PLoS ONE: Hæmning af Autophagic Flux af salinomycin Resultater i Anti-Cancer Effekt i hepatocellulært carcinom Cells

Abstrakt

Salinomycin hævet håb at være effektive i anti-cancer behandlinger på grund af sin evne til at overvinde apoptose-modstand i flere typer af kræftceller. For nylig, dens effektivitet mod human hepatocellulært carcinom (HCC) celler både

in vitro

in vivo

blev demonstreret. Men virkningsmekanismen forblev uklart. Nyeste undersøgelser impliceret interferens med nedbrydningsvej af autofagi. Denne undersøgelse havde til formål at fastslå virkningen af ​​Salinomycin på HCC-autofagi og om primære humane hepatocytter (PHH) ligeledes er berørt. Efter eksponering af HCC cellelinier HepG2 og Huh7 til varierende koncentrationer af salinomycin (0-10 uM), omfattende analyse af autophagic aktivitet under anvendelse af western-blotting og flow-cytometri blev udført. Drug effekter blev analyseret i indstillingerne for autophagy stimulation ved sult eller PP242-behandling og korreleret med cellernes levedygtighed, formering, apoptose induktion, mitokondriemasse ophobning og reaktive ilt arter (ROS) dannelse. Påvirkning af apoptose induktion og celle funktion af PHH blev analyseret.

konstituerende og stimuleret autophagic aktiviteter begge blev effektivt undertrykt i HCC af salinomycin. Denne inhibering var forbundet med dysfunktionel mitokondrier akkumulering, øget apoptose og nedsat proliferation og cellelevedygtighed. Effekter af Salinomycin var dosis og tidsafhængig og kunne let blive gentaget af farmakologisk og genetisk hæmning af HCC-autofagi alene. Salinomycin eksponering for PHH resulterede i forbigående nedsat syntese funktion og cellelevedygtighed uden apoptose induktion. Som konklusion vore data antyder, at salinomycin undertrykker sene stadier af HCC-autofagi, hvilket fører til forringet genanvendelse og akkumulering af dysfunktionel mitokondrier med forøget ROS-produktion som alle er forbundet med induktion af apoptose

Henvisning:. Klose J , Stankov MV, Kleine M, Ramackers W, Panayotova-Dimitrova D, Jäger MD, et al. (2014) Hæmning af Autophagic Flux af salinomycin Resultater i Anti-cancer effekt i leverkræft Cells. PLoS ONE 9 (5): e95970. doi: 10,1371 /journal.pone.0095970

Redaktør: Manlio Vinciguerra, University College London, England

Modtaget: 10. januar, 2014 Accepteret: April 1, 2014; Udgivet: 9. maj 2014

Copyright: © 2014 Klose et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Heidelberger Stiftung Chirurgie og Gesellschaft der Freunde für Chirurgie (JK), KFO 250 (GB, MVS), Rebirth EXC 62/1 (GB), og Else Kröner-Fresenius-Stiftung (FWRV, 2010_A49). Forfatterne anerkender økonomisk støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft og Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg i finansieringen programmet Open Access Publishing. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

salinomycin (Sal) er en polyether antibiotika udbredt som anticoccidialt i fjerkræ [1] og kosttilskud i drøvtyggere ‘og svin’ race [2], [3] på grund af sin antimikrobielle aktivitet. For nylig har potentiale Sal som et anti-cancermiddel blevet belyst [4]. Gupta et al. demonstrerede en mere end 100-fold effektivitet Sal sammenlignet med paclitaxel til at dræbe brystkræft stamceller i mus [5]. Senere blev effekten af ​​Sal mod tumorceller bekræftet i flere cancercellelinier fra forskellig oprindelse, herunder faste og ikke-faste maligniteter [6] – [9]. Sal repræsenterer også en lovende kandidat til behandling af hepatobiliære maligniteter som demonstreret for HCC

