PLoS ONE: Novel Epigenetisk Target Terapi for prostatakræft: en præklinisk undersøgelse

Abstrakt

Epigenetisk begivenheder er kritiske bidragydere til patogenesen af ​​kræft, og målretning epigenetiske mekanismer udgør en roman strategi i anticancer-terapi. Klassiske demethylere agenter, såsom 5-Aza-2′-deoxycytidin (Decitabin), holde potentialet for reprograming somatiske kræftceller demonstrerer høj terapeutisk virkning i blodkræftsygdomme. På den anden side, epigenetisk behandling af faste tumorer ofte giver anledning til uønskede cytotoksiske bivirkninger. Passende doseringssystemer i stand til at berige Decitabin på det sted, handling og forbedre sin biotilgængelighed ville reducere forekomsten af ​​toksicitet på sundt væv. I dette arbejde giver vi prækliniske beviser på en sikker, alsidig og effektiv målrettet epigenetisk terapi til behandling af hormon følsom (LNCaP) og hormon refraktær (DU145) prostatakræft. En hidtil ukendt Decitabin formulering, baseret på anvendelsen af ​​manipuleret erythrocyt (ERYTHRO-Magneto-hæmagglutinin Virosomer, EMHVs) lægemiddelafgivelsessystem (DDS), der bærer dette stof, er blevet forbedret. Inde i EMHVs blev stoffet afskærmet fra miljøet og phosphoryleret i sin aktive form. Romanen magnetiske EMHV DDS, udstyret med fusogene protein, forbedret stabilitet bæres narkotika og udstillet en høj effektivitet i at begrænse sin levering på virkningsstedet

in vivo

ved at anvende en ekstern statisk magnetfelt. Her viser vi, at Decitabin indlæst i EMHVs inducerer en signifikant tumormasse reduktion i prostatacancer xenograftmodeller ved en koncentration, som er syv hundrede gange lavere end den terapeutiske dosis, hvilket tyder på en forbedret farmakokinetik /farmakodynamik af lægemiddel. Disse resultater er relevante for og diskuteret i lyset af udviklingen personlige autologe terapier og innovativ klinisk tilgang til behandlingen af ​​faste tumorer

Henvisning:. Naldi I, Taranta M, Gherardini L, Pelosi G, Viglione F, Grimaldi S et al. (2014) Novel Epigenetisk Target Terapi for prostatakræft: en præklinisk undersøgelse. PLoS ONE 9 (5): e98101. doi: 10,1371 /journal.pone.0098101

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA

Modtaget: December 30, 2013; Accepteret: April 28, 2014; Udgivet: May 22, 2014

Copyright: © 2014 Naldi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) finansiering og EU-støtte til POR CREO FESR 2007-2013 BANDO UNICO R mellem 13 og 20 minutter procentdelen af ​​mobil fase B blev øget til 35%, opretholdes i 2 minutter og derefter den indledende den mobile fase blev retableret inden for 2 minutter. Massespektrometeret blev drevet i positiv elektrospraymåde og kollisionen energi var 35 eV. Overgangene overvågede var m /z 229 — 113 for 5-Aza-2′-dC; m /z 219 — 103 for guanylurea derivater; m /z 247 — 131 for formulerede derivater af 5-Aza-2′-dC. For at søge efter mulige phosphorylerede former af 5-Aza-2′-dC, 2 × 10

9 frisklavede A-EMHVs blev efterladt ved 37 ° C i 24 timer. Successivt blev prøver lyseret og filtreret som beskrevet ovenfor og 400 ng af CTP blev sat til prøverne som interne standarder. Den mobile fase bestod af 20 mM DMHA pH 7,0 (opløsningsmiddel A) og methanol-vand 80:20 (opløsningsmiddel B). De første 12 minutter var en isokratisk køre med 10% opløsningsmiddel B; mellem 12 og 15 minutter procentdelen af ​​mobil fase B blev øget til 80%, opretholdes i 1 minut og derefter den indledende den mobile fase blev retableret inden for 2 minutter. Massespektrometeret blev drevet i negativ elektrospraymåde og kollisionen energi var 15 eV. Overgangene overvågede var m /z 482 — 384 for CTP; m /z 467 — 369 for 5-Aza-2′-dC trifosfat; m /z 387 — 289 for 5-Aza-2′-dC diphosphat; m /z 307 — 208 for 5-Aza-2′-dC monophosphat svarende til eliminering af et neutralt molekyle af H

