PLoS ONE: et lille molekyle SMAC Mimic LBW242 forstærker trail og Anticancer Drug-medieret Cell Death of kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

Baggrund

Kræft i æggestokkene er stadig en førende dødsårsag hos kvinder og udvikling af nye behandlingsformer er afgørende. Anden mitokondrier afledt aktivator af caspase (SMAC) er blevet beskrevet at sensibilisere for apoptose. Vi har udforsket den pro-apoptotiske aktivitet LBW242, en efterligner af SMAC /DIABLO, om æggestokkene kræft cellelinier (A2780 celler og dets kemoterapi derivat A2780 /ADR, SKOV3 og hey celler) og i primære æggestokkene cancerceller. Virkningerne af LBW242 på æggestokkene kræft cellelinjer og primære ovariecancerceller blev bestemt ved celledeling, apoptose og biokemiske analyser.

vigtigste resultater

LBW242 tilføjede alene fremkaldte kun en moderat pro-apoptotisk effekt ; men det kraftigt synergistisk med tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) eller anticancerlægemidler i inducere apoptose af begge æggestokkene cancercellelinier og primære ovariecancerceller. Mekanistiske undersøgelser viser, at LBW242-induceret apoptose i ovariecancerceller er associeret med aktivering af caspase-8. I tråd med denne mekanisme, c-FLIP overekspression hæmmer LBW242-medieret apoptose.

Konklusion

LBW242 sensibiliserer ovariecancerceller til antitumor virkninger af TRAIL og anticancer narkotika almindeligvis anvendes i klinikken. Disse observationer tyder på, at SMAC /DIABLO mimic LBW242 kunne være af værdi for udviklingen af ​​eksperimentelle strategier til behandling af kræft i æggestokkene

Henvisning:. Petrucci E, Pasquini L, Bernabei M, Saulle E, Biffoni M, Accarpio F, et al. (2012) et lille molekyle SMAC Mimic LBW242 forstærker trail og Anticancer Drug-medieret Cell Death of æggestokkene Cancer Cells. PLoS ONE 7 (4): e35073. doi: 10,1371 /journal.pone.0035073

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA

Modtaget: Juli 5, 2011; Accepteret: 9 marts 2012; Udgivet: 25 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Petrucci et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra den italienske Health Ministeriet, Progetto Oncotecnologico til UT. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft er meget kompleks flertrins lidelse der involverer den gradvise ophobning af genetiske og epigenetiske abnormiteter, som i sidste ende føre til, at transformationen af ​​normale celler i maligne celler, som viser de væsentlige egenskaber for kræft: modstand mod apoptotiske mekanismer, uafhængighed fra vækstsignaler , ufølsomhed over for negative vækst signaler, invasive og metastatiske kapacitet, ubegrænset replikativ potentiale og vedvarende angiogenese [1]. Blandt disse forskellige egenskaber af kræftceller, modstanden mod apoptose sikkert spiller en betydningsfuld rolle for tumor udvikling og progression. Evnen hos cancerceller til at unddrage apoptose er relateret til forskellige biokemiske egenskaber af disse celler, og især, at opreguleringen af ​​antiapoptotiske gener, såsom visse medlemmer af Bcl-2-familien af ​​proteiner og medlemmer af inhibitoren af ​​apoptose (IAP ) familie af proteiner [2]. Især tre rækker af beviser understøtter en rolle for IAP-proteiner i cancer: (i) forhøjede ekspressionsniveauer af IAP-proteiner, især XIAP, C-IAP1 og c-IAP2, i en række humane cancertyper korrelerer med tumorklassificering og prognose [ ,,,0],3]; (Ii) en række

in vitro

in vivo

undersøgelser har vist, at nedregulering af XIAP eller c-IAP1 af forskellige stoffer medfører sensibilisering af kræftceller til kemo- og gamma stråle- induceret apoptose [4]; (Iii) det kromosomale region 11q21-q23 indeholdende c-IAP1 og c-IAP2 gener er underkastet kromosomal amplifikation i forskellige tumorer [3], [4].

IAP’er og især c-IAP1, c- IAP2 og X-bundet IAP (XIAP), fungerer til at inhibere apoptose ved at forhindre aktivering af caspase-8 eller inhibering af aktiviteten af ​​caspase-9, -3 og -7, henholdsvis [5], [6]. C-IAP1 og c-IAP2 besidder en E3 ubiquitin ligase domæne, som fremmer proteasom-afhængig nedbrydning af c-IAP1 og c-IAP2 [7]. Aktiviteten af ​​IAP antagoniseres af SMAC /DIABLO (anden-mitochondrier-afledte aktivator af caspaser /direkte inhibitor af apoptose-bindende protein med lav pi), at efter frigivelse fra mitochondrier som reaktion på apoptotiske udløsning, undergår modning og spaltning af dets N terminale region, med deraf følgende eksponering af AVPI sekvensen [8]. Denne tetrapepetide binder XIAP og konkurrerer med de samme bindingssteder, der er involveret i interaktionen med caspaser [9]. Gennem denne mekanisme, SMAC /DIABLO forhindrer beslaglæggelse af caspaser af IAP, hvilket vil lette den apoptotiske vej. Da AVPI sekvens er i stand til at fremme apoptose, forbindelser i stand til at efterligne denne tetrapeptid, kollektivt kendt som SMAC-mimetika har repræsenteret formålet med intensiv forskning og adskillige af disse midler er blevet udviklet i løbet af de senere år [10] – [15 ].

