PLoS ONE: Tab af cytoplasmatiske CDK1 forudser Poor Overlevelse i Human Lung Cancer og giver Chemotherapeutic Resistance

Abstrakt

dystre dødelighed af lungekræft skyldes sent på diagnose og iboende terapeutiske modstand. Indarbejdelsen af ​​målrettede behandlinger har beskedent forbedret kliniske resultater, men identifikationen af ​​nye mål kunne forbedre kliniske resultater ved at vejlede lagdeling af patienter fattige risiko tidligt tidspunkt og individualiserende terapeutiske valg. Vi antager, at en sekventiel, kombineret microarray fremgangsmåde ville være værdifuldt at identificere og validere nye mål i lungekræft. Vi profileret genekspression signaturer under lunge epitelcelle immortalisering og transformation, og viste, at gener involveret i mitose gradvist blev forøget i carcinogenese. 28 gener blev valideret af immunblotting og 4 gener blev yderligere evalueret i ikke-småcellet lungekræft væv microarrays. Selv CDK1 blev højt udtrykt i tumorvæv, tabet fra cytoplasmaet uventet forudsagte ringe overlevelse og tillagt resistens mod kemoterapi i multiple cellelinier, især mikrotubuli-directed midler. En analyse af ekspressionen af ​​CDK1 og CDK1-associerede gener i NCI60 cellelinje database bekræftede den brede sammenslutning af disse gener med kemoterapeutisk lydhørhed. Disse resultater har betydning for personalisering lungekræft terapi og fremhæve potentialet af kombinerede metoder til biomarkør opdagelse

Henvisning:. Zhang C, Elkahloun AG, Robertson M, Gills JJ, Tsurutani J, Shih JH, et al. (2011) Tab af cytoplasmatiske CDK1 forudser Poor Overlevelse i Human Lung Cancer og giver Chemotherapeutic Resistance. PLoS ONE 6 (8): e23849. doi: 10,1371 /journal.pone.0023849

Redaktør: Carlo Gaetano, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Italien

Modtaget: May 10, 2011; Accepteret: 26 Juli 2011; Udgivet: 24 august, 2011

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program for NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft død i hele verden, der forårsager ca. 1,2 millioner dødsfald om året, og en anslået 157,300 dødsfald i USA i 2010 [1]. NSCLC opstår oftest hos rygere [2]. I USA er ca. 90% af dødsfald som følge af lungekræft hos mænd og 79% hos kvinder i forbindelse med rygning [3]. De fleste lungekræft er af epitelcelle oprindelse. Derfor er udviklingen af ​​lungecancer afspejler den kumulative virkning af rygning-induceret molekylære ændringer i luftveje epitelceller. Fordi cirka 90 millioner nuværende eller tidligere rygere i USA har en permanent øget relativ risiko for at udvikle lungekræft, kunne identifikation af tidlige molekylære begivenheder iboende lunge tumorigenese danne grundlag for interventioner, der skal forhindre den fænotypiske progression, der ligger til grund for carcinogenese.

Molekylære forandringer i lungekræft er komplekse og omfatter genetiske, epigenetiske og biokemiske forandringer. De første molekylære begivenheder, der skal identificeres var genetisk og inkluderet inaktivering af tumorsuppressorgener, såsom p53 [4], og aktivering af onkogener såsom K-Ras [5]. Epigenetiske hændelser omfatter silencing af CDK-inhibitor, p16, tumor suppressor RASSF1, og andre gener gennem methylering [6], [7]. For nylig er der også blevet rapporteret biokemiske begivenheder såsom konstitutiv aktivering af signaltransduktionsveje, der fremmer cellulær overlevelse og terapeutiske resistens [8], [9], [10]. I sidste ende må disse molekylære ændringer drive fænotypisk progression af epitelcelle bestemt til transformation. Den eksperimentelle transformation af normale epitelceller i tumorigene celler kræver to adskilte trin. Den første er celle immortalisering, som er forpligtet til at foretage celler modtagelige for det andet trin, transformation. Humane celler skal omgå to barrierer for at opnå immortalisering, replikativ aldring og cellulære krise. Disse hindringer for immortalisering reguleres af telomer afkortning og af retinoblastoma (Rb) og p53 tumor-suppressor pathways [11]. er behov for yderligere ændringer for fuld transformation. Selvom et stigende antal molekylære ændringer er blevet identificeret i den fænotypiske progression af epitelcelle transformation, andre begivenheder sandsynligvis vigtige.