3PO

4. For kalibreringskurven blev seks forskellige CTP standardløsninger brugt. Forholdet topareal af prøve /CTP blev anvendt til kvantisering.

cytofluorimetrisk (FACS) -analyse

LNCap og DU145 celler ved en densitet på 1,5 × 10

5 blev podet i 6- brønds mikrotiterplader for cellecyklus assays. Efter 24 timer blev dyrkningsmediet udskiftet med medium indeholdende: intet lægemiddel (CTRL); gratis 5-Aza-2′-dC ved doser 6,8 ug eller 120 ng; 1,5 × 10

8 A-EMHVs (indeholdende ca. 120 ng 5-Aza-2′-dC).

Efter 24, 48 og 96 timers inkubation, kontrol og behandlede celler blev høstet og analyseret ved FACS. Kerner blev farvet med 10 pg /ml propidiumiodid (PI) i hypotonisk opløsning (1X PBS indeholdende 0,1% natriumcitrat og 0,1% Triton X-100) i 30 minutter ved 4 ° C i mørke i vurderingen af ​​cellecyklusfaser.

Apoptotiske celler blev opdaget af Annexin V-prøve (BioVision). De behandlede og ubehandlede celler blev suspenderet i 1X bindingsbuffer og inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter med Annexin V-FITC og propidiumiodid (PI) blev tilsat for kerner farvning efter producentens anvisninger.

Flow-cytometri blev udført hjælp Becton-Dickinson FACScan CentroII og data blev analyseret ved FlowJo software.

dyr

for de eksperimenter, der udføres på dyret facilitet i Marshall University, medfødte athymiske BALB /c Nude mus homozygote for

nu

/

nu

allel, blev avlet i hus. Kolonien af ​​8- til 12 uger gamle hanmus blev udviklet fra avlsdyr opnået fra Charles Rivers Laboratories (Wilmington, MA). Disse dyr blev anvendt til LNCap xenograft eksperimenter.

Dyr anvendt i forsøg udført på “Toscana Life Sciences” dyr facilitet var atymiske Nøgen-Foxn1

nu

hanmus, 6 uger, købt fra Harlan Laboratories (Udine, Italien). Disse dyr blev anvendt til DU145 implanteret.

I begge tilfælde blev dyr opstaldet i mikro-isolatorer i autoklaverede bure med polyesterfibre filter dækker, under kim-fri betingelser. Alle fødevarer, vand og strøelse blev steriliseret, og dyrene blev holdt i en omgivende temperatur på 23 ± 2 ° C i rum, der har en 12 timers lys /mørke cyklus.

X-ray imaging

athymiske BALB /c nøgne mus blev injiceret med 1,5 × 10

8 EMHVs suspenderet i 150 pi 1X PBS.

efter EMHVs haleveneinjektion blev én gruppe af dyr udsat for ydre magnetfelt ved at placere to jordarters magneter på den nederste laterale maveregionen i 30 minutter (EMHVs-MF), mens mus blev holdt under 2% isofluoran anæstesi. Neodinium magneter (rund 5,0 mm) med ca. tvangsmiddel af 1000 KOersted blev anvendt. En kontrolgruppe af mus var halevenen injiceret med EMHVs som tidligere beskrevet, men ingen ydre magnetfelt blev påført (EMHVs-NMF). En time efter behandlingen blev musene aflivet ved CO

2-kvælning og akkumuleringen af ​​jernholdige perler blev vurderet ved røntgenbilleder. Den billeddannende analyse blev udført ved hjælp af et Philips DigitalDiagnost direkte digital røntgen-system med fladskærms detektor teknologi (Philips, Hamburg, Tyskland) med en dosis på 60 kVp på 5 mAs.