Det er vigtigt at bemærke, at en deregulering af IAP kan bidrage til tumor udvikling ikke kun gennem caspaser inaktivering, men også gennem forskellige mekanismer ikke afhængig af caspaser inaktivering. Således er en nylig undersøgelse viste klart, at: XIAP bidrager til metastaser

in vivo

og celleinvasion

in vitro

, uafhængigt af caspaser bindende og hæmning; XIAP i kompleks med survivin driver aktiveringen af ​​NF-KB til at fremme celleinvasion og metastase; c-IAP1 og c-IAP2 er også involveret i kræft celle invasion [16].

Således inaktivering af IAP, især når de kombineres med andre behandlinger (såsom chemotherapic narkotika, død ligander herunder TNF-alfa og TRAIL ), resulterer i død af de fleste tumorceller, i det mindste under vævskulturbetingelser [11], [13], [16], [17]. Vigtigere, er inaktivering af IAP ikke ud til at være til skade for normale celler. Ensemblet af disse observationer har støttet udviklingen af ​​små farmakologiske hæmmere af IAP, der er blevet indført i kliniske fase I-forsøg [5].

LBW242 er en peptidomimetisk målrettet IAP nylig rapporteret af Zawel og kolleger, der konkurrerer med høj affinitet med SMAC /DIABLO til indflytning af XIAP BIR3 bindende lomme [17]. Denne forbindelse viste sig at være i stand til at inducere apoptose af forskellige celletyper, herunder myelomatose, akut myeloid leukæmi, glioblastom og melanom [18] – [21].

I den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt kapacitet LBW242 at inducere apoptotisk celledød af ovariecancerceller tilsættes alene eller i kombination med enten TRAIL eller anticancerlægemidler. Vores resultater viser, at LBW242 forbedrer følsomheden af ​​ovariecancer celledød induceret af enten TRAIL eller anticancerlægemidler såsom Topotecan gennem en effekt relateret til en potensering af caspase-8-aktivering. Disse observationer understøtter fremtidige studier for at undersøge en mulig rolle LBW242 i æggestokkene kræftbehandling.

1a- A2780WT, A2780ADR, HEY og SKOV3 celler er blevet dyrket i 48 h enten i fravær eller i overværelse af TRAIL (50 ng /ml) og enten i fravær eller i nærværelse af stigende koncentrationer af LBW242 (fra 1 til 10 uM) og i slutningen af ​​dyrkningen antallet af levende celler blev bestemt. Forskellen mellem kontrol og TRAIL var statistisk signifikant: p = 0,001 for A2780WT og HEY; p = 0,01 for SKOV3; p = 0,05 for A2780ADR. 1B- A2780WT og SKOV3-celler er blevet dyrket som ovenfor, og efter 48 timers kultur andelen af ​​apoptotiske celler blev bestemt ved Annexin-V bindingsassay og propide iodidfarvning. Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev bestemt ved flowcytometri. Resultaterne repræsenterer middelværdierne observeret i tre separate forsøg. Forskellen mellem kontrol og TRAIL var statistisk signifikant: p. = 0,01 for både A2780WT og SKOV3 celler

Metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse var specielt godkendt af Institutional Review Board af Istituto Superiore di Sanità og var i overensstemmelse med principperne i Helsingfors-erklæringen II. Den skriftligt informeret indhold blev opnået fra hver patient.

A2780WT, A2780ADR og SKOV3-celler er blevet stabilt transficeret med enten en tom vektor (PINCO) eller med vektoren indeholdende cDNA af c-flip (FLIP) og resulterende celler blev dyrket enten i fravær (kontrol) eller i nærvær af LBW242 (10 uM) eller TRAIL (50 ng /ml) eller begge disse midler ved de ovennævnte koncentrationer. Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse af Annexin-V /PI binding assay. Dataene repræsenterer middelværdierne ± SEM observeret i tre separate forsøg. Statistisk analyse: * p = 0,05; ** P = 0,01; *** P =. 0,001

Cell Culture

Cisplatin-følsomme menneske ovarie epitelcarcinom cellelinje A2780WT blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC); adriamycin-resistente cellelinie A2780ADR, afledt af dets parenterale ovariecancer cellelinie A2780 ved at anvende trinvise stigninger i koncentrationer af adriamycin blev opnået fra European Collection of Cell Cultures (ECACC). De A2780ADR celler blev behandlet med 10 pM adriamycin hver 10 passager. SKOV3 og HEY cellelinjer blev opnået fra ATCC.

