PLoS ONE: Let Exposure at Night forstyrrer Vært /Cancer døgnrytmen Regulatory Dynamics: Betydning for Warburg Effect, Lipid Signaling og Tumor Growth Prevention

Abstrakt

Den centrale døgnrytmen ur inden suprachiasmatic kerne (SCN) spiller en vigtig rolle i temporalt organisering og koordinering mange af de processer, der styrer cancercelleproliferation og tumorvækst synkront med den daglige lys /mørke-cyklus, som kan bidrage til forebyggelse endogene cancer. Bioenergetic substrater og molekylære mellemprodukter kræves for at opbygge tumor biomasse hver dag er afledt af både aerobe glycolyse (Warburg effekt) og lipidmetabolisme. Brug væv-isoleret human brystkræft xenografter dyrket i nøgne rotter, vi fastslået, at cirkulerende systemiske faktorer i værten og Warburg effekten, linolsyre uptake /metabolisme og vækst signalering aktiviteter i tumoren er dynamisk reguleret, koordineret og integreret i døgnrytmen tid struktur over en 24-timers lys /mørke cyklus ved at SCN-drevet natlig pineal produktion af anticancer hormon melatonin. Dæmpet lys natten (LAN) -induceret melatonin suppression forstyrrer denne døgnrytmen-regulerede vært /cancer saldoen på flere vigtige cancer forebyggende signaleringsmekanismer, hvilket fører til hyperglykæmi og hyperinsulinæmi i værten og løbske aerob glycolyse, lipid signalering og proliferativ aktivitet i tumoren.

Henvisning: Blask DE, Dauchy RT, Dauchy EM, Mao L, Hill SM, Greene MW, et al. (2014) Let Exposure at Night forstyrrer Vært /Cancer døgnrytmen Regulatory Dynamics: Påvirkning af Warburg Effect, Lipid Signaling og Tumor vækst Forebyggelse. PLoS ONE 9 (8): e102776. doi: 10,1371 /journal.pone.0102776

Redaktør: Shin Yamazaki, University of Texas Southwestern Medical Center, USA

Modtaget: September 25, 2013; Accepteret: 23 juni 2014; Udgivet: 6 August, 2014

Copyright: © 2014 Blask et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde var generøst støttet af American Association for Laboratory Animal Science (www.aalas.org) Tilskud til Laboratory Animal Science (GLAS) Award til FTU, National Institutes of Health (www.nih.gov) giver R21CA129875 til DEB, Tulane University School of Medicin (www.tulane.edu) og Louisiana Cancer Research Consortium (www.louisianacancercenter.org) Startup Grant 631.455 til DEB og National Institutes of Health give R01CA054152 til SMH. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

fornyet interesse i metabolismen af ​​vækst kræft [1] – [3] har for nylig ført til en intensiv reevaluering af den rolle, som aerob glykolyse (f.eks den Warburg effekten) i ondartet vækst progression [4 spillet ]. For at opfylde deres bioenergetic behov for at støtte biosyntesen af ​​de molekylære og cellulære byggesten, der er nødvendige for hurtigt voksende tumor biomasse, kræftceller især afhænge af den Warburg effekten snarere end oxidative fosforylering [1] – [4]. Faktisk er den Warburg effekten karakteriseret ved den robuste cellulære optagelse af glucose og dets metabolisme til lactat via glycolyse trods en rigelig forsyning af ilt [1] – [4]. Undersøgelser har fokuseret på signaltransduktion og transkriptionelle netværk, herunder AKT [5], hypoxi-inducerbare faktor-1 alfa (HIF-1α) og c-myc [6], der drev Warburg effekten at omdirigere kræft celle bioenergetik mod generering af molekylære mellemprodukter til støtte vedholdende kræft celledeling [1] – [3]. Cancercelleproliferation og tumorvækst også stole på den cellulære optagelse af linolsyre (LA), en essentiel omega-6 fedtsyre (FA), der er den mest udbredte FA i den vestlige kost [7] – [9]. I mange tumorer, cancerceller take-up LA via en cAMP-afhængig transportmekanisme og metabolisere det til mitogenet 13-hydroxyoctadecadienoic acid (13-HODE) af enzymet 15-lipoxygenase-1 [9] – [12], aktiviteten hvoraf opreguleres ved aktivering af epidermal vækstfaktor (EGF) og insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF-1) -receptorer [13], [14]. I mange tumorer, herunder humane cancer xenografter [9], [11], [12], 13-HODE udøver en positiv feedback effekt på EGF og IGF-1-receptoren vækst signalveje at øge downstream phosphorylering af ERK1 /2 og AKT, der fører til forstærket celleproliferation og overlevelse svar [15]. Det skal dog bemærkes, at i nogle andre kræft modelsystemer og eksperimentelle sammenhænge 13-HODE kan spille en antiproliferativ rolle [16].