I

vitro og

in vivo

[10]. Vi har også vist for nylig, at Sal er muligt at bryde apoptose-resistens i human cholangiocarcinom (CC) celler [11]. Alligevel den præcise virkningsmekanisme Sal som et anti-cancer middel er stadig uklar. Der er blevet foreslået adskillige mekanismer såsom blokerende Vingeløse-type (Wnt) /β-catenin pathway [12] eller aktivering af de konventionelle caspase drevne apoptotiske veje [13]. Sidst blev en ny mekanisme ansvarlig for anti-cancer virkning Sal involverer medikament-medieret ændring af cancercelle autophagic aktivitet foreslået. Autophagy er et genbrug vej for bevarede proteiner, organeller eller cellulære skader. I tumorceller antages autofagi at fremme overlevelse. Afhængigt af eksperimentelle system, enten inhibering [14] eller aktivering [15] – [17] af Sal af denne cellulære nedbrydningsvej er rapporteret

Således Formålet med denne undersøgelse var at kontrollere anti-cancer. egenskaber af Sal om HCC og at belyse dens virkning på pro-overlevelse mekanisme autofagi af disse cancerceller. Da pro-apoptotiske virkninger af Sal er blevet foreslået at spare godartede celler [9], vi yderligere var interesserede i dens indvirkning på primære humane hepatocytter (PHH). Vi har vist, at salinomycin synes at undertrykke sene stadier af HCC-autofagi, hvilket fører til forringet genanvendelse og akkumulering af dysfunktionelle mitokondrier med forøget ROS-produktion og induktion af apoptose. Desuden blev en midlertidig reduktion af celle funktion i PHH efter udsættelse for Salinomycin demonstreret.

Materialer og Metoder

Salinomycin

Sal blev købt fra Sigma-Aldrich og opløst i DMSO . Stamopløsninger blev opbevaret ved -20 ° C. Drug koncentrationer i intervallet lignende

in vitro

eksperimenter [10], [11], [14].

Hepatocyt isolation

Isolering af primære humane hepatocytter (PHH ) blev udført med 2-trins collagenase perfusion teknik som tidligere rapporteret [18] (se supplerende oplysninger). Alle vævsdonorer gav skriftligt informeret samtykke til eksperimenterende brug af leveren prøven. Protokollen blev godkendt af den etiske kommission Hannover Medical School.

Cell kultur

menneskelige HCC cellelinier HepG2 (American Type Culture Collection (ATCC), ordrenummer HB-8065) ​​og Huh7 [ ,,,0],19] blev dyrket i DMEM (PAA) suppleret med 10% FCS, penicillin (50 U /ml) og streptomycin (50 mg /l) (Invitrogen). Medium blev ændret hver 48 h. For autophagy undersøgelser begge cellelinier blev opretholdt i suppleret ATCC-formuleret EMEM som tidligere beskrevet [20]. Etablerede inhibitorer og aktivatorer af autophagy blev brugt i koncentrationer, der tidligere er rapporteret i analoge

in vitro

eksperimenter: 3 MA (0,4-10 mM), LY294002 (0,8-20 uM), vinblastin (0,5-10 uM), nocodazol (0,5-10 uM), PP242 (5 uM), chloroquin (CQ) (5-100 uM) og ammoniumchlorid (ACH) (1-20 mM) [21]. Fysiologisk induktion af autofagi er blevet udført under anvendelse af HBSS indeholdende 6 mM glucose (sult medium)

Frisk isolerede PHH med en levedygtighed på . 90% blev podet på collagen-coatede 6- og 96-brønds plader med 1,5 og 0,05 × 10

6 levedygtige celler /brønd, henholdsvis og dyrket under anvendelse af Williams ‘Medium E som tidligere beskrevet [18]. Efter udsættelse for varierende koncentrationer af Sal (0-10 uM) for 24/48 timer, de blev yderligere dyrket med normalt medium i yderligere 5 dage. Medium blev ændret dagligt. Supernatanter og vedhæftende celler blev indsamlet til analyse på dagen 1/3/5.

Cell levedygtighed

PHH og menneskelige HCC celler blev undersøgt for

in vitro

celle levedygtighed ved CellTiter 96AQueous One Solution celleproliferationsassay (Promega) som beskrevet tidligere [18]. Endvidere celledød også blev analyseret under anvendelse propidiumiodite (PI) udelukkelse assay og flow-cytometri. Alternativt apoptose blev analyseret ved hjælp af ændringer i cellulær FSC versus SSC-punktdiagram som tidligere beskrevet [20].

spredning assay

HepG2 og Huh7 celler blev dyrket ved 1 × 10

3 /brønd i medium alene eller med 1-10 pM Sal i 96-brønds plader i 24 timer. I de sidste 16 timer af kultur-celler blev pulseret med 1 uCi

3H-thymidin og inkorporering detekteres af en β-tæller som tidligere beskrevet [11].