A2780WT, A2780FLIP, A2780ADR, A2780ADR FLIP, SKOV3 og SKOV3 FLIP celler er blevet dyrket som rapporteret i fig. 2, enten i fravær eller i nærvær af 40 uM zVAD-fmk eller zIETD-fmk og efter 48 h inkubation procentdelen af ​​apoptotiske celler blev bestemt ved Annexin-V /PI binding assay. Resultaterne repræsenterer middelværdier ± SEM observeret i tre separate forsøg.

Cellerne blev dyrket ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2 i Advanced MEM med 3% føtalt bovint serum (FBS, Euroclone, Milano, Italien), 50 IU /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin, 50 ug /ml gentamicin og 0,3 ug /ml glutamin. Cellerne blev rutinemæssigt kontrolleret for tilstedeværelse af mycoplasma.

I felt C både fuldlængde (FL) og den spaltede form, (CF) af caspase-3 er vist. PARP immunblotting viser to bånd, hvoraf de øvre svarer til en fuld-længde form af PARP og det nedre bånd til et spaltet form af PARP. I figuren rapporteres de repræsentative data observeret i en af ​​de tre forsøg udført.

Isolering og in vitro-dyrkning af primære ovariecancerceller

Der er opnået Intra-operationslampen biopsier fra 9 æggestokkene kræftpatienter, der er ramt af serøs adenokarcinom, undergår debulking kirurgi for enten primær eller recidiverende sygdom. Tumorvæv er blevet mekanisk dissocieret med en saks og en tumorcelle suspension er blevet opnået ved fordøjelse i vævsdyrkningsmedium (RPMI 1640) indeholdende collagenase, deoxyribonuclease I og hyaluronidase. Den endelige tumorcelle suspension blev kontrolleret for andelen af ​​tumorceller ved standard cytologi og procentdelen af ​​epitelceller ved flowcytometri (bestemt efter farvning med Ber-EP4-mAb, Dakopatt, Copenaghen, Danmark). Kort fortalt, til evaluering af Ber-EP4 reaktivitet celle alikvoter blev farvet i 30 minutter ved 4 ° C med 5 ug /ml FITC-mærket anti-Ber-EP4 mAb, vasket og analyseret for fluorescens-emission ved anvendelse af en Becton Dickinson flowcytometer. Tumorcellelinier alikvoter (1 × 10

6 celler) er blevet udpladet i 25 cm

3 vævskulturkolber i 10 ml cellekulturmedium indeholdende 10% føtalt kalveserum. Efter 1 dags

in vitro

kultur, ikke-adhærente celler (indeholdende vævsrester og døde celler) er blevet fjernet og frisk medium blev tilsat til kulturen, og derefter inkuberet i yderligere 24 timer, enten i fravær eller i tilstedeværelsen af ​​TRAIL eller LBW242 eller begge reagenser. Efter 24 timers dyrkning blev cellerne konfluente. Tumor-kulturer indeholdt mindst 80% af tumorcellerne.

transduktion af A2780WT, A2780ADR og SKOV3 celler

A2780WT, A2780ADR og SKOV3 celler, der udtrykker enten tom vektor PINCO-GFP (PINCO) eller vektor PINCO-GFP, der indeholder c-flip

L (FLIP) humant gen er blevet opnået som tidligere rapporteret [22]. Transducerede celler blev rutinemæssigt analyseret for GFP-ekspression ved hjælp af en flowcytometer og for c-flip

L udtryk ved Western blotting.

Apoptose vurdering Annexin-V farvning

Efter narkotika behandlinger, celler blev resuspenderet i 200 pi farvningsopløsning (indeholdende Annexin-V fluorescein og propidiumiodid i en Hepes puffer, Annexin-V-FITC Apoptose Detection Kit, Pharmingen, San Jose, CA, USA). Efter inkubation ved stuetemperatur i 15 min., Blev cellerne analyseret ved flowcytometri. Annexin-V binder til disse celler, som udtrykker phosphatidylserin på det ydre lag af cellemembranen, og propidiumiodid pletter det cellulære DNA af disse celler med en kompromitteret cellemembran. Dette giver mulighed for diskriminering af levende celler (ufarvede med enten fluorochrom) fra apoptotiske celler (kun farves med annexin V) og nekrotiske celler (farvet med både Annexin-V og propidiumiodid).

Kvantificering af apoptose og celle cyklus analyse ved propidiumiodid /fluorescensaktiveret cellesortering

Celler blev høstet med trypsin, vasket, inkuberet først med en spermin tetrahydrochlorid detergent buffer indeholdende trypsin at fordøje cellemembraner og cytoskelet, derefter med en citratpuffer indeholdende en trypsininhibitor og ribonuclease A til at inhibere trypsin-aktivitet og for at fordøje RNA’et og endelig resuspenderet i