299, H23) eller 48 timer (H441). Celler migrerede gennem membranen blev fikseret, farvet med Giemsa farve (Sigma) og talt under lysmikroskop.

I invasion assay blev nedre kamre Matrigel coated invasion plader overtrukket med 10 pg /ml fibronectin natten over ved 4 ° C og celler invaderer gennem matrigel blev fikseret og farvet enten efter 48 timer (A549-celler) eller 72 timer (H441 celler) ligner migration assay.

immunofarvning

celler blev udpladet på fibronectin coatede objektglas og efter 18-20 timer blev cellerne fikseret ved hjælp 3,7% formaldehyd. Celler blev farvet for actin cytoskeleton (Rhodamin-Phalloidin, Invitrogen), kerner (DAPI, Invitrogen) ved anvendelse af standard immunfarvning metoder, der tidligere [21] beskrevne. Alternativt celler blev farvet med enten phospho-FAK (fokal adhæsionkinase, Millipore) eller vinculin (Sigma) eller phospho-paxillin (cellesignalering Technologies).

Side-befolkning, CD133 cellefarvning og isolation

Celler trypsiniseres og vasket med PBS. Celler farves med Hoechst 33342-farvning buffer som tidligere beskrevet ved en endelig koncentration på 5 ug /ml Hoechst 33342 [22] for side befolkning (SP), eller med anti-CD133-antistof til CD133-positive celler. Cellerne blev analyseret eller sorteret for SP /CD133

+ celler ved flowcytometri.

For at opnå Rac1 knockdown i SP eller CD133

+ celler blev celler inficeret med lentivirus udtrykker YFP tagged scr eller Rac1 shRNA og efter 72 timer celler blev farvet for side population eller CD133. YFP positiv SP eller ikke-SP-celler blev sorteret for enten vestlige analyse eller funktionelle assays.

Rac1-GTP pull-down assay

For at udføre Rac1 trække ned analyser, cellerne blev lyseret ved tilsætning af lysis puffer indeholdende 20 mM Tris-HCI pH 7,6, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl, 1% Triton X-100, 0,2% SDS, protease og phosphataseinhibitorer direkte til adhærente celler. Cellelysater indeholder lige store mængder af protein blev inkuberet med glutathion perler konjugeret til GST-PAK1 indeholder aktiv Rac1 interagerende domæne og behandles yderligere som beskrevet tidligere [23].

Lunge kolonisering assay

Brug af mus som xenograft værter blev godkendt af IACUC udvalget på Cincinnati Children ‘s Hospital Medical center (protokol # 8D06052). Bestemt antal celler blev suspenderet i PBS og injiceret intravenøst ​​i immunkompromitteret NOD /SCID /yc – /- (NSG) mus ved injektion i halevenen. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen blev lunger fikseret i Bouins opløsning til at tælle antallet af tumorer

Subkutan xenograft assay

angivne antal celler suspenderes i 200 pi PBS:. Matrigel mix (1 :1 volumen) og injiceret subkutant i flankerne af immunkompromitteret NOD /SCID /γ – /- (NSG) mus. Efter 3-4 uger efter injektion tumorstørrelse blev målt ugentligt under anvendelse skydelærer og tumorvolumenet blev bestemt ved hjælp af formel 0.52XLXW

2 cm3. Salg

Tumorcelleresistens homing assay

Celler der udtrykker YFP blev injiceret intravenøst ​​i NSG mus. Efter 24 timer blev lungerne isoleret efter perfusion med PBS. Total lungeceller blev isoleret ved Liberase fordøjelse og samlede celleantal blev bestemt ved Hemavet celletæller. Procentdel af YFP-positive celler blev bestemt ved flow-cytometrisk analyse af totale lungeceller. Homing indeks blev bestemt ved at beregne procentdelen YFP positive celler homed til lunge normaliseret til kontrol celler.