Annexin-V analyseres

HepG2 og Huh7-celler blev analyseret for apoptose induktion efter eksponering for 1-10 uM Sal i 24 timer anvendelse af Annexin-V apoptose afsløring kit (BD Biosciences) ifølge producentens instruktioner som tidligere beskrevet [11].

Konstruktioner og retroviral infektion

plasmider pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B og pBABEpuro GFP-LC3 (N # 22418 og 22405), manipuleret af Jayanta Debnath [21], blev opnået fra Addgene. Celle transduktion og selektion blev udført som tidligere beskrevet [20], [22]. Genetisk hæmning af autofagi blev opnået ved hjælp af

ATG7

shRNA-medieret banke ned (Santa Cruz). Uspecifik shRNA (kontrol) samt copGFP blev påført i overensstemmelse med producentens instruktioner (Santa Cruz). Transduktion blev udført ved anvendelse lentivirale partikler med op til fem særskilte ekspressionskonstruktioner som beskrevet andetsteds [20]. Transduktionseffektivitet blev kvantificeret ved antallet af GFP-positive celler og generelt oversteg 94% ved udgangen af ​​puromycinselektion.

Analyse af salinomycin-medierede virkninger på HCC autophagic aktivitet Salg

Autophagic rum ( præ-autophagosomes, autophagosomes og autophago-lysosomer) repræsenterer mellemliggende komponenter i en dynamisk nedbrydningsproces, og deres samlede beløb på et bestemt tidspunkt er bestemt af dynamikken i deres skabelse og nedbrydning [23]. Vi har udført undersøgelser, der måler autophagic flux ifølge de seneste retningslinjer [23]. Autophagic flux refererer til hele processen med autofagi herunder last levering og efterfølgende autolysosomal nedbrydning. Måling af autophagic flux tillader forskelsbehandling mellem induktion og sen hæmning af autophagosome modning som begge er kendetegnet med en øget tilstedeværelse af autophagosomes [23], [24]. Omdannelse af GFP-LC3-I til GFP-LC3-II blev bestemt ved western blotting under anvendelse af anti-LC-3B-antistof (Sigma-Aldrich) [23]. Autophagic flux blev vurderet som ophobning af ikke-nedbrudt GFP-LC3-II efter blokering autophagosomal nedbrydning ved hjælp af ACH. Densitometri LC3-II bånd blev udført ved hjælp LabImage1D Software (Kapelan Bio-Imaging Solutions) og normaliseret til den optiske densitet (OD) af actin [24]. Desuden blev autophagic flux i HCC-cellelinier analyseret ved påvisning af ændringer i totalt cellulært GFP-LC3 eller mCherry-GFP-LC3 signal under anvendelse af flow-cytometri som beskrevet tidligere [20]. Kort fortalt, øget autophagic flux svarer til en progressiv afgivelse af GFP-LC3 at autolysosomes for nedbrydning og signal forsvinden. Desuden hæmmede autophagic flux udmønter sig i reduceret GFP-LC3 forsvinden og på grund af den konstitutive cellulære produktion registreres som en øget total cellulær signal [20]. Analyse blev foretaget på LSR-II (BD Biosciences). Autophagic flux også blev bestemt under anvendelse Cyto-ID Autophagy Detection Kit (Enzo Life Sciences) ifølge producentens instruktioner som tidligere beskrevet [25]. Dette assay er baseret på et specifikt farvestof, der selektivt farver autophagic rum. Autophagic flux således kvantificeres som ophobning af autophagic rum i grundlæggende eller aktiverede betingelser (HBSS- eller PP242-inkubation) efter blokering af autophagolysosomal nedbrydning af CQ eller ACH. Det beregnes ved at subtrahere Cyto-ID MFI værdien af ​​prøven uden CQ /ACH fra Cyto-ID MFI værdien af ​​prøven med CK /ACH for hver betingelse efter formlen: ΔMFI Cyto-ID = MFI Cyto-ID (+ CQ /ACH) -. MFI Cyto-ID (-CQ /ACH)

mitokondriemasse

mitokondriemasse blev bestemt ved flow-cytometri under anvendelse MitoTracker Green FM (MTR grøn) farvning i overensstemmelse med producentens instruktioner (Molecular Probes) som tidligere beskrevet [26].