homeostatiske processer, der regulerer pattedyr fysiologi og stofskifte i celler, væv og organer udviser døgnrytmen, der er synkroniseret med lys /mørke cyklus omfatter hver 24-timers dag. Dette opnås gennem den endogene oscillerende tidtagning aktivitet SCN i hypothalamus, der modtager information om lys /mørke cyklus fra øjnene primært via uløseligt lysfølsomme, melanopsin-positive retinal ganglion celler med yderligere input fra stave og tappe. Photic oplysninger er derefter behandlet af SCN og transduceres i et array af hormonelle og neurale udgange til perifere målvæv [17]. Hos mennesker, forstyrrelse af døgnrytmen regulering af metaboliske processer, herunder glucose og lipidmetabolisme induceret via den unormale timingen af ​​lys kan medføre øget risiko for type 2 diabetes, fedme [18], [19] og forskellige maligniteter, herunder brystcancer som har blevet rapporteret i nat skifteholdsarbejdere [20], [21]. Udgangssignalet fra SCN, at de fleste pålideligt afspejler circadian aktivitet er natlig pinealkirtlen produktion af melatonin, der undertrykkes af LAN. Circadian melatonin signal er blevet forbundet med den tidsmæssige organisation og synkronisering af mange fysiologiske og metaboliske aktiviteter, herunder glucose og lipidmetabolisme [19], [22], [23].

Udgange fra SCN menes at koordinere den biologiske timingen af, og i tilfælde af melatonin, modulere processerne for tumor initiering, promotion og progression herunder celleproliferation, DNA-syntese, celleoverlevelse /apoptose, cellecyklus travers, DNA-skader /reparationsmekanismer, tumor suppressor aktiviteter og tumorcelle invasion /metastase [24] – [27]. Vi har tidligere vist, at melatonin, ved fysiologiske natlige blodkoncentrationer, direkte inhiberer tumor-DNA-syntese og vækst ved at undertrykke den cAMP-afhængige tumoroptagelse LA og dens metabolisme til den mitogene molekyle 13-HODE [10], [12] via en melatoninreceptor medieret mekanisme. Men den potentielle inddragelse af døgnrytmen regulering og konsekvenserne af sin forstyrrelser på kræft stofskifte, især Warburg effekten, er aldrig blevet behandlet siden undersøgelser på dette område har været baseret næsten udelukkende på

In vitro

studier i som indflydelsen af ​​kræft host central døgnrytmen regulering er fraværende. Vi postulerede, at den daglige bioenergetic, metabolisk signalering, og proliferative aktiviteter til opbygning udviser tumor infrastruktur dynamiske døgnrytmer i både værten og tumoren, der bidrager til forebyggelse af tumorvækst. Disse rytmer, som er afhængige af natlig produktion af melatonin, en circadian tumorvækst forebyggelse signal, sprænges ved udsættelse af værten til LAN resulterer i øget tumor metabolisme og vækst.

Materialer og Metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Tulane University Institutional Animal Care og brug Udvalg (NIH Assurance # A4499-01). Alle dyrene blev holdt i et anlæg godkendt af Association for vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care, International. Alle operation blev udført under ketamin /xylazin anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Reagenser

Højtydende væskekromatografi (HPLC) -Grade chloroform, ethylether, methanol, glaciale eddikesyre, heptan, hexan og Sep-Pak C18 patroner til HPLC ekstraktion af prøver blev indkøbt fra Fisher Chemical (Pittsburgh, PA). Fri fedtsyre, cholesterolester, triglycerid, phospholipid, rapsolie methyl ester standarder, samt bortrifluorid-methanol, kaliumchlorid, natriumchlorid, perchlorsyre og trichloreddikesyre blev indkøbt fra Sigma Scientific (St. Louis, MO). HPLC-standarder, blev (+/-) 5-HETE og 13 (S) -HODE), samt ultrarent vand indkøbt fra Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, Michigan). Salg