Tumor xenograft procedurer

Begge athymiske BALB /c Nude og Nøgen-Foxn1

nu

mus blev bedøvet med 2,5% isofluran under manipulation

indstillingen af ​​modellerne:. LNCap eller DU145 celler blev koncentreret til 7 × 10

6 eller 4,5 × 10

6 henholdsvis i 1X PBS og injiceret subkutant 1:01 med MatrigelTM basalmembranmatrix (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) i den venstre flanke af hver mus (totalt volumen 200 ul). Når xenografter begyndte at vokse, deres størrelser (mm

3) blev målt to gange om ugen med digital skydelære og volumen blev beregnet ved hjælp af standardformlen: længde x bredde

2/2. Tumor xenotransplantater lodes vokse omtrent op til 100 mm

3 og dette volumen blev valgt som den indledende fase for begyndelsen af ​​behandlingen. Mus blev randomiseret (n = 6), bedøvet og forberedt til haleveneinjektion med den valgte behandling. Før hver injektion blev tumorer målt og sammenlignet med de tilsvarende oprindelige volumener, for at normalisere data (X = 100 x volumen

1 /volumen

0). Randomisering: Mus blev tildelt syv forskellige grupper i både eksperimentelle indstillinger (LNCap eller DU145 xenografter), og de blev behandlet som følger: 1X PBS (CTRL); 85 ug 5-Aza-2′-dC (2,5 mg /kg) (A1); 120 ng 5-Aza-2′-dC (A2); 1,5 × 10

8 losses EMHVs i fravær af statiske magnetfelt (EMHVs-NMF); 1,5 × 10

8 losses EMHVs og statiske magnetfelt anvendt på tumor (EMHVs-MF); 1,5 × 10

8 EMHVs indeholdende 120 ng 5-Aza-2′-dC (A-EMHVs-NMF); 1,5 × 10

8 EMHVs indeholdende 120 ng 5-Aza-2′-dC og statiske magnetfelt anvendt på tumor (A-EMHVs-MF)

Injektion protokol:. Musene blev hver anden uge indgivet intravenøst ​​med 150 pi behandling per podning, over 3 uger. Efter hver injektion i disse grupper udvalgt til at være også behandles med statiske magnetfelt (EMHVs-MF og A-EMHVs-MF) blev to jordarters magneter (1.000 KOersted) påføres xenograft massen i 30 minutter for at sikre intra-tumor akkumulering. Mus blev derefter lov udvinding og overvåges for tegn på lidelse. Ved afslutningen af ​​behandlingsforløbet, eller når tumorvolumenet nåede ca. 400 mm

3, blev musene aflivet ved CO

2-kvælning og prostata tumormassen, lever, nyrer blev høstet og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere analyse.

Morfologisk og immunhistokemisk analyse af tumorxenoplantater

Frosne prøver opbevaret ved -80 ° C var i ligevægt ved -20 ° C natten over, inden sektionering ved kryostat (uM HM 500 W) efter indlejring i OCT.

Konsekutive serielle snit af frosset 5-6 um tykkelse blev opnået fra midten (største) portion af hver prøver, som er tilføjet på positivt ladede objektglas, tørres i luft i nogle få minutter og derefter fikseret med kold acetone . To-fire snit blev farvet med Mayers hematoxylin for histopatologisk undersøgelse.