Reaktive oxygenarter (ROS)

ROS blev bestemt ved flow-cytometri anvende 5- (and-6) -chlormethyl-2 ‘ , 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat, acetyl ester (CM-H2DCFDA) farvning ifølge producentens instruktioner (Invitrogen) som tidligere beskrevet [20].

aspartat-aminotransferase lækage og ureadannelse

som måle for graden af ​​celleskader aktiviteten af ​​aspartat-aminotransferase (AST) blev bestemt for PhH kulturer. Endvidere blev ureadannelse som indikator for cellefunktion undersøgt. Begge parametre blev påvist i kultursupernatanter ved standardiserede enzymaktivitetsassays (Roche Molecular Diagnostics) udført af den centrale laboratorium Hannover Medical School.

Albumin syntese

Syntesen af ​​albumin ved PHH blev vurderet ved hjælp af human Albumin ELISA Kvantificering Set (Bethyl Laboratories) som tidligere beskrevet [27].

In vitro

morfologi

morfologi PHH knyttet til kollagen-plader behandlet med /uden Sal blev vurderet dagligt i hele kultur periode ved hjælp af fase-kontrast mikroskopi.

Immunofluorescens

PHH blev dyrket på collagen-coatede kammer slides på 5 × 10

4 celler /kammer. Efter 24 h inkubation med varierende koncentrationer af Sal (0-10 uM) eller Fas-ligand (FasL) som en positiv kontrol (1 ug /ml), farvning for apoptose blev udført ved anvendelse af M30 Cytodeath kit (TECOmedical GmbH) i overensstemmelse med producentens instruktioner.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS 20.0 og GraphPadPrism 4. Mann-Whitney-U-test, studerendes t-test og ANOVA med Dunnett post-hoc analyse var anvendt som passende. Forskelle blev betragtet statistisk signifikant med p 0,05. Resultaterne blev udtrykt som gennemsnit ± SD af mindst tre uafhængige forsøg.

Resultater

Udsættelse for Salinomycin reducerer cellernes levedygtighed og spredning af HCC celler betydeligt ved induktion af apoptose

Til bekræfte anti-cancer effekt af Sal på humane HCC-celler, undersøgte vi cellelevedygtighed efter narkotika-behandling. Til dette blev HepG2 og Huh7-celler udsat for stigende koncentrationer af Sal (1-10 uM) i 24 timer efterfulgt af analyse ved anvendelse af MTS-assayet. Tumor cellelevedygtighed faktisk blev reduceret signifikant ved lægemiddelkoncentrationer over 2 pM Sal (fig. 1A). Dernæst indvirkning på celleproliferation af HCC-celler blev bestemt ved

3H-thymidin-inkorporering efter 24 h inkubation med midlet. Som vist i figur 1B, blev celleproliferation væsentligt forringet i begge cellelinier i en dosisafhængig måde. Denne effekt var detekterbar efter udsættelse for et ret beskedent dosis på 2 uM Sal. Højere medikamentkoncentrationer næsten helt formindsket proliferation af humane HCC-celler. Salg

HepG2 og Huh7 celler blev udsat for stigende koncentrationer af salinomycin (1, 2, 5 og 10 uM) i 24 timer. (A) Cellelevedygtighed blev vurderet ved MTS-assay; høje koncentrationer af salinomycin medførte signifikant nedsat levedygtighed begge cellelinier (n = 5). (B) HCC-celler afslørede signifikant reduceret proliferation efter udsættelse for salinomycin som demonstreret ved nedsat

3H-thymidin-optagelse. (C) Lave koncentrationer af salinomycin (venstre panel, optrukket linje) førte til en svag stigning af apoptotiske celler sammenlignet med ubehandlede celler (stiplet linje i overlay). Høje koncentrationer markant induceret apoptose (højre panel, optrukket linje). Resultaterne er vist som repræsentative scatter-gram af Annexin-V

+ – celler eller sammenfattes som middelværdi ± SD af n = 4 uafhængige forsøg (D). * P 0,05, ** p. 0,01

Vi analyserede yderligere, hvorvidt Sal induceret apoptose i disse cellelinjer. Som vist i figur 1C + D, observerede vi en dosisafhængig forøgelse af Annexin-V

+ -celler efter udsættelse for Sal i HepG2-celler. I Huh7-celler blev fundet signifikant apoptose induktion ved Sal koncentrationer i eller over 2 uM. Induktion af apoptose af Sal var mere effektiv i HepG2 end i Huh7 celler (25,3% vs. 14,3%).