Dyr, lysforhold , tumor implantering og vækst

fravænnede kvindelige nøgne rotter (Hsd: RH-

Foxn1 [RNU]

) mellem 35 og 50 g blev opstaldet i klare polycarbonat bure (2 rotter /bur) i de laboratorium lys eksponering kamre på en 12-timers lys /12-timers mørke (LD, 00:12) cyklus (lys på 0600-1800 timer eller zeitgeber tid ZT0-ZT12 ved 23 ° C og 45-50% luftfugtighed og tilladt at akklimatisere til disse betingelser i to uger. rotter blev tilvejebragt vand og mad (Purina Prolab RMH 1000) ad libitum under hele undersøgelserne. efter akklimatisering periode blev dyrene tilfældigt opdelt i en kontrolgruppe af 36 rotter, der blev på LD, 12:12 belysning regime (fuldstændig mørke i mørke fase) og en anden gruppe på 36 rotter opretholdt på LD, 12:12 med udsættelse for dim LAN under den mørke fase. lysintensiteten under 12 timers lys fase i både grupper blev leveret af en en ballast /lampe-system (GE Watt gnier, F34CW-RS-WM, 34-W pære) i hvert kammer, leveres en konstant lys stimulus på dyr øjenhøjde på 141 pW /cm

2 ( 345 lux). I kammeret leverer dim LAN, der var en anden ballast /lampe-system (GE Starcoat, F32T8-SP-11, 32-W pære), der udsendes konstant svagt lys stimulus på dyr øjenhøjde på 0,08 pW /cm

2 ( 0,2 lux) i den mørke fase 12-timer [12]. Seks uger senere blev dyrene implanteret med steroid receptor negative (SR-) MCF-7 human brystcancer-xenografter i et væv-isoleret måde, som tidligere [12] beskrevne. Disse tumorer havde udviklet sig over flere passager fra en delmængde af SR + xenotransplantater, der havde mistet ekspressionen af ​​østrogen og progesteron-receptorer og blev østrogen ikke reagerer. Disse xenotransplantater blev histopatologisk karakteriseret som dårligt differentieret, grad 3, infiltrerende duktalt adenokarcinom som tidligere beskrevet [12]. I løbet af døgnrytmen /tumorvækst undersøgelse, når tumorerne nåede en tilstrækkelig størrelse for rotter måling blev udsat for lys CO

2 narkose, og tumordimensionerne blev målt gennem huden med skydelære hver anden dag; tumor dimensioner blev konverteret til estimerede tumor vægte ved hjælp af en lineær regression formel og vækstrater beregnet som beskrevet tidligere [9], [12]. Den endelige tumorvægt i undersøgelsen tumorvækst blev bestemt ved vejning ved slutningen af ​​eksperimentet. Ved afslutningen af ​​hver af de tumor vækstperioder, når tumorerne nåede ca. 5-6 g i både kontrol- og LAN-eksponerede grupper blev delmængder af 6 dyr tilfældigt dræbt og deres tilsvarende tumorer høstedes hver 4. time over en enkelt 24-timers periode på 6 forskellige døgnrytmen tidspunkter (f.eks 0800 timer = ZT2, 1200 timer = ZT6, 1600 timer = ZT10, 2000 timer = ZT14, 2400 timer = ZT18, og 0400 timer = ZT22) som tidligere beskrevet [28]. På grund af de stærkt accelererede tumor vækstrater i LAN-gruppen, xenografter (n = 36) nåede den målrettede høst størrelse på 5-6 g cirka to uger før den af ​​xenotransplantaterne (n = 36) i LD 12:12 kontrol gruppe.