Efter vask i 1X PBS og inkubering i H

2O

2 ved stuetemperatur for at blokere endogen peroxidase, afsnittet blev inkuberet med fortyndet normal blokerende serum fremstillet ud fra de arter, hvor det sekundære antistof er lavet. Slides blev inkuberet i fugtigt kammer natten over ved 4 ° C med primære humane reaktive antistoffer for Ki67 (klon SP6, kanin monoklonalt antistof Thermoscientific) ved en fortynding 1:200 og DNMT3b (klon 52A1018, monoklonalt muse-antistof, IMGENEX) ved fortynding 1 :150. Efter 30 min sekundært biotinyleret antistof og 30 min Vectastain Elite ABC reagens Objektglassene blev derefter inkubering med peroxidasesubstrat opløsning (DAB). Objektglas blev modfarvet med Mayers hematoxylin i 1 min, og monteret i vandig Mount Quick (Bioptica). Mikroskopisk undersøgelse blev udført fra 2x til 40x forstørrelse under et Olympus BX43 lysmikroskop grænseflader til et videokamera til digital erhvervelse og billedbehandling analyse (DP20 Olympus). Værdierne af DNMT3b og Ki67 positive kerner blev udtrykt i procent af positive eller negative celler over optælling mindst 500 totale celler på 20x oprindelig forstørrelse.

Statistisk analyse

cellecyklus faser udtrykkes som middelværdi ± SD af mindst n = 3. Tre-Ways ANOVA blev anvendt til at sammenligne effekten af ​​forskellige behandlinger (CTRL, 6,8 ug 5-Aza-2′-dC, 120 ng 5-Aza-2′-dC 1.5 × 10

8 A-EMHVs) på cellecyklusfaser (sub G1, G0-G1, S, G2-M) og One-Way ANOVA blev anvendt til at sammenligne effekten af ​​A-EMHVs behandling på udvalgte tidspunkter (24 , 48 og 96 timer).

De apoptotiske celler blev udtrykt som gennemsnit ± SEM af mindst n = 3. Statistisk analyse blev udført med One-Way ANOVA uafhængigt for tidlig og sen apoptose på log transformerede data til at forbedre normalisering. Parvise sammenligninger blev testet under anvendelse Tukeys ærligt signifikant forskel kriterium.

in vivo

Resultaterne er udtrykt som middelværdi ± SEM af n = 6. One-Way ANOVA blev anvendt til at sammenligne massen tumorreduktion i evalueringen af ​​xenograft implantat efter valgte behandling ved hjælp af data indsamlet på den sidste injektion. At beskrive tumor masse reduktion sats (50%) i mus efter udvalgte behandlinger, blev Kaplan-Meier analyse anvendes efterfulgt af log-rank test.

Etik udsagn

Humane røde blodlegemer blev opnået fra transfusion poser indsamlet fra anonyme sunde frivillige donorer, der har givet deres skriftligt informeret samtykke udføres i overensstemmelse med italienske regering lov. Det var ikke nødvendigt godkendelsen fra en institutionel Review Board (etiske udvalg), da ingen direkte menneskelig deltagelse eller inddragelse af humane undersøgelser have været forudset i dette arbejde. Prøver er blevet leveret af Azienda Ospedaliera Universitaria Senese.

Den prækliniske undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr i de internationale retningslinjer for håndtering af forsøgsdyr og anvende 3R til forsøg (i overensstemmelse med NIH og Europa-Kommissionens henstillinger)

de protokoller for dyreforsøg blev godkendt af den etiske komité for Marshall University (Huntington, WV, USA) (Tilladelse nummer:. # 458 /2010) og af de etiske komitéer i Toscana biovidenskab og Istituto Superiore di Sanità (ISS) på vegne af italienske sundhedsminister (Permit Nummer: # CNR-270111 exp1 /PROT1). Animal velvære blev overvåget i overensstemmelse hermed til Langford et al, 2010. [36] “

Resultater

Karakterisering af nye anticancer formulering i erythrocyt-baserede lægemiddelafgivelsessystem

Til øge effektiviteten profil af 5-aza-2′-dC pro-drug, med hensyn til kemisk stabilitet, farmakokinetik og farmakodynamik, manipuleret magnetiske erythrocytter bærere (EMHVs) blev anvendt som lægemiddelafgivelsessystem (DDS). kinetik EMHV DDS internalisering og dets toksicitet samt effektiviteten og effekten af ​​denne roman anticancer 5-Aza-2′-dC formulering blev testet første

in vitro

i hormon følsom (LNCaP) og resistente (DU145) prostata kræftceller.

internalisering af EMHVs luftfartsselskab i tumor celle

in vitro

.