Salinomycin hæmmer autophagic flux og fører til autophagic substrat ophobning

For at vurdere effekten af Sal på autophagy i HCC-celler blev celler dyrket i nærvær eller fravær af 10 uM Sal i 15 timer med og uden ACH for den sidste 1 time. Semikvantitativ western blot analyse viste Sal-inducerede stigning i LC3-II (fig. 2A), hvilket taler imod en Sal-medieret inhibering af tidlige stadier af autophagosomal formation. I stedet kan det svare til enten forøget autophagosome generation på grund af øget autophagic aktivitet eller undertrykt autophagosome modning [23]. For at løse dette spørgsmål og vurdere autophagic flux ved western blot vi anslået akkumuleringen af ​​LC3-II band efter ACH-medieret blokering af autophagolysosomal nedbrydning. Akkumulering af LC3-II bånd blev beregnet ved at trække densitometrisk intensitet af prøven uden ACH fra prøven med ACH for hver betingelse (kontrol 3,6-1,0 = 2,6; Sal 3,7-1,6 = 2,1). Nedsat akkumulering af LC3-II-båndet efter tilsætning af ACH i Sal-behandlede kulturer (2.6 2.1) foreslog lægemiddel-medieret undertrykkelse af autophagic flux (figur 2A.). En tilsvarende reduktion i autophagic flux blev detekteret som følge af vinblastine- og nocodazol-medieret suppression af autophagosome modning (

data ikke vist

).

HepG2 og Huh7 celler blev udsat for forskellige koncentrationer af salinomycin (0,5, 2 og 8 uM) for forskellige tidspunkter og analyseret for aktivitet af autofagi. (A) Immunoblotanalyse af LC3-I og LC3-II-isoformer (op) med densitometri kvantitativ analyse (ned) i HepG2-celler afslørede Sal-induceret LC3-II-akkumulering grund af hæmning af autophagic flux som demonstreret ved reduceret LC3-II Akkumulerende efter tilsætning af ACH. (B) Basic og PP242-aktiverede autophagic flux i Huh7 celler (sorte søjler). Behandling med autophagy hæmmere 3mA (2 og 10 mM), ACH (5 og 20 mM) eller CQ (5, 20 uM) i 24 timer modvirker PP242 aktivering af autophagic flux. (C) Inhibering af autophagic flux i Huh7 celler efter shRNA-medieret knockdown af ATG7. (D + E) Nedsat akkumulering af autophagic rum efter blokering af autophagolysosomal nedbrydning med ACH indikerer reduceret autophagic flux i HepG2 (D) og Huh7 (E) celler behandlet med Sall i 24 timer. Ved siden af ​​baren grafer repræsentative histogrammer er afbildet. Alle forsøg er vist som middelværdi ± SD af n = 3 uafhængige forsøg * p. 0,05; ** P 0,01, *** p. 0,001

Før vi kunne vurdere virkningen af ​​Sal på HCC autophagic flux, vi valideret flowcytometrisk overvågning af intracellulær omsætning autophagic rum i HCC celler [25], [28]. Autophagy aktivering med PP242 førte til en klar stigning i autophagic flux (Fig. 2B). Tilsætning af autophagy inhibitorer, såsom 3-MA, ACH eller CQ resulterede i et fald af autophagic flux. Lignende resultater blev opnået under anvendelse rapamycin eller sult (

data ikke vist

) og bekræftede anvendeligheden af ​​assayet i HCC-celler. Til sidst udelukke pleiotropiske effekter fra de farmakologiske hæmmere, vi verificerede autophagic flux måling ved Cyto-ID ved hjælp autofagi-specifikke shRNA-medieret knockdown af

ATG7

(Fig. 2C).

Dernæst vi ønskede at vurdere effekten af ​​Sal på HCC s autophagic flux. HepG2-celler blev dyrket i nærvær af Sal (0,5, 2 og 8 uM) i 24 timer og sammenlignet med ubehandlede celler. Sal mærkbart reducerede autophagic flux tids- og dosisafhængigt, selv når autofagi blev induceret ved PP242 (fig. 2D). Lignende resultater blev observeret ved hjælp HUH7 celler (Fig. 2E) og alternativ aktivering ved rapamycin eller sult (

data ikke vist

).