For at identificere en bred vifte af molekylære ændringer iboende de processer af immortalisering og transformation af luftvejene epitelceller, vi brugte en model indført ved Reddel

et al.

, der skabte udødeliggjort, ikke-tumorigene bronkiale epitelceller (BEAS-2B) ved at inficere normale humane bronchieepithelceller (NHBE) med adenovirus-12 SV40 hybridvirus [12]. Afbrydelse af p53 og Rb veje med SV40 T-antigen, sammen med øget telomerase ekspression, udødeliggjort BEAS-2B-celler. BEAS-2B-celler blev derefter gjort fuldt tumorigene ved at udsætte BEAS-2B-celler in vivo til tobakken specifikke kræftfremkaldende, nitrosamin 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanon (NNK), i 6 måneder. NNK eksponering inducerede fænotypiske ændringer i BEAS-2B celler, der var magen til de progressive forandringer, der sker i løbet af den menneskelige lunge carcinogenese [13].

I disse undersøgelser vi systematisk profileret genekspression i normal (NHBE), udødeliggjort ( BEAS-2B) og fuldt transformeret (NNK-BEAS-2B) humane bronkiale epitelceller, samt en ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinie (H157) fra en ryger (figur 1A). Udtryk profiler, der ledsager immortalisering og /eller omdannelse af bronkiale epitelceller blev genereret, og ekspression af 28 gener blev valideret ved immunblotting. 4 af dem blev yderligere evalueret i immunohistokemiske analyser af væv microarrays der indeholder NSCLC prøver, der omgiver ikke-sygdomsramte væv og ikke-pulmonale normale væv. Selvom alle 4 gener overvejende blev udtrykt i tumorvæv, tab af ekspressionen af ​​cytoplasmatisk CDK1 var klinisk vigtigt, fordi det var forbundet med en dårlig prognose for NSCLC patienter. Dette dårlige prognostiske værdi kan være forbundet med terapeutisk modstand, fordi faldende niveauer af cytoplasmatisk CDK1

in vitro

øget resistens over for standard kemoterapier anvendes til behandling af NSCLC, især mikrotubuli midler, hvor modstanden var næsten fuldstændig. Disse undersøgelser viser, hvordan en kombineret microarray tilgang kan lette identifikationen af ​​nye, relevante mål i kræft.

A. Systemet og strategi for at studere genekspressionsprofil, dens kliniske betydning og funktionelle rolle under NSCLC carcinogenese og kemoterapeutisk modstand. B. Klassificering af 1.688 regulerede gener blandt BEAS-2B (B), NNK-BEAS-2B (NB) og H157 (H) sammenlignet med NHBE (N). Gener, hvis ekspressionsniveau ikke ændrede mellem cellelinier blev udelukket. Nøgletallene grafisk visualiseret ved Cluster og TreeView programmer (https://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm). Par af baner og gensidige røde og grønne farver indikerer farvestof swapping. C. genekspression dynamik under immortalisering og /eller omdannelse. Graferne blev genereret ved Cluster Analysis of Gene Expression Dynamics program (https://www.genomethods.org/caged). A, C, J og H symboler skildrer grupper af gener identificeret i figur 1B.

Resultater

Klassifikation af differentielt udtrykte gener i BEAS-2B, NNK-BEAS-2B og H157 celler sammenlignet med NHBE-celler