kinetiske af EMHVs internalisering i både LNCap og DU145 prostatacancerceller blev bekræftet af Konfokal Laser Scanning Microscopy analyse ( CSLM) ved at overvåge fordelingen af ​​frigjorte fluorescerende NP’er (grøn) ind i cytoplasmaet af målceller (fig. 1). Et eksempel på DU145 naive celler er vist i fig. 1A. Internalisering er allerede finder sted på 6 timer efter behandling, når EMHVs blev fundet inde i cytoplasma DU145 celler. På dette stadium EMHVs stadig bevare deres intakte membran og deres indhold af NP’er (fig. 1B). I lighed med hvad der findes i vores tidligere arbejde [33], efter internalisering af EMHV membranen sikringer med membran af værtscellen frigiver den fluorescerende indhold i hele cytoplasmatiske rum (fig. 1C-E). Senest tidspunkter (48-96 timer) en bred spredning fluorescens af nationale parlamenter kan påvises i cytoplasmaet selvom værtsceller synes morfologisk sunde og ingen cytotoksisk virkning er synlig (fig. 1D-E).

repræsentant CLSM billeder af EMHVs internalisering og frigivet nanopartikel distribution (grøn fluorescens signal, B-E) i værtscellens cytoplasma på flere tidspunkter er afbildet. Naive celler (A) er rapporteret som kontrol. I (B), efter 6 timers behandling, en intakt EMHV er til stede i cytoplasmaet (pil). Efter 24 timer (C) viste, at partiklerne er blevet løsladt fra EMHVs. I de billeder taget ved 48 (D) og 96 (E) timer, nanopartikler tilsyneladende homogent fordelt i hele cytoplasmaet. Mangel på toksiske effekt af erythrocyt lægemiddeltilførselssystem behandling blev vurderet ved FACS-analyse (F), hvor celle profil af de behandlede celler (EMHVs) på udvalgte tidspunkter viser ingen signifikante ændringer i sub-fase fordelinger i forhold til kontrol (CTRL).

Manglende toksicitet EMHV luftfartsselskaber på celle-modeller.

toksiciteten af ​​EMHV DDS mod værtsceller blev vurderet ved at analysere cellecyklus faser af målceller. Ved behandling med ubelastede EMHVs i 48 og 96 timer, ingen skift i LNCaP og DU145 celle fasefordeling var detekterbar og celler bevarede deres normale cellecyklus for varigheden af ​​behandlingen (fig. 1F). Dette fund tyder på, at EMHVs lægemiddelafgivelsessystem ikke udøve nogen toksisk virkning på kræftceller i sig selv.

Kemisk stabilitet af 5-Aza-2′-dC i EMHV bioreaktor-system (A-EMHVs).

5-Aza-2′-dC er et pro-drug, og det kræver at blive aktiveret ved phosphorylering til et nucleosidtriphosphat før udøve inhibering på DNA-methylering [37].

for nylig er det blevet vist, at erythrocytter fungere som bioreaktorer på grund af deres enzymatiske systemer [34]. Dette gør dem egnede til indkapsling af prolægemidler, der efterfølgende omdannes til det aktive lægemiddel [38]. Loading 5-Aza-2′-dC pro-lægemiddel i EMHV bioreaktor system blev opnået ifølge en standardiseret protokol (se materialer og metoder). HPLC-MS blev anvendt til at bestemme den samlede mængde lægemiddel inde i DDS (A-EMHVs) og at detektere tilstedeværelsen af ​​dens aktive phosphorylerede former. Kromatogrammet af prøver inkuberet i 24 timer ved 37 ° C fremhævet en blanding af forskellige phosphorylerede former af 5-Aza2′-dC (fig. 2). Di- og tri-phosphat former af phosphoryleret 5-Aza2′-dC eluerer ved RT 16,6 og RT 16.5 (fig. 2B og 2C). Figur 2D viser toppen af ​​cytidin thriphosphate (CTP, RT: 16,5), en intern standard, som vi tilføjet til vores prøver som kontrol. Det fremgår, at tri-fosfat form af 5-Aza2′-dC overbears de andre phosphorylerede former beviser den høje effektivitet af EMHVs som bioreaktorer. Vi fandt, at 1,5 × 10

8 A-EMHVs rumme ca. 120 ng af den samlede lægemiddel og at de aktive phosphorylerede former af 5-aza-2′-dC repræsenterer 50% af den samlede loaded medikament ind i A-EMHVs.

(A) kromatogrammer for 5-aza-2′-dC mono-phosphat; (B) di-phosphat (RT: 16,6); (C) tri-fosfat (RT: 16,5) og (D) intern standard CTP (RT: 16,5).

Den anti proliferative aktivitet af A-EMHVs

in vitro

.

antiproliferativ virkning af A-EMHV til at inducere cellecyklus og apoptose blev testet i både prostatacancer modeller: hormon følsomme LNCaP-celler og androgenuafhængige prostatacancer DU145-cellelinje hvor traditionelle behandlingsformer hæmmet af manglende lydhørhed over for hormonbehandling og PSA antigen udtryk på cellemembranen.

effekten af ​​1,5 × 10

8 A-EMHVs behandling, som indeholder ca. 120 ng interne 5-Aza2′-dC, har været sammenlignet med den for fri 5-Aza-2′-dC anvendes i en dosis på 2,5 pM (i alt 6,8 ug) skaleret ned fra den terapeutiske dosis, der anvendes i klinikker. Vi sammenlignede også virkningen af ​​den samme mængde 5-Aza-2′-dC anvendes som frit lægemiddel opløsning indeholdt inde i A-EMHVs (120 ng).

På hormon-responsive LNCaP-celler (fig. 3A) , a-EMHVs behandling inducerede betydelig berigelse i sub G1 antyder en mulig aktivering af apoptotisk respons (fig. 3A). Dette skift var allerede påvises ved 48 timer efter behandling (fig 3A midterste panel.) Og nåede statistisk signifikans ved 96 timer (ANOVA p 0,05). En lignende skift i retning sub G1 fordeling opnåedes også ved hjælp af 6,8 ug af fri 5-Aza-2′-dC (ANOVA p 0,05), men denne dosis er mere end 50 gange højere end de 5-aza-2′-dC loaded i A-EMHVs. Endvidere er virkningen på 6,8 ug fri 5-Aza-2′-dC behandling synes at have en senere indtræden sammenligne til A-EMHVs. Dette skyldes sandsynligvis det faktum, at 5-aza-2′-dC, indkapslet i EMHVs let omdannes til dephosphorylerede former forbedring 5-Aza-2′-dC farmakokinetik /farmakodynamik. Især lave doser af gratis 5-Aza-2′-dC (120 ng) ikke udøve sub G1 shift effekt og cellecyklus fordelingen profil adskilte sig ikke fra kontrol op til 96 timer.

1,5 × 10

8 A-EMHVs behandling, indeholdende 120 ng interne 5-Aza-2′-dC, blev sammenlignet med 6,8 ​​pg gratis 5-Aza-2′-dC og 120 ng gratis 5-Aza-2′-dC behandlinger ved 24 (top) 48 (midten) 96 (nederst) timer. Ubehandlede celler blev anvendt som kontrol (CTRL). I begge LNCap (A) og DU145 (B) cellelinjer, A-EMHVs behandling inducerede betydelig berigelse i sub G1 celle distribution (sorte søjler) allerede påviselige ved 48 timer efter behandling (A og B midterste panel, henholdsvis), der varer i op til 96 timer (* ANOVA p 0,05). Tilsvarende skift mod sub G1 fordeling blev også opnået under anvendelse af 6,8 ug af fri 5-Aza-2′-dC (§ANOVA p 0,05), men kun detekteres ved 96 timer. Ingen skift i cellecyklusfordeling blev opdaget gratis 120 ng 5-Aza-2′-dC, ikke afviger fra kontroller.

En lignende tendens til sub G1 fasen blev beskrevet i hormon resistent DU145-cellelinje