Endelig har vi anvendt overvågning af intracellulær LC3-omsætning [22] . Til dette brugte vi HepG2-celler stabilt udtrykker LC3-GFP. Inkubation med 3 MA (2 og 10 mM), LY (2 og 10 mM), nocodazol (2 og 10 uM) eller ACH (0,8 og 4 mM) i 7 timer fører til akkumulering af GFP-LC3 signal, som forventet (fig . 3A). Sult øgede autophagic flux som påvist ved nedsat LC3-GFP signal i kontrol- celler, hvilket indikerer mere nedbrydning (fig. 3A), en effekt, der blev tabt, når farmakologiske autofagi hæmmere var til stede (fig. 3A). Næste HepG2 celler konstitutivt udtrykker LC3-GFP-fusionsproteinet blev dyrket med og uden Sal i 24 timer. Sal inhiberede mærkbart den autophagic flux som påvist ved akkumulation af totalt cellulært LC3-GFP signal (fig. 3B). Igen, Sal virkninger på autophagic flux var tids- og dosisafhængig og let mærkbar ved koncentrationer tidligere er rapporteret til at udøve anti-cancer effekter [10]. Undertrykkelse af autophagy er blevet forbundet med dysfunktionel mitokondrier akkumulering med øget produktion af ROS [29], [30], som kan udløse apoptose [29] – [32]. Således har vi analyseret, om Sal behandling blev ledsaget af ophobning af mitokondriemasse. Faktisk vores resultater bekræftede en dosisafhængig akkumulering af mitokondriemasse (fig. 3C). Desuden akkumulerede mitokondrier viste tegn på dysfunktion som påvist ved en øget tilstedeværelse af ROS produktion (fig. 3D). Vigtigere, farmakologisk og genetisk inhibering af autofagi i HCC-celler fuldstændigt gentog Sal virkninger på dysfunktionel mitokondrier akkumulering, ROS produktion og cellelevedygtighed. Baseret på dette konkluderer vi, at Sal virkninger på HCC-celler i det mindste delvis kan medieres gennem dets evne til at undertrykke autophagic flux (se File S1 og fig. S1).

(A) Inhibering af basis- og HBSS-aktiveret autophagic flux i HepG2-celler stabilt udtrykker LC3-GFP behandlet med 3 MA (2 og 10 mM), LY (2 og 10 mM), nocodazol (2 og 10 uM) eller ACH (0,8 og 4 mM) i 7 timer. (B) Inhibering af autophagic flux i HepG2 celler behandlet med Sal (0,5, 2 og 8 uM) i 24 timer (venstre) med repræsentative histogrammer (højre). (C) Flow-cytometri af total mitokondriemasse hjælp MitoTracker Green (MTR grøn) afslører ophobning af dysfunktionelle mitokondrier. (D) Bevis for øget ROS-produktion ved hjælp af CM-H2DCFDA (til venstre) med repræsentative histogrammer (til højre). Alle forsøg er vist som middelværdi ± SD af n = 3 uafhængige eksperimenter. * P 0,05, ** p 0,01

Eksponering af PHH til salinomycin resulterer i forbigående reduktion af celle funktion og

in vitro

morfologi, men fører ikke til apoptose

Baseret på rapporter om, at Sal udviser anti-cancer virkninger mod tumorceller, men forårsagede lidt apoptose i ikke-tumorceller, og den omstændighed, at leveren ville repræsentere et målorgan til behandling af HCC, vi næste fokuserede på Sal virkning på primære, humane hepatocytter. Generelt havde behandling med lave koncentrationer af Sal (1-2 uM) i 24 timer ikke eksplicit ændre PHH-udseende (fig. 4A). I forhold til kontrol, hepatocytter optrådte lidt påvirket med uregelmæssige cellemembraner. Højere koncentrationer af Sal (5-10 uM) dog delvist resulteret i mere åbenlyse ændringer: PHH viste tegn på integritet ødelæggelse og endog tab af sammenløb. Yderligere inkubation af disse kulturer i fravær af Sal ført til fuldstændig inddrivelse af PHH udsat for lave og intermediære doser op til 5 uM. I modsætning hertil efter stimulering med 10 pM Sal i 24 timer var der intet lys mikroskopisk påvisning af effektiv tilbagebetaling for de fleste tilfælde. Inkubation af PHH i 48 timer resulterede i lignende mønstre: (. Fig 4A). Behandling med lave koncentrationer af midlet forårsages temmelig marginale morfologiske ændringer, hvorimod højere doser igen kan føre til cellulære ændringer

Efter en dags inkubation dyrket PHH blev udsat for stigende koncentrationer af salinomycin (1, 2, 5 og 10 uM) ved varierende eksponeringstid (24 og 48 timer, henholdsvis). (A) Nedskrivning af

in vitro

morfologi uden efterfølgende opsving var kun påvises efter behandling med høje koncentrationer af salinomycin (10 mM), mens behandling med op til 5 uM Salinomycin resulterede i morfologisk bedring efter bortfald af agenten. (B + C) Cellelevedygtighed blev vurderet ved MTS-assayet. blev observeret salinomycin behandling i 24 (B) og 48 (C) timer førte til signifikant nedsat cellelevedygtighed på dag 1 og 3. Ved yderligere inkubation genvinding af cellerne som indikeret ved at øge produktionen af ​​det farvede formazaan-produkt (n = 6) . (D + E) Celleskader af PHH som repræsenteret ved AST frigivelse var kun påviselig umiddelbart efter narkotika eksponering (dag 1) til 10 uM Salinomycin i 24 (D) og 48 (E) timer. Denne forskel nåede ikke statistisk signifikans (n ​​= 3). Løbende inkubation blev ledsaget af knap målbar AST frigivelse. * P 0,05, ** p. 0,005

Vi næste undersøgt

in vitro

celle levedygtighed PHH bruge MTS-assay. Cellelevedygtighed blev vurderet umiddelbart efter lægemiddel-eksponering (dag 1) samt på dag 3 og 5 efter Sal-behandling. Som vist i figur 4B, 24 h-eksponering væsentligt forringet cellernes levedygtighed på dag 1 og 3 i en dosis-afhængig måde. Bortfald af lægemidlet og løbende inkubation førte til næsten fuldstændig inddrivelse af PHH ved dag 5 (Fig. 4B). Stimulering med Sal i 48 timer resulterede i en lignende dosisafhængig fald i cellelevedygtighed og efterfølgende udvinding. Men sidstnævnte ikke var så tilstrækkeligt som observeret efter 24 h-eksponering (fig. 4C).

I betragtning af at inkubation af PHH med stigende koncentrationer af Sal resulterede i en midlertidig reduktion af cellernes levedygtighed og histomorfologiske ændringer, vi undersøgt, om ligeledes kunne detekteres andre markører for celleskader. Figur 4D + E viser, at sammenlignelige lækage af AST blev fundet blandt alle forsøgsgrupper. En markant top af AST-release kun blev observeret på dag 1 efter udsættelse for 10 uM Sal men nåede ikke statistisk signifikans. Løbende inkubation uden Sal resulterede i moderat grundlæggende frigivelse af AST i alle grupper.

Næste vi analyserede hvis Sal-behandling hæmmer funktionen af ​​PHH. Til dette blev der urinstof-dannelse og albumin-syntese af lægemiddel-eksponerede PHH bestemt. Som vist i figur 5A + B var der ingen relevant variation i urea-dannelse efter 24 timer-stimulering med Sal. I modsætning hertil efter 48 h-eksponering et dosisafhængigt fald af urinstof-dannelsen var påviselig, især på dag 3 og 5, men nåede ikke statistisk signifikans (fig. 5A + B). Albumin-syntese ved PHH udsat for Sal i 24 timer er kendetegnet ved dosis-afhængigt fald på dag 1 (fig. 5C + D). Bortfald af Sal forårsagede en langsom genopretning af celle funktionalitet med en fortsat stigning af albumin-produktion, men efter stimulering med høje narkotika-koncentrationer. Et lignende men endnu mere udtalt virkning blev observeret ved 48 h-eksponering. Igen, efter bortfald af agenten en kontinuerlig – selvom meget langsommere – inddrivelse af PHH blev fundet (Fig 5C + D.)