arterieblod Indsamling fra Tumor Host Rotter

Efter to uger af belysning regimer er beskrevet ovenfor, blev dyrene udsat for en serie af seks små mængder blod trækker via cardiocentesis at indsamle venstre ventrikel arterielt blod, som beskrevet tidligere [9], [10], [12], [28] i løbet af en periode på 30 dage før tumorimplantation (se ovenfor). Kort fortalt blev blod samlinger udføres på udpegede 4-timers intervaller over en 24-timers periode, der begynder ZT2 (0800 timer) med hvert dyr bliver udsat for cardiocentesis kun en gang hver 5 dage i perioden 30 dage før tumor implantation. Dette blev gjort for de dyr, for at genoprette deres lille blodvolumen tab og for at minimere stress og mindske de potentielle virkninger af proceduren på fodring og sygelighed /dødelighed. Dyrene blev let bedøvet af CO

2 inhalation (70% CO

2/30% luft); 1 ml prøver blev taget fra den venstre ventrikel ved hjertepunktur (mindre end 5% total blodvolumen) via tuberkulin sprøjte (25 gauge, 3/8; Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) fugtes med natriumheparin (1.000 U /ml; Elkin-Sinn, Cherry Hill, NJ), som tidligere beskrevet. Blodprøvetagning under den mørke fase (dvs. 2000, 2400, 0400 timer) blev udført under en safelight rød lampe (Kodak 1A, model B, katalog # 152 1517, 120 V, 15 W, Rochester, NY) for at bevare den natlige melatonin bølge [9], [10], [12], [28]. Animal røde lampe eksponering i øjenhøjde under den korte 45-sek cardiocentesis procedure var ikke større end 0,48 ± 0,01 lux (1,16 ± 0,04 pW /cm

2). Der var ingen komplikationer som følge af anæstesi eller cardiocentesis i perioden blodprøvetagning; overlevelsen var 100% og dyrene blev straks aktive efter proceduren. Plasmaprøver blev opbevaret ved -20 ° C indtil analyseret for melatonin, insulin, glucose, lactat og totale fedtsyrer.

Indsamling af arterielt blod fra Tumor Perfusion donorrotter Salg

Inden initiering af tumor perfusioner, 3-4 voksne nøgen hunrotter vedligeholdes på LD 12:12 blev bedøvet ved hjælp af ketamin-xylazin løsning (89,1 mg /kg og 9,9 mg /kg, IP). Dyr blev hepariniseret via jugular injektion af natriumheparin (25 mg /kg, Sargent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL). Fyrre til 50 ml arterieblod blev indsamlet mellem 0600 og 0900 (lave melatonin niveauer) fra den højre halspulsåre af donor-rotter via kateter til de tumor perfusion eksperimenter (3 til 4 perfusioner per gruppe), samlet, filtreret gennem en 2 “× 2 “ostelærred pude (Kendall kerhed gazesvamp, Tyco Healthcare, Mansfield, MA), gemt på et reservoir under mineralsk olie (Cat # M1180-500 ML;. Sigma Scientific, St. Louis, MO) og nedkølet ved 4 ° C i et reservoir på is og blandes forsigtigt via mekanisk omrører (Model # 6975-171, Corning, NY) [9], [10], [12], [28]

Tissue-isoleret Tumor Perfusion

In situ

Når (SR-) MCF-7 human brystkræft xenografter nåede 5-6 gm anslået tumor vægt, blev dyrene forberedt til arterielle-venøse forskel målinger af totale fedtsyrer (TFAs), LA, 13-HODE, glucose, lactat, PO

2, CO

2 og pH mellem 0600 og 1000 timer, når endogene melatonin niveauer var lav. Væv-isolerede xenotransplantater blev perfunderet

in situ

med rotte donor hel-blod, som enten syntetisk melatonin (Sigma, St. Louis, MO) og /eller 13 (S) -HODE (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI), eller MT

1 /MT

2 melatonin receptorantagonist S20928 (en generøs gave fra Institut de Recherches Internationales Servier, Courbevoie Cedex, Frankrig) blev tilsat som tidligere beskrevet [9], [10], [12 ], [28]. Sæt (3 eller 4 tumorer /perfusion) af væv-isolerede human brystcancer xenotransplantater blev perfunderet

in situ

i 1 time som tidligere beskrevet [9], [10], [12], [28] med hele -blood indsamlet fra donor rotter. Inkorporering af [

3H] thymidin i tumor-DNA blev indledt 20 minutter før afslutningen af ​​hver perfusion ved at injicere 20 pi fysiologisk saltvand indeholdende 2 uCi [methyl-

3H] thymidin /g (New England Nuclear, Perkin Elmer, Boston, MA) anslået tumorvægt i det arterielle kateter. Ved afslutningen af ​​hver perfusion, tumorer var fryse-fastspændt under flydende nitrogen, vejes og opbevares ved -85 ° C indtil analyse.

Arterial Glucose, laktat og syre /Gas Målinger

Under løbet af denne undersøgelse arterielle hele blodprøver blev taget til måling af pH, PO

2, pCO

2, glucose og laktat niveauer, og hæmatokrit ved hjælp af en iSTAT1 Analyzer og CG4 + og CG8 + patroner (Abbott Laboratories, East Windsor, NJ). Værdier for glucose og lactat rapporteres som mg /dl og mmol /l, og for pO

2 og pCO

2 som mm Hg. Mindstekrav detektionsgrænsen for pH, PO

2 og pCO

2, glucose og lactat værdier var henholdsvis 0,01, 0,1 mm Hg, 0,1 mm Hg, 0,2 mg /dl og 0,01 mmol /l.

melatonin og insulin analyser

Arteriel plasma melatonin niveauer blev målt via radioimmunoassay ved hjælp af melatonin rotte

125I – radioimmunassaykit (Labor Diagnostika Nord, Nordham, Tyskland) og analyseret ved hjælp af en Packard Cobra 5005 Automated Gamma Counter (Palo Alto, CA), som tidligere beskrevet [10], [12]. Arteriel plasmainsulin-niveauer blev målt under anvendelse af et ELISA-kit (Diagnostic Systems Labs., Webster, TX).

Fatty acid ekstraktion og analyse

arteriel plasma frie fedtsyrer (FFA), triglycerider (TGA ), phospholipider (PL), og cholesterolestere (CE) blev ekstraheret fra 0,1 ml prøver, som tidligere beskrevet [9] – [10], [12], [28]. Inden ekstraktionen heptadecansyre (100 ug), der var blevet opløst i chloroform (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), blev anvendt som en intern standard. Methylestere af fedtsyrer (FAS) blev analyseret ved hjælp af en Hewlett Packard (Palo Alto, CA) model 5890A gaskromatograf udstyret med en flammeioniseringsdetektor (model # 7673 A) autoinjektor (model # 7673 S), og integrator (model # 3396A). Alle separationer blev udført under anvendelse af en 0,25 mm x 30-m kapillarsøjle (model # 2380; Supelco, Inc., Bellefonte, PA) ved 190 ° C, med helium som bæregas (lineær hastighed 20 cm /s; split 100:1). Injektionsport og detektoren blev indstillet til 220 ° C. Alle methylestere blev identificeret på basis af deres retentionstid i sammenligning med den for kendte standarder. Mindste påviselige grænse for assayet var 0,05 ug /ml.

Tumor lysat ekstraktion, proteinekstraktion og Western blot-analyse

Frosne tumorer blev pulveriseret og manuelt homogeniseret i 50 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCI, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,1% natriumdeoxycholat, 1 mM Na3VO4, 100 nM okadainsyre, og 1 × proteaseinhibitorcocktail sæt I (Calbiochem /EMD Biosciences, Billerica, MA). Tumorlysater blev centrifugeret ved 15.300 x g i 20 minutter. Supernatanter blev alikvoteret og opbevaret ved -80 ° C. Proteinkoncentrationer af supernatanterne blev bestemt ved anvendelse af et proteinassaykit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Totalt protein (80 ug per prøve) blev elektroforetisk separeret på en 10% SDS-polyacrylamidgel og elektroblottet over på en Hybond membran. Efter inkubering med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween blev immunblots probet med antistoffer mod phospho-AKT (Ser

473), c-myc (Cell Signaling Tech., Inc., Danvers , MA) eller HIF-1α (BD Biosciences, San Jose, CA). De samme blots blev strippet og re-probet med antistoffer til AKT (Cell Signaling Technology, Inc.), tubulin eller GAPDH (glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase) (Millipore Corp., Billerica, MA).