med NHBE som reference, blev 1.688 gener udtrykkes forskelligt i BEAS-2B, NNK-BEAS-2B og /eller H157 celler. Differentielt udtrykte gener blev klassificeret i lettered grupper (A-P) baseret på den fordeling af udtrykket ændringer (figur 1b). Genekspressionsprofiler blev grupperet baseret på fænotypiske egenskaber. NHBE, BEAS-2B, NNK-BEAS-2B-celler repræsenteret normal, immortaliseret, og transformeret stadier af lunge carcinogenese henholdsvis og H157 celler blev anvendt som et urelateret fuldt transformeret cellelinie afledt fra et NSCLC patient. Gener i grupperne A (65, 3,9%) eller J (101, 6%) blev opreguleret eller nedreguleret i henholdsvis BEAS-2B, NNK-BEAS-2B og H157 celler, hvilket indikerer, at disse gener udtrykket ændringer var fælles for immortalisering og transformation af NHBE. Ekspression af gener i gruppe B (38, 2,3%) eller I (31, 1,8%) blev forøget eller formindsket i henholdsvis BEAS-2B og NNK-BEAS-2B, men ikke H157 celler, hvilket antyder, at disse ændringer skyldtes SV40- medieret immortalisering. Gener i grupper C (112, 6,6%) eller H (39, 2,3%) blev differentielt udtrykt i NNK-BEAS-2B og H157 celler, implicerer, at disse gener bidrager til fuld celletransformation. Grupper D (407, 24,1%) og G (571, 33,8%) bestod det største antal gener og var specifikke for NNK-BEAS-2B-celler. Dette antyder, at NNK-medieret transformation er en kompleks begivenhed, der kræver ændringer i ekspression af mange gener. Andre ændringer i genekspression var specifikke for en given celletype, og blev udelukket fra yderligere analyse. De fuldstændige gen liste og relaterede forholdet data leveres i underbyggende oplysninger (tabel S1).

Genekspressionsprofil annotation og biologisk analyse

Blandt klassifikationer, gruppe A og J omfatter gener, der er afgørende hele tumor evolution, fra immortalisering til transformation, og grupperne C og H indbefatter gener, der er forbundet med fuld transformation. De kvantitative ændringer i genekspression er vist (figur 1C). For at analysere genekspression ændringer i disse grupper på et genomisk skala og give binding til putative biologiske processer, udførte vi High-Throughtput GoMiner analyse (tabel 1 blev de beslægtede gener listet i tabel S2). I gruppe A, gener involveret i mitose var stærkt beriget. I gruppe J, blev gener involveret i ektoderm udvikling formindsket. Ingen væsentlig gen ontologi (GO) kategorier blev noteret for grupper B og I. I grupper C eller H, hvor genekspression ændringer blev forbundet med transformation, gener involveret i mitose regulering blev forbedret, mens gener, der negativt regulerer celledeling og biologiske processer blev formindsket (tabel 1). Adskillige GO kategorier blev noteret for grupper D og G, der er relateret til ændringer i forbindelse med transformation af NNK (tabel S3). Disse resultater blev udvidet ved at udføre Gene microarray Pathway Profiler analyse, som viste, at den samlede virkning af genekspression ændringer i carcinogenese ville forudsiges at øge autonom progression gennem cellecyklus (figur S1) og unddragelse af apoptose (figur S2).

Validering af udtryk profiler på proteinniveau ved immunoblotting

for at validere vores microarray data, vi udført immunoblotting i 28 kandidatgener trukket fra forskellige grupper (figur 2). Valget af gener var baseret på den kommercielle tilgængelighed af antistoffer, der tidligere var blevet anvendt i immunoblotting eksperimenter. Gruppe A eller J repræsenterede gener, der var over- eller under-udtrykt i immortalisering og transformation, hhv. Sammenlignet med NHBE, BEAS2B, NNK-BEAS-2B og H157 celler var forøget ekspression af CDK1, cyklin A, STMN1, PTTG1, og TOP2A (gruppe A), og nedsat ekspression af KRT14, PERP, S100A8, maspin, TRAIL, og P63 (gruppe J). Når man sammenligner mRNA udtryk for proteinekspression i gruppe A og J, syntes kun P63 fejlklassificeres i at P63 blev kategoriseret i gruppe J baseret på microarray data, men immunoblotting afsløret, at faldet P63 ekspression blev kun observeret i H157 celler (gruppe N). Dette kunne være relateret til variable antistof-specifik reaktivitet mod P63 isoformer og splice varianter. Generne i gruppe C eller H blev klassificeret som transformation-specifikke baseret på microarray data. Immunoblotting viste, at mange gener inden for denne gruppe C blev kategoriseret. For eksempel cyklin B2, Galectin1 og PBK syntes at være overvejende udtrykt i NNK-BEAS-2B-celler (gruppe D), mens Cyr61 og hnRNPA2 /B1 var fælles for celler, der var udødeliggjorte og transformerede (gruppe A). p21 og KLF4 fra gruppe H blev korrekt klassificeret, fordi deres mRNA og protein-niveauer blev reduceret i NNK-BEAS-2B og H157 transformerede celler. Grupper D eller G repræsenterede NNK-specifikke gener. NNK-BEAS-2B celler entydigt opreguleret protein ekspression af Survivin, DNMT1, HIP1, PLK1, SPARC og ETS1 (gruppe D), og nedreguleret protein ekspression af p15, FKHR og TAO1 (gruppe G). Korrelationen mellem mRNA-ekspression og proteinekspression var høj for disse grupper. XAGE1, oprindeligt klassificeret som en H157 celle-specifikt gen (gruppe M), viste største udtryk i H157 celler. Samlet set viste immunoblotting at 22/28 gener (79%) var korrekt klassificeret fra microarray data, hvilket indikerer en høj korrelation mellem mRNA og proteinekspression.