funktionalitet PHH efter behandling med salinomycin blev analyseret ved urea dannelse og albumin syntese.. (A) 24 timers salinomycin eksponering ved forskellige koncentrationer blev ikke ledsaget af forringet ureadannelse overhovedet. (B) I modsætning hertil behandling i 48 timer resulterede i en dosisafhængig reduktion af ureadannelse på dag 1, 3 og 5 uden at nå statistisk signifikans. (C + D) Albumin syntese blev markant forringet på dag 1 efter stimulering med salinomycin i 24 og 48 timer. Yderligere inkubation førte til kontinuerlig genvinding af albumin syntese i grupperne med 24 timers lægemiddeleksponering. I modsætning hertil behandling i 48 timer resulterede kun i moderat opsving af albumin syntese (n = 3). * P 0,05, ** p. 0,005

Endelig var vi interesserede i at afgøre, om den forbigående svækkelse af PHH efter 24 timer-eksponering for Sal korrelerer med apoptose induktion. Som det fremgår af figur 6, har eksponering for Sal ikke provokere apoptose af disse benigne celler i modsætning til FasL-behandling.

Cultured PHH blev udsat for stigende koncentrationer af salinomycin (1, 2, 5 og 10 uM) for 24 timer. Apoptose blev detekteret ved M30 Cytodeath kit. Behandling med Fas-ligand (FasL) fungerede som en positiv kontrol. Farvning af PHH med DAPI (blå) og M30 Cytodeath kit (rød) viste ingen tegn til induktion af apoptose i PHH selv efter behandling med høje koncentrationer af salinomycin. I modsætning hertil FasL klart induceret apoptose i PHH.

Diskussion

Vores data understøtter opfattelsen af, at Sal udøver en pro-apoptotisk effekt i HCC celler ved hæmning af autophagic flux, som fører til ophobning af dysfunktionelle mitokondrier og forøget ROS-dannelse. Da tumorceller menes at opleve mere iboende stress og derfor forventes at være meget afhængig af autophagy for overlevelse [33] vores undersøgelse kan bidrage til at forstå, hvorfor Sal selektivt dræber kræftceller, mens besparende godartede celler. Denne hypotese er forstærket af den iagttagelse, at eksponering af PHH til Sal kun resulterer i forbigående svækkelse af cellefunktion uden betydelig skade.

Da HCC er den tredje hyppigste årsag til kræft [34], og den mest almindelige primære liver malignitet med begrænsede behandlingsmuligheder-muligheder især på fremskredent sygdom [34], [35], innovative terapeutiske tilgange er afgørende. Potentialet i Sal til behandling af HCC blev først foreslået af arbejdet i Wang et al. der demonstrerede hæmning af proliferation og induktion af apoptose i HCC

in vitro

in vivo

efter lægemiddel-eksponering [10]. At dissekere den præcise virkningsmekanisme Sal vi fokuseret på den molekylære mekanisme af Sal i HCC. Brug HepG2 og Huh7 celler og omfattende kvantitative analyser kunne vi vise, at Sal hæmmer autophagic flux i humane HCC celler. Følgende fund førte os til den konklusion, at Sal-medieret hæmning af autophagic flux kan være ansvarlig for apoptose i HCC celler. Først demonstrerede vi en dosisafhængig akkumulering af dysfunktionelle mitokondrier med forøget ROS-produktion. Fjernelse af dysfunktionel mitokondrier og dermed reduktion af pro-apoptotiske signaler såsom cytochrom

c

frigivelse betragtes som en integreret del af den pro-overlevelse mekanisme autofagi [36]. Notatet er autofagi blevet gentagne gange vist sig at være afgørende for fjernelsen af ​​dysfunktionelle mitokondrier [31], [37]. Detekterbar ændring af mitokondriemasse og ROS optrådte først efter betydelig hæmning af autophagic flux og blev efterfulgt af en massiv induktion af apoptose og celledød. For det andet, under vores eksperimentelle betingelser farmakologisk og genetisk hæmning af autofagi helt gentog disse begivenheder. Selv om man mener, at næsten alle de farmakologiske hæmmere tilstedeværende pleiotropiske virkninger på flere veje [23], den omstændighed, at genetiske inhibering resulterede i analog ændring argumenterer for muligheden for, at vores observationer er i det mindste delvist medieres af undertrykkelse af autophagic flux. Virkningen af ​​Sal på autofagi i kræftceller i øjeblikket diskuteret kontroversielt. Jangamreddy et al. * P 0,05;