Statistiske analyse

tilstedeværelsen af ​​betydelige tumor rytmer i 24-timers periode, og graden af ​​deres robusthed i enten døgnrytmen-regulerede kontrol eller -disrupted LAN-udsatte grupper blev bestemt ved cosinor analyse ved hjælp periodogram (VBScript) software . Rå individuelle tumor data indsamlet over en enkelt 24-timers periode blev analyseret ved denne metode med en fast periode 24-timers. Statistiske forskelle mellem middelværdier i LAN-eksponerede gruppe versus kontrolgruppen ved hvert døgnrytmen tidspunkt blev vurderet ved anvendelse af en uparret Students t-test. Statistiske forskelle blandt gruppe betyder i tumor perfusion undersøgelser blev bestemt ved en envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni Multiple Sammenligning Test for at foretage følgende multiple sammenligninger blandt alle grupper: kontrol versus melatonin; kontrol versus melatonin + 13-HODE; kontrol versus 13-HODE; melatonin versus melatonin + 13-HODE; melatonin + 13-HODE versus 13-HODE; og melatonin versus 13-HODE. Forskelle i skråningerne af regressionslinjer (dvs. tumor vækstrater) blandt grupper blev bestemt ved regressionsanalyser og tests for parallelitet (Students t test). Forskelle blev anset for at være statistisk signifikant ved p lt; 0,05. Students t-test, en-vejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post hoc test, og lineære regressionsanalyser blev alle udført ved hjælp af GraphPad Prism 5-softwaren.

Resultater

Circadian regulering og afbrydelse af værten cirkulerende faktorer

Vi undersøgte først potentielle cirkadiske dynamik og deres afbrydelse af internet på en række vært faktorer herunder plasmaniveauer af melatonin, total FA’er (TFAs), LA, glucose, lactat og insulin hos rotter bærer væv-isoleret, steroid receptor negativ (SR-) MCF-7 human brystkræft xenografter på en lys /mørke (LD) 12:12 cyklus [12]. Plasma melatonin niveauer var lave i hele den lette fase og markant øget til spidsamplitude i midten af ​​den mørke fase (fig. 1A). Udsættelse af dyr til dim LAN inducerede en 88% undertrykkelse i natlige melatonin amplitude uden at påvirke dens døgnrytmen fase (Fig. 1A). Plasma TFA (fig. 1B) og LA (Fig. 1C) rytmer i LD kontrol, som er afhængige af døgnrytmen SCN-drevet natlig fodring aktivitet, blev bevaret i LAN-eksponerede rotter indikerer, at døgnrytmen forstyrrelser var begrænset til undertrykkelse af den natlige melatonin signal. Døgnrytmen kontrol over både blodsukker og insulin niveauer uafhængigt af virkningerne af fødeindtagelse er blevet rapporteret i rotter [29]. Plasma glucose niveauer steg efter lys på at toppe på midten af ​​lys fase efterfulgt af et fald, indtil lyset slukket (fig. 1D). Efter lysene slukket, glucosekoncentrationer oprindeligt forøget faldt derefter til nadir midten af ​​mørke fase efterfulgt af en anden stigning i slutningen af ​​den mørke periode. Plasma lactat koncentrationer i dyr opretholdt i LD 12:12 var generelt lavt i hele den lette fase efterfulgt af en stigning i den mørke periode for at nå et højdepunkt to timer før lys på (fig. 1E). Under dim LAN betingelser, rotter blev hyperglykæmiske med arytmiske blodglucoseniveauer forbliver markant forhøjet ved 50% over kontrolniveauer (fig. 1D) henviser arytmiske blod laktatniveauer forblev konsekvent lavere end kontrol i hele 24-timers periode (fig. 1E). Cirkulerende insulinniveauer udviste en daglig svingning under LD 00:12 (fig. 1F), som generelt afspejlede mønster af cirkulerende IGF-1-koncentrationer tidligere rapporteret [28]. LAN-eksponerede rotter blev markant hyperinsulinæmisk med insulin niveauer bevarer en oscillerende mønster svarende til den observeret i de LD 12:12 kontroller (Fig 1F.); cirkulerende IGF-1-niveauer var også døgnrytmen-forstyrret og forhøjede under LAN betingelser [28].

(A-F) Plasma niveauer af melatonin (A), TFAs (B), LA (C), glucose ( D), lactat (E) og insulin (F) blev målt i nøgne kvindelige vært rotter bærer tissue-isolerede SR- MCF-7 human brystcancer-xenografter under LD, 12:12 (udfyldte sorte cirkler) eller LD, 00:12 + LAN (0,2 lux) (massive røde cirkler). Arterielle blodprøver blev opnået via hjertepunktur på seks forskellige døgnrytmen tidspunkter i løbet af en enkelt 24-timers periode. Den samme 24-timers mønster for hver plasma analyt vises to gange for at illustrere rytme kontinuitet. Zeitgeber tid (ZT) repræsenterer timer efter lys på (ZT0 eller 0600 timer); lyser ud på ZT12 (1800 timer). Sorte bjælker i bunden af ​​tal viser den mørke fase og røde søjler angiver LAN. Solid sorte eller røde cirkler er gennemsnit ± SD; n = 6 ved hvert tidspunkt. Væsentlige rytmiske mønstre under LD, 12:12 forhold i A – F, s 0,001; betydelig, men forstyrret rytmiske mønstre under dim LAN betingelser A – C og F kun, s 0,001 (envejs ANOVA). * P 0,01; ** P. 0,05 LAN vs LD, 00:12 (Students

t

test)

Circadian regulering og afbrydelse af tumor glukose og linolsyre stofskifte

Vi næste testede, om tumorxenoplantater selv udstillet døgnrytmen i tumor cAMP-niveauer, LA optagelse, 13-HODE dannelse og den Warburg effekten, der kunne blive forstyrret af LAN-induceret melatonin undertrykkelse. I den foreliggende undersøgelse er den Warburg effekten identificeret som tumoroptagelse af arterielt blod glucose kombineret med frigivelsen af ​​lactat i tumoren veneblod [1] – [4]. Under LD, 12:12 betingelser, tumor cAMP-niveauer (fig. 2A), TFA uptake (fig. 2B), LA (fig. 2C) -optagelse, og 13-HODE-dannelse (fig. 2D), steg i den lette fase til når et højdepunkt to timer før lyset slukket efterfulgt af et fald i den mørke fase for at nå en nadir to timer før lys på. Tumor glukoseoptagelse (fig. 2E) og laktat produktion (fig. 2F) fulgte et lignende daglig rytmisk mønster ved stigende i lyset fase for at nå et højdepunkt to timer før lyset slukket. Under den mørke periode var der en gradvis nedgang i disse parametre med glukoseoptagelse når nadir i slutningen af ​​den mørke fase og laktat produktion faldende til et trug på midten af ​​mørke periode efterfulgt af en stigning til to timer før lys fra. Under LAN betingelser imidlertid ikke kun var disse rytmer helt fraværende, men niveauerne af hver af disse parametre forblev signifikant forhøjede over 24-timers periode.

(A-H) Tumor niveauer af cAMP (A) TFA optagelse (B), LA optagelse (C), 13-HODE formation (D), glukoseoptagelse (E), lactatdannelse (F), [

3H] thymidin-inkorporering i DNA (G), og DNA-indhold blev målt under LD, 12:12 eller LD, 12:12 + LAN; se teksten til figur 1 for yderligere eksperimentelle betingelser. (I) tumorvækst i begge grupper blev målt i løbet af forsøget. Solid sorte eller røde cirkler er gennemsnit ± SD anslået tumor vægt; n = 6 for estimeret tumorvægt. Cosinor analyse viste robuste og meget betydelige rytmiske mønstre under LD, 12:12 forhold i tumor analytter; blev påvist nogen væsentlige daglige rytmiske mønstre under dim LAN (se oversigt tabel 3). * P 0,01; ** P 0,05 LEN vs LD, 00:12 (Students

t

test). Tumor vækstkurver i I, s. 0,01 hældning af tumorvækst i LAN gruppe vs LD, 12:12 gruppe (lineær regression)

Circadian regulering og afbrydelse tumor udtryk for signalering og transkriptionelle faktorer

Vi rettet også, om AKT, c-myc og /eller HIF-1α, centrale transkriptionelle regulatorer af Warburg effekten, udviser døgnrytmen rytme, der afbrydes af dim LAN. Som en central stimulerende signal for tumorcelleoverlevelse /proliferation, og glucose og LA metabolisme, AKT aktivering [fx phosphorylering i serin-473 (s473)] var højest i den lette fase og faldt derefter til et nadir i midten af ​​mørke fase. HIF-1α ekspressionsniveauerne var lav i lyset fase efterfulgt af en stigning til at toppe udtryk under den mørke fase (figur 3 E . F). Men under dim LAN eksponering, den rytmiske udtryk for både phospho-AKT (Pakt

s473) og HIF-1α blev fuldstændig afbrudt (Fig 3 A . B og E F). Tumor c-myc-ekspression blev stærkt forhøjet under hele lette fase efterfulgt af et markant fald til et lavpunkt i anden halvdel af den mørke fase (figur 3 C . D). Som reaktion på LAN-induceret melatonin suppression imidlertid en signifikant, men mindre robuste rytmisk ekspression af c-myc varet i 24 timer (fig 3 C E . F).

(A-F ) Tumor niveauer af phospho-AKT

Ser473 (A B), cMyc (C D), og HIF-1α (E blev F) målt under LD, 12:12 eller LD, 00:12 + LAN; se teksten til figur 1 for yderligere eksperimentelle betingelser. Udfyldte sorte eller røde cirkler repræsenterer middelværdien ± SD relative ekspression (afledt af densitometrisk kvantificering af immunoblots) af enten Pakt

Ser473, c-MYC og HIF-1α på hver døgnrytmen tidspunkt; N = 3 repræsentative tumorprøver ved hvert tidspunkt. Relativ ekspression af Pakt

Ser473 repræsenterer forholdet af Pakt

Ser473 protein til total (t) AKT protein; relative ekspression af c-MYC og HIF-1α er forholdet mellem disse proteiner til tubulin og GAPDH hhv. Cosinor analyse viste robuste og meget betydelige rytmiske mønstre under LD, 12:12 forhold i tumor analytter; bortset fra c-myc, blev påvist nogen væsentlige daglige rytmiske mønstre under dim LAN (se oversigt tabel 4). Statistiske sammenligninger ikke kunne foretages mellem tilsvarende tidspunkter mellem LD, 12:12 og LAN grupper siden immunblots blev udført for de to grupper i separate kørsler. Kun en enkelt 24-timers cyklus af immunblots blev kørt og vises, mens densitometrisk repræsentation af de samme immunoblots blev vist to gange for at illustrere rytme kontinuitet som angivet i sagnet om fig. 1.

Circadian regulering og afbrydelse af tumor proliferative aktivitet

I lyset af ovenstående resultater, vi postulerede forekomsten af ​​tilsvarende døgnrytmen ændringer i tumor proliferative aktivitet og DNA-indhold. Vi fandt, at tumor [

3H] thymidin-inkorporering i DNA (fig. 2G) samt DNA-indhold (fig. 2H) steg i den lette fase kort efter lys på at nå en top to timer før lys fra. Under den mørke fase, men både [

3H] thymidin inkorporering og DNA-indhold faldt til et lavpunkt to timer før lys på (fig 2 G . H). Døgnrytmen svingninger i [

3H] thymidin inkorporering og DNA-indhold tyder på, at tumor celle nummer steg i lyset fase som følge af øget proliferativ aktivitet, mens under den mørke fase celle nummer faldt tyder på, at apoptotisk celletab foregik parallelt med nedsat celle proliferation. Vores resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser i transplanterbare mus brystkræft viser, at grove tumor størrelser og vækstrater faktisk svinger i en døgnrytmen måde i hele hver dag i perioden med netto tumorvækst [30]. Som svar på LAN, blev den daglige svingning i proliferativ aktivitet og DNA-indhold ophævet, da disse parametre forblev vedvarende forhøjede gennem den 24-timers periode (fig 2 G . H). Under døgnrytmen-regulerede vilkår, tumorvækst steget støt gennem en periode på to uger mens vækstraten i døgnrytmen-forstyrret betingelser forhøjet med to gange i løbet af de kontroller (fig. 2i).

Potentiel melatonin regulering af