Immunoblotting analyse i NHBE (N), BEAS-2B (B ), NNK-BEAS-2B (NB) og H157 (H) celler til 28 Molekyler fra repræsentative grupper, og sammenligningen af ​​udtrykket ændrer sig med mRNA niveauer fra microarray data.

immunhistokemisk farvning på lungevæv microarray

for at afgøre, om gener, der blev identificeret i microarray analyse og yderligere valideret ved hjælp af immunoblotting havde klinisk betydning, vi udførte immunhistokemi (IHC) for at vurdere udtryk i humane NSCLC prøver. Af de 22 klassificeres korrekt gener, blev CDK1, TOP2A, PTTG1 og Survivin valgt ud fra kommercielle tilgængelighed af antistoffer, der var blevet valideret i IHC. Ekspression blev vurderet i væv microarrays (TMAS), der indeholder 300 NSCLC tilfælde (150 adenocarcinomer (AD) og 150 skælcellecarcinomer (SCC)), 100 hosliggende ikke sygdomsangrebne lungevæv fra AD og SCC tilfælde og 50 ikke-pulmonale normale væv [14]. Scoring var baseret på intensitet, distribution og subcellulære lokalisering. Farvning mønstre for CDK1, PTTG1 og Survivin var ens i, at farvningen var enten overvejende cytoplasmatisk eller begge nukleare og cytoplasmatiske. I modsætning hertil farvning for TOP2A var enten udelukkende nukleare eller begge cytoplasmatisk og nuklear (figur 3A). Sammenlignet med tumorceller, farvning af omgivende stromale væv var minimal eller fraværende.

A. Eksempler på CDK1, PTTG1, Survivin og TOP2A subcellulære farvning i kliniske tumorprøver (-C: cytoplasmatisk farvning; -N: nuklear farvning). Farvning er vist ved 400 ganges forstørrelse. B. Tissue fordeling af positive satser for CDK1, PTTG1, Survivin og TOP2A. AD: Adenocarcinom; SCC: Pladecellekræft; N-AD: Tilstødende ikke sygdomsangrebne lungevæv fra adenocarcinom; N-SCC: Tilstødende ikke sygdomsangrebne lungevæv fra pladecellecarcinom; N-O: Non-pulmonale normale organer. C. Oversigt over hele væv microarray farvning for ekspression af disse antigener i cytoplasmaet eller cellekernen.

Alle fire proteiner blev hovedsageligt udtrykkes i tumorvæv, sammenlignet med de tilstødende ikke sygdomsangrebne lungevæv (figur 3B ). Dette var især tydeligt, når kernefarvning blev overvejet. De fleste NSCLC prøver var positive for CDK1 cytoplasmatisk farvning (86% for AD og SCC), og 40% af AD prøver og 36% af SCC prøver viste nuklear farvning. Omkringliggende normale lungevæv og andre normale væv udtrykt cytoplasmatisk CDK1, men gav ikke udtryk nukleare CDK1. Farvning for TOP2A var generelt mindre udbredt i NSCLC prøver end for de andre proteiner (20-34%), men blev mere ligeligt fordelt mellem cytoplasmatisk og nuklear farvning. Farvning for TOP2A var eksklusivt til NSCLC prøver vs. omgivende normale lungevæv. PTTG1 og Survivin viste en høj forekomst af cytoplasmatisk farvning (PTTG1- 79% i AD og 69% i SCC, Survivin- 73% i AD og 61% i SCC), samt nukleare farvning (PTTG1- 35% i AD og 49 % i SCC, Survivin- 44% i AD og 33% i SCC). Samlet set farvning for alle fire proteiner var selektiv for NSCLC prøver vs. omkringliggende normale væv, uanset subcellulære lokalisering (figur 3C).

Vi brugte to-vejs klyngedannelse at analysere farvningsmønstrene, og χ

2 test for at undersøge aftalen mellem hvert antistof og foreningen af ​​antistof farvning med kliniske faktorer. Tumorer, der farvet for TOP2A var mest tydelig i forhold til CDK1, PTTG1 og Survivin (figur 4A). Den stærkeste association af antistof-farvning var mellem TOP2A nukleare og cytoplasmatiske farvning (tabel 2), hvilket stemmer overens med den observation, at TOP2A er lokaliseret til kernen og ofte ledsaget af cytoplasmatisk farvning (figur 3A). I modsætning til TOP2A, farvning for CDK1, PTTG1, og Survivin var overvejende cytoplasmatisk. Cytoplasmatisk eller nukleær farvning for PTTG1 og Survivin også grupperet meget ens, og dette var i overensstemmelse med de χ

2 tests (tabel 2). CDK1 nukleare farvning blev stærkt forbundet med enten nukleare eller cytoplasmatisk TOP2A farvning. Samlet set aftalen mellem farvning med disse antistoffer var meget stærk, med undtagelse af sammenslutningen af ​​cytoplasmatisk CDK1 farvning med nukleare Survivin farvning (figur 4A og tabel 2).

A. Det hierakiske clustering for begge antistoffer og tumorer ved hjælp Cluster 3,0 og Java TreeView. B. De positive satser CDK1, PTTG1, Survivin og TOP2A i tidlige stadier (1-2) og fremskredne stadier (3-4). C. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse for cytoplasmatisk CDK1 farvningsmønster i NSCLC. Den permutation test blev anvendt til at beregne den

s

værdi for alle tumorer og tumorer ved scenen.

Når analyseret af scenen, farvning for alle fire proteiner var større i fase 1-2 sygdom (figur 4B). Dette var især tilfældet for TOP2A nukleare farvning, hvor 56% af fase 1-2 prøver var positive, mens kun 26% af fase 3-4 prøver var positive. Når farvning var forbundet med kliniske variable, var der ingen sammenhæng med alder, køn eller differentiering (tabel 2). Cytoplasmisk TOP2A farvning blev stærkt forbundet med mindre tumorer ( 5 cm) (

s

= 0,00745), og den cytoplasmatiske Survivin farvning var forbundet med stadium I sygdom (fase 1 stadie 2-3-4,

s

= 0,0436) (tabel 2)

Kun cytoplasmatisk CDK1 farvning var forbundet med overlevelse, selv om der var en tendens til dårligere overlevelse med cytoplasmatisk PTTG1 positive patienter med tumorer. 5 cm (

s

= 0,089). Uanset fase, tab af cytoplasmatisk CDK1 giver en dårlig prognose (

s

= 0,040) (Tabel 2). Da antallet af fase 2 tumorer negative for cytoplasmatisk CDK1 er for lille og forbudt en meningsfuld sammenligning med positive fase 2 tumorer, og den samlede overlevelse af patienterne i dette datasæt med trin 1 og 2 patienter er ens, vi kombineret fase 1 og fase 2 tumorer som stage tumorer tidligt. Når man sammenligner tidlig fase (1 og 2) og avancerede stadie tumorer (3 og 4), fandt vi, at tab af cytoplasmatisk CDK1 var borderline signifikant for fase tumorer tidligt (

s

= 0,063), men stor betydning for sent tidspunkt tumorer (

s

= 0,008) (figur 4C og tabel 2).

tab af cytoplasmatisk CDK1 og kemoterapi modstand

Det faktum, at tab af cytoplasmatisk CDK1 tillagt en dårlig prognose , især for avanceret NSCLC patienter, der er mere tilbøjelige til at modtage kemoterapi eller kemostråleterapi, foreslog det kunne bidrage til kemoterapeutiske modstand. For at teste denne hypotese, en temperaturfølsom p34cdc2 /CDK1 mutant murint carcinoma FT210 cellelinie blev anvendt. Når FT210 celler dyrkes ved en ikke-permissiv temperatur på 39 ° C fra en permissiv temperatur på 32 ° C, CDK1 bliver fortrinsvis inaktiveret og nedbrudt fra cytoplasmaet [15]. Kemoterapier typisk anvendes til behandling af NSCLC blev testet i disse celler ved hver temperatur. Etoposid, en topoisomerase II inhibitor eller cisplatin, et DNA-ødelæggende middel, signifikant forøget apoptose ved permissive temperatur. Ved den ikke-tolerante temperatur, apoptose var delvist inhiberet (figur 5A). Lignende resultater blev observeret ved den permissive temperatur for tre forskellige mikrotubulus-baserede terapier, hvor markante stigninger i apoptose blev observeret (figur 5B). I modsætning hertil under ikke-tolerante betingelser blev celler næsten fuldstændigt resistente over for hver mikrotubulus-targeted middel. Total niveauer af CDK1-protein blev reduceret ved 39 ° C, som var phosphorylering af CDK1 på Y15. Phospho-Tyr15 CDK1 er en inaktiv cytoplasmatisk form af CDK1 grund phosphorylering med Myt1. Spaltning af PARP ved hver temperatur af paclitaxel var konsistent med måling af apoptose (figur 5B). I forhold til sin parental cellelinje FM3A, FT210 celler fortrinsvis mistet cytoplasmatisk CDK1 proteinekspression (figur 5C) og aktivitet angivet med nedsat fosforylering af survivin på Thr34, et site for CyclinB-CDK1 kinase [16] (figur 5D). Paclitaxel forårsagede signifikant cytotoksicitet i FM3A og FT210 celler ved 32 ° C, men kun FM3A-celler ved 39 ° C. Tilsvarende blev FM3A-celler dræbt af docetaxel og vinorelbin ved enten 32 ° C eller 39 ° C (figur 5E). Således tab af CDK1 i FT210 celler øget relativ modstand mod etoposid og cisplatin, men inducerede markant modstand mod mikrotubuli målrettede midler.

A. FT210 celler blev serum-starvated i 0,1% FBS RPMI1640 medium natten over, derefter behandlet med 10 pM etoposid i 0,1% FBS indeholdende medium i 4 dage ved 32 ° C eller 39 ° C. Apoptose (sub-G1 DNA-indhold) blev bestemt ved flowcytometri (C: Kontrol; T: Behandling). B. FT210 celler blev dyrket i normalt medium og behandlet med 1 pM paclitaxel eller docetaxel og 0,1 uM vinorelbin for 1-4 dage. Den CDK1 protein blev påvist på dag 3 ved hjælp CDK1 eller p-Y15 CDK1 antistoffer, og apoptotisk død blev overvåget af PARP spaltning. Apoptose blev bestemt på dag 4. C. FT210 og dets parentale cellelinje FM3A-celler blev dyrket i 6 timer derefter underkastet subcellulær fraktionering til immunoblotting-analyse. αTubulin og p53 tjente som lastning kontrol for cytoplasmatiske og nukleare fraktioner henholdsvis. D. FM3A og FT210 celler blev dyrket ved 39 ° C i 72 timer og underkastet subcellulær fraktionering. Ekspression af CDK1, p-Survivin (Thr34) og Survivin blev vurderet ved immunblotting. E. FM3A og FT210-celler blev behandlet med 1 pM paclitaxel eller docetaxel og 0,1 uM vinorelbin. Apoptose blev bestemt på dag 4.

Vi undersøgte yderligere rolle CDK1 i kemoterapeutisk modstand ved at modulere niveauer af CDK1 i humane NSCLC celler. Overekspression af CDK1 i H157 celler lidt forhøjet basale niveauer af apoptose og potenseret paclitaxel-induceret apoptose (figur 6A). I modsætning hertil nedregulering af CDK1 i H157 celler under anvendelse af siRNA tillægges resistens over for paclitaxel. Lignende resultater blev observeret i et separat NSCLC cellelinje (A549), når CDK1 ekspression blev reduceret under anvendelse af siRNA (figur 6B). Selv knockdown af CDK1 ikke påvirkede cellecyklusfordeling af ubehandlede A549-celler, havde det reducere sub-G1 DNA-indhold og PARP-spaltning, når A549-celler blev udsat for paclitaxel. Stigningen i G2 /M fraktionen med CDK1 knockdown er i overensstemmelse med rollen som CDK1 ved G2 til M faseovergang. For at dissekere en rolle for CDK1 i apoptose vs. G2 /M overgang blev A549-celler transficeret med tom vektor, vildtype

CDK1

eller dominant negativ

CDK1

(

CDK1DN

) konstruktioner, vækst standset med serum deprivation og en PI3K-inhibitor LY294002, og derefter behandlet med paclitaxel. Formindsket celledeling blev observeret mikroskopisk og bekræftet af manglen på G2 /M berigelse med paclitaxel behandling (figur 6C). Trods cellecyklusstop, overekspression af CDK1 stadig øget sub-G1 fraktion, der korreleret med tab af G1 befolkning. Disse effekter blev ikke set med overekspression af CDK1DN, som mangler-aktivitet via en dominerende punkt mutation (D146N) [17].

A. CDK1 protein over eller under udtrykkes i H157 celler. Celler blev transficeret med

CDK1

plasmid eller siRNA, 48 timer eller 72 timer senere, blev behandlet med 1 pM paclitaxel i 2 dage. CDK1 proteinniveauet blev overvåget ved CDK1 eller p-Y15 CDK1 antistoffer. Sub-G1 DNA-indhold blev bestemt ved flowcytometri. B. Knockdown of CDK1 i A549-celler. Celler blev transficeret med

CDK1

siRNA, 72 timer senere, behandles med 1 pM paclitaxel i 2 dage. Apoptose blev bestemt ved PARP-spaltning under anvendelse af immunoblotting eller sub-G1 DNA-indhold ved anvendelse af flowcytometri. CDK1 proteinniveauet blev overvåget ved CDK1 eller p-Y15 CDK1 antistoffer. C. Overekspression af CDK1 eller CDK1DN i A549-celler. Celler blev transficeret med

CDK1

eller

CDK1DN

plasmider, 48 timer senere, celledeling stoppet af natten forbehandling af lav serum (0,1% FBS) medium med PI3K-inhibitoren LY294002 (10 uM), derefter celler blev behandlet med 1 pM paclitaxel i lavt serum-medium indeholdende LY294002 (10 uM, frisk tilsatte) i 2 dage. Sub-G1 fraktion og cellecyklus-profil blev bestemt ved flowcytometri. Overekspression af CDK1 og CDK1DN blev detekteret ved CDK1 antistof.

Ovennævnte forsøg viser, at CDK1 proteinniveauet og aktivitet er forbundet med følsomheden af ​​cancerceller over for kemoterapi. For at bekræfte denne observation, vi søgte NCI60 human cancer cellelinje sammensatte følsomhed og molekylære mål databaser og udført SAMMENLIGN [18] analyser. Ekspression af CDK1 aktivator Cdc25A, p-Y15 /T14 CDK1, total CDK1, samt CDK1 bindingspartnere cyclin B og cyclin A var positivt forbundet med følsomhed over for paclitaxel, etoposid og docetaxel. De højeste Pearson korrelationskoefficienter (PCC) blev observeret med docetaxel og paclitaxel (tabel 3). Selvom Cdc25A, p-Y15 CDK1 og cyclin A beskedent var forbundet med cisplatin, CDK6 og Tyms var de øverste korrelater. Således CDK1 og dets aktiverende maskinkomponenter (figur 7A) blev bredt identificeret som faktorer, der ligger til grund for følsomhed over for mange midler, der anvendes til at behandle humane kræftformer, især mikrotubulus-rettet agenter.

A. En model af CDK1 aktivering. Når inaktiv p-Y15 /T14 CDK1 dephosphoryleres på Y15 og T14 af Cdc25A, det associerer med cyclin A /B og bliver aktiv i cytoplasmaet, derefter hurtigt translokerer ind i kernen, hvor det fremmer G1 til S og G2 /M-overgange. Aktiv CDK1 inaktiveres via sekventiel phosphorylering af Y15 og T14 af Wee1 og Myt1, og er bundet ved 14-3-3σ i cytoplasmaet. Denne proces gentages med cellecyklus at køre cellulær proliferation. B. Et diagram for at illustrere den dobbelte rolle CDK1 som en tumorigen driver i lunge carcinogenese og sensibiliserende i kemoterapeutisk lydhørhed.

Diskussion

identifikation af klinisk relevant protein lægemidler mod cancer er vanskelig. Vi strategisk profileret transkriptionelle ændringer i modeller for lunge carcinogenese, validerede mål på et protein-niveau, og evalueret udtryk og subcellulære lokalisering af de øverste kandidater på kliniske væv microarrays. Af de identificerede gener i cDNA mikroarrays og blevet bekræftet af immunblotting blev CDK1, TOP2A, PTTG1 og Survivin valgt til yderligere vurdering. CDK1, PTTG1 og Survivin blev højt udtrykt i lunge tumorvæv. Nuklear CDK1 og TOP2A blev udelukkende udtrykt i tumorvæv sammenlignet med normale væv, herunder ikke-pulmonale normale organer. Det faktum, at disse gener fortrinsvis blev udtrykt i tumorvæv, især i den tidlige fase NSCLC, tyder på, at de kan have nytte som biomarkører og terapeutiske mål i tidligt stadium NSCLC.

CDK1 er en vigtig, nye mål i kræft. CDK1 er en katalytisk underenhed af M-fase fremmende faktor, som er afgørende for G1 /S og G2 /M faseovergange af den eukaryote cellecyklus. Den højeste farvning i NSCLC kliniske prøver og det stærkeste udtryk i tumorigene NNK-BEAS2B celler antyder, at CDK1 spiller en central rolle i tumorigenese. Faktisk har overekspression af CDK1 blevet observeret i tidlig fase lung adenocarcinomer [19]. Vores data viser, at selv om de fleste NSCLC prøver udtrykt cytoplasmatisk CDK1, dets tab tillagt en dårlig prognose, især for fremskreden NSCLC patienter. Tab af cytoplasmatisk CDK1 kunne forklares ved tab af totalt protein ekspression eller translokation til kernen. Meget få tumor prøver (4 sager) udtrykke nukleare men ikke cytoplasmatisk CDK1, tyder på, at tabet af proteiner såsom 14-3-3σ der sekvestrerer CDK1 i cytoplasmaet kan bidrage til dette fund [20] [21], men tab eller reduktion af 14-3-3σ er meget sjælden i primære NSCLC prøver [4]. Vores kemoterapi eksperimenter viser, at sænkning totale niveauer af CDK1 eller cytoplasmiske niveauer af CDK1 giver kemoterapeutisk resistens over for mange midler anvendt til behandling af lungekræft, især mikrotubuli-rettet midler.

Data afledt fra NCI 60 humane cancercellelinie database foreslår, at status af mange komponenter af CDK1 maskiner potentielt kunne spille en bred rolle i følsomhed over for kemoterapi, er ikke kun begrænset til NSCLC cellelinier. CDC25 phosphataser med dobbelt er vigtige regulatorer af cellecyklusprogression via aktivering af CDK’er ved dephosphorylere CDK’er på threonin 14 og tyrosin 15, to kritiske aminosyrerester fører til efterfølgende associering CDK’er med deres tilknyttede cycliner. Tre homologer eksisterer i pattedyr: Cdc25A, Cdc25B, og Cdc25C. Cdc25A [22], [23], [24] og Cdc25B har onkogene egenskaber og overudtrykt i nogle typer af tumorer [25]. Cdc25B og Cdc25C er impliceret som regulatorer af mitose, men tab af disse gener i mus eller celler ændrer ikke cellecyklus eller checkpoint respons, hvilket tyder på en mulig funktionel kompensation fra Cdc25A [26]. De Cdc25A protein pendulfart mellem kernen og cytoplasmaet [27], [28] og har en omfattende funktion i regulering G1 /S, S og G2 /M-overgange [29]. Således Cdc25A tidsmæssigt og rumligt har flere chancer end Cdc25B /C for tidligt aktiverer CDK1. Ledsager CDK1 defosforylering af Cdc25A, CDK1 forbinder med cyklin A /B og derefter bevæger sig hurtigt ind i kernen [30]. Cellecyklussen skal reguleres i både tid og rum [31]. En uplanlagt, for tidlig eller vedvarende CDK1 aktivering kan føre til celledød, mitotisk katastrofe eller apoptose induktion [32], [33], [34], især når CDK1 aktiverende maskinkomponenter er stærkt udtrykt [35]. Phosphoryleret CDK1, en inaktiv form, overvejende cytoplasma [31], er et substrat for Cdc25A, og dens overflod i cytoplasmaet forbedrer CDK1 aktivering potentiale.