Resultater

Rac1 målrette svækker spredning og kolonidannelse af humane NSCLA celler

For at undersøge rolle Rac1 GTPase i NSCLA cellevækst, A549, H441, H1299, og H23-celler blev inficeret med lentivirus kodende scr eller Rac1 shRNA (shRNA1, 2). Western blot-analyse afslørede effektiv knockdown af Rac1 protein med både shRNA konstruktioner (50% og 90% sammenlignet med SCR) i A549-celler (fig. 1A). Rac1shRNA1 ekspression reduceres delvist proliferationen af ​​lungecancerceller mens Rac1shRNA2 mere potent inhiberede cellevækst (fig. 1B) og forårsagede et signifikant fald i antallet af kolonier dyrket i blød agar-kolonidannelse assayet (fig. 1C). Endvidere cellecyklusanalyse udført af BrdU-farvning og FACS-analyse afslørede et fald i S-fase og en tilsvarende stigning i G0 /G1-fasen af ​​cellecyklussen ved Rac1 målretning (fig. 1D). I H441 celler, Rac1 shRNA2 medførte -75% reduktion i Rac1 protein (fig. S1A), og en relativ mindre virkning på proliferation (Fig. S1B). I H1299 og H23-celler, Rac1 knockdown forårsagede en signifikant reduktion i proliferation (fig. S1c, S1E) og blød agar-kolonidannelse (Fig. S1D, S1F). For at bestemme om de Rac1 knockdown virkninger på proliferation og blød agar vækst er specifikke for Rac1, udførte vi shRNA-resistente Rac1 cDNA mutant redningsforsøg i knockdown-celler. Udtrykke en Rac1 shRNA resistent mutant cDNA kunne meste redde spredning af Rac1 slået ned i A549 celler uden en påviselig effekt på scr shRNA behandlede kontrol celler (Fig. 1E). Ligeledes vi observeret en redning af blød agar kolonidannelse ved at udtrykke shRNA-resistente Rac1 cDNA mutant (fig. 1 F). Tilsammen indikerer disse resultater, at Rac1 er påkrævet til den proliferative potentiale NSCLA celler.

(A) Cellelysater opsamlet fra enten krypterede shRNA (SCR) eller Rac1 shRNA (shRNA1, shRNA2) A549-celler blev udsat for Rac1 Western blot-analyse. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (B) Inficerede celler blev sorteret og udpladet på 96-brønds plade og proliferationsassay blev udført under anvendelse MTS-reagens. Assay blev udført tredobbelt, og ovenfor er en repræsentant for tre uafhængige forsøg. (C) Inficerede celler blev sorteret, udpladet for blød agar koloniassay og kolonier pr felt blev talt efter 2 uger. Assay blev udført tredobbelt, og ovenfor er en repræsentant for tre uafhængige forsøg. (D) Inficerede celler blev sorteret og inkuberet med BrdU i log-fase af cellevækst. Celler trypisinized, farves med BrdU antistof blev 7AAD og cellecyklus analyse udført ved hjælp af flowcytometri. Assay blev udført tredobbelt, og ovenfor er en repræsentant for fire uafhængige forsøg. Fejlsøjler repræsenterer SD. (E) Kontrolceller eller celler, der udtrykker shRNA resistente Rac1 mutanten blev inficeret med SCR eller Rac1 shRNAs, sorteret og udpladet på 96-brønds plade. Proliferationsassay blev udført under anvendelse MTS-reagens. Assay blev udført tredobbelt, og ovenfor er en repræsentant af to uafhængige forsøg. (F) Inficerede celler blev sorteret, udpladet for blød agar koloniassay og kolonier blev talt efter 10 dage. Assay blev udført i tre eksemplarer og derover er en repræsentant for to uafhængige forsøg.

Rac1 Knockdown resulterer i nedsat adhæsion, migration og invasion af NSCLA celler

I overensstemmelse med den kendte rolle Rac1 i cytoskeleton regulering, Rac1 knockdown i både A549 og H441 celler resulterede i ændret aktincytoskelettet organisation (data ikke vist). Undertrykkelse af Rac1 i A549 celler forårsaget nedsat omdrejningspunkt vedhæftning kompleksdannelse, med kontrol celler udviser robuste fokale vedhæftning komplekser visualiseret ved immunfarvning for de centrale adhæsionsproteiner p-FAK, vinculin, og p-paxillin mens Rac1shRNA2 inficerede celler demonstreret reduceret omdrejningspunkt vedhæftning kompleksdannelse (fig. 2A). Vi har også observeret reduceret p-FAK, p-paxillin og p-MLC i Rac1 Knockdown celler sammenlignet med kontrolceller ved Western blot-analyse (fig. S2A). Svarende til den mindskede adhæsion komplekser i Rac1shRNA inficerede celler, adhæsion til fibronectin blev reduceret i disse celler sammenlignet med kontrolceller (fig. 2B). Svarende til effekten på spredning, Rac1 delvis knockdown i H441 celler resulterede i en relativt lille effekt på vedhæftning til fibronectin sammenlignet med A549-celler (fig. S2B). Desuden Rac1 knockdown i både A549 og H441 celler resulterede i nedsat trans-brønd migration og invasion aktiviteter sammenlignet med kontrol celler (fig 2C, 2D, .. Fig S2C, figur S2D.). Tilsvarende Rac1 knockdown i H1299 eller H23-celler drastisk formindsket migration i sammenligning med kontrolceller (fig. S2E, fig. S2F). Udtrykker et shRNA-resistent Rac1 cDNA mutanten var i stand til helt at redde migration fænotype af Rac1 knockdown i A549-celler (fig. 2E). Disse data viser betydningen af ​​Rac1 i NSCLA cancer celleadhæsion, migrering og invasion.

(A) Inficerede A549-celler blev sorteret, udpladet på fibronectin overtrukne objektglas og farvet med enten p-FAK (øverste panel) eller vinculin (midterste panel) eller p-paxillin (nederste panel) og DAPI. Billeder blev opsamlet under anvendelse af fluorescerende mikroskop ved 40X forstørrelse. Billederne ovenfor er repræsentative for flere billeder opnået fra to uafhængige forsøg. (B) A549 sorteret celler blev udpladet på fibronectin overtrukket plade med 96 brønde til

in vitro

adhæsion assay og celler fastgjort til pladen efter 1 time blev bestemt under anvendelse MTS-reagens. Adhæsion assay blev udført med fem gentagelser og dataene repræsenterer tre uafhængige forsøg. (C) Sorterede celler blev udpladet på trans-well migration plader og migration af celler mod 10% FBS blev målt natten over. Assay blev udført i replikater og Ovenstående data var repræsentative for tre uafhængige forsøg. (D) Sorterede A549-celler blev udpladet på Matrigel coated invasion plader og migration af celler mod 10% FBS og 10 pg /ml fibronectin blev målt efter 48 timer. Assay blev udført i triplikater og ovenstående er en repræsentant for tre uafhængige forsøg. Fejlsøjler repræsenterer SD. (E) Kontrol eller celler, der udtrykker Rac1shRNA resistente mutant blev inficeret med Rac1 shRNA og sorteres. Celler blev udpladet på trans-well migration plader og migration af celler mod 10% FBS blev målt natten over. Assay blev udført i tre eksemplarer og over data var repræsentativ for to uafhængige forsøg.

Rac1 knockdown forhindrer lunge kolonisering af NSCLA celler i mus

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​Rac1 knockdown på tumorigenese og metastatisk adfærd lungeadenocarcinom celler. Rac1 knockdown eller kontrol celler blev injiceret intravenøst ​​i svækket immunforsvar NSG mus i en lunge kolonisering model. Både A549 (fig. 3A) og H441-celler (fig. S3A), der udtrykker Scr (500.000 celler /mus) forårsagede tumordannelse i lungerne, mens Rac1 Knockdown celler (500.000 celler /mus) undlod at danne tumorer i lungerne 8 uger post- indsprøjtning. Som forventet Rac1shRNA1 inficerede celler, som viste en delvis Rac1 protein Knockdown dannede reducerede antal tumorer. For at bestemme om virkningen på lunge kolonisering angår en homing defekt af Rac1 knockdown celler i lungen, testede vi evnen af ​​tumorcellerne til hjem til lungevævet 48 timer efter injektion i halevenen. Flowcytometri-analyse afslørede, at YFP

+ Rac1 Knockdown celler viste signifikant nedsat lunge målsøgende aktivitet sammenlignet med YFP

+ Scr-celler (fig. 3B). Desuden subkutan xenotransplantat af tumorcellerne (500.000 celler /mus) i NSG mus fastslået, at Rac1 Knockdown celler havde forsinket tumorudvikling og reduceret tumorvolumen i sammenligning med kontrolceller (fig. 3C). Interessant nok blev sfære dannelsen af ​​H441-celler, som korrelerer med tumorfremkaldende potentiale, også kompromitteret ved Rac1 knockdown (Fig. S3B) henviser ikke blev observeret nogen effekt af Rac1 knockdown på kugle dannende aktivitet af de ikke-transformerende HBEC kontrolceller (fig. S3C ). Det er således sandsynligt, at Rac1 Knockdown virkninger tumorcelle lunge kolonisering, vækst på grund af en kombineret virkning på cancercelle homing og proliferation i lungen.

(A) 5 × 10

5 A549-celler blev injiceret i halevenen på NSG mus (n = 6 pr betingelse) og lunger blev dissekeret efter 8 uger. Lunge blev farvet med Bouins opløsning og affarvet i 70% ethanol. Kvantificering af lunge kolonisering data blev vist i panelet til højre. Fejl søjle repræsenterer SE. Afbildet er en repræsentant for to uafhængige forsøg. (B) Tumorcelleresistens homing assay blev udført som beskrevet i fremgangsmåder (n = 6 pr tilstand i hvert forsøg). Homing-indekset blev målt i procent af YFP positive celler detekteret i lunge, normaliseret til at styre. Afbildet er en repræsentant for tre uafhængige forsøg. (C) 5 × 10

5 scr eller Rac1 shRNA inficerede celler blev injiceret subkutant i flankerne af NOD /SCID-mus og tumorvolumen blev målt ugentligt i 7 uger. Fejl søjle repræsenterer SE.

Side population celler indeholder forhøjede Rac1-GTP og øget migration, invasion, og lunge kolonisering aktiviteter

kræft stamceller teori foreslår, at en brøkdel af kræft cellepopulation beriget for tumorfremkaldende kapacitet, hvilket således kræver præferentiel målretning til at opnå terapeutiske fordele. Side befolkning er en af ​​de stamcellemarkører der er blevet anvendt til at isolere lungekræft stamceller [12]. Vi isolerede SP-celler ved flowcytometri fra A549-celler (fig. 4A) og bekræftet ved RT-PCR, at de udtrykker øget ABCG2 transporter (Fig. S4A). Interessant indeholdt SP-celler forøget Rac1 aktivitet (fig. 4B) og vises forøget migration sammenlignet med ikke-SP-celler eller parentale celler (fig. 4C). Inhibering af Rac1 aktivitet ved anvendelse af et lille molekyle Rac inhibitor, NSC23766, resulterede i nedsat migration og invasion af SP-celler (fig. S4b, S4C), hvilket tyder forhøjet Rac1-GTP i SP-celler bidrager til disse tumorceller adfærd. Desuden viste SP celler øget lunge kolonisering kapacitet

in vivo

sammenlignet med ikke-SP eller parentale celler (Fig. 4D). Interessant, på trods af forskellige tumor initiering aktiviteter

in vivo

, SP og ikke-SP celler prolifererede med samme hastighed som de parentale celler

in vitro

(Fig. S4D). Men de viste SP-celler forøget kolonidannelse aktivitet, når vokser i blød agar sammenlignet med ikke-SP og parentale celler (Fig. S4E). Den tilbageværende tumorigen aktivitet udvist af de ikke-SP-celler ikke skyldtes urenheder af disse celler, fordi parallel FACS-analyse fundet i løbet af 99,9% berigelse for ikke-SP celler fra Hoechst 33342 farvestof sortering (data ikke vist). Derfor er det sandsynligt, at en plasticitet af de ikke-SP celler giver dem mulighed for at give anledning til kræft initierende celler, hvilket resulterer i den observerede resterende tumorgenicitet.

(A) A549 celler blev farvet med Hoechst 33342 farvestof og analyseret med flowcytometri for side befolkning (venstre panel). Celler blev behandlet med 10 pM Fumitremorgen for inhibitor-kontrol (højre panel). Afbildet er en repræsentant for flere SP-analyser. (B) Cellelysater opsamlet fra sorterede SP og ikke-SP-celler blev udsat for GST-PAK pull down assay og forarbejdet til Rac1 western blot-analyse for at bestemme Rac1 aktivitet. Totalt Rac1 blot blev anvendt som kontrol. Afbildet er en repræsentant for tre uafhængige Rac1 aktivitet pull-down-analyser. (C) Sorteret A549 celler udpladedes for trans-brønd migration assay og celler migrerede natten over mod 10% FBS blev farves og tælles. Ovenfor er en repræsentant for tre uafhængige eksperimenter og fejllinjer repræsenterer SD. (D) 5 × 10

4 Weaver SP og ikke-SP-celler blev injiceret i halevenen på NSG mus (n = 4 pr betingelse). Lunger blev dissekeret ud ved udgangen af ​​12 uger. Højre panel viser kvantificering af lungekolonisering data. Fejl søjle repræsenterer SE. Ovenfor er en repræsentant for tre uafhængige forsøg

SP celler blev også påvist i H441 celler med en lavere procentsats end A549 celler (Fig s4f;. 0,5-2% vs. 4-10%).. Svarende til A549 SP-celler, de viste H441 SP-celler forøget lunge kolonisering i immunsvækkede mus sammenlignet med ikke-SP-celler (fig. S4G), og dannede flere kolonier i blød agar sammenlignet med ikke-SP og parentale celler (Fig. S4H).

Disse resultater fører til den konklusion, at SP-celler fra NSCLA repræsenterer en subpopulation i bulk tumorceller, som indeholder forhøjede Rac1 aktivitet, øget migration, invasion, forankringsuafhængige vækst aktiviteter, og er beriget med celler, der er i stand kolonisere lunge. De foreslår også, at ikke-SP celler kunne forblive tumorigen, omend med reduceret CSC aktivitet, at give anledning til tumorer.

Rac1 knockdown undertrykker vedhæftning, migration og invasion af både SP og ikke-SP celler

for yderligere at undersøge effekten af ​​Rac1 knockdown på SP celler blev A549 celler inficeret med lentivirus enten indeholder scr eller Rac1 shRNA, og SP og ikke-SP-celler blev isoleret ved flowcytometri. Western blot-analyse bekræftede effektiviteten af ​​Rac1 knockdown i både SP og ikke-SP-celler (fig. S5A). I tråd med vores tidligere data om forældrenes celler, Rac1 knockdown ændret cytoskeletorganisation af både SP og ikke-SP-celler (fig. S5B), og reduceret fokale vedhæftning komplekser som visualiseres ved p-FAK immunfarvning af både SP og ikke-SP celler (fig. 5A). Konsekvent, vedhæftning aktivitet af både SP og ikke-SP-celler til fibronectin blev også faldet (fig. 5B). Endvidere Rac1 knockdown faldt migration og invasion af både SP og ikke-SP-celler (fig. 5C, 5D). Således kan Rac1 målretning undertrykke migration og invasion af både SP og ikke-SP cancerceller.

(A) Sorterede celler blev udpladet på fibronectin overtrukne objektglas, fikseret og underkastet immunofarvning med p-FAK-antistof. Cell billeder blev indsamlet ved 40X forstørrelse med anvendelse Fluorescent mikroskop. Ovenfor afbildet er repræsentative for flere billeder indsamlet. (B, C, D) A549 sorteret celler blev enten udpladet på fibronectin coatede 96-brønds plade til

in vitro

adhæsion assay (B), på trans-brønds plader for migration assay (C) eller matrigel coated invasion plader til invasion assay (D). Alle assays blev udført in triplo og fejlsøjler repræsenterer SD. Afbildet er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Rac1 målretning nedsætter proliferation og lunge kolonisering af både SP og ikke-SP celler

For at undersøge, om den observerede hæmning af spredning af den samlede kræft cellepopulation ved Rac1 knockdown skyldes en specifik virkning på CSCS, vi næste testede vækstegenskaber af isolerede SP og ikke-SP-celler før og efter transduktion af Rac1-specifik shRNA. Spredningen af ​​SP og NSP celler

in vitro

dukkede lignende under standard væv dyrkningsbetingelser, og Rac1 knockdown blokeret

in vitro

spredning af både SP og ikke-SP celler til tilsvarende omfang (Fig . 6A). BrdU mærkning viste, at både SP og ikke-SP-celler blev inhiberet i S-faseovergangen med en tilsvarende stigning i G0 /G1-fasen af ​​cellecyklussen efter Rac1 knockdown (Fig. 6B). Mens scrambled RNA ikke påvirkede den øgede kolonidannelse aktivitet af SP celler i en blød agar assay sammenlignet med ikke-SP celler i enten reduceret serum eller normale serum betingelser (figur 6C;. Data ikke vist), Rac1 shRNA var i stand til at reducere kolonidannelse af både SP og ikke-SP A549-celler. I hale-vene injiceret NSG mus blev lunge kolonisering af Rac1 shRNA SP-celler drastisk faldt sammenlignet til SCR-celler og de tilsvarende ikke-SP-celler viste ingen tumor kolonisering aktivitet (fig. 6D). Disse resultater tilvejebringer stærke beviser for, Rac1 målretning er effektiv til inhibering af proliferation og metastase af både SP og ikke-SP-celler. For at teste om de Rac1 knockdown virkninger på proliferation gælder for cancerstamceller markeret med CD133, udførtes en BrdU inkorporering assay, hvor BrdU positive celler blev gated i CD133

+ eller CD133

– population af både SCR og Rac1 shRNA behandlede celler. Vi observerede et fald i BrdU

+ -celler i både CD133

+ og CD133

– subpopulationer upon Rac1 knockdown (. Figur 6E). Således er Rac1 påkrævet for proliferation af CSC befolkning.

(A) Sorterede celler blev udpladet i 96-brønds plade og proliferationsassay blev udført under anvendelse MTS-reagens. Assay blev udført in triplo og fejlsøjler repræsenterer SD. Afbildet er en repræsentant for tre uafhængige forsøg. (B) A549 sorteret celler blev inkuberet med BrdU og cellecyklus-analyse blev udført ved BrdU-farvning og flowcytometrisk analyse. Assay blev udført tredobbelt og fejlsøjler repræsenterer SD. Ovenfor er en repræsentant for to uafhængige forsøg. (C) Sorted celle var direkte udpladet for blød agar-kolonidannelse assayet og antallet af dannede kolonier blev talt efter 2-3 uger. Assay blev udført tredobbelt og fejlsøjler repræsenterer SD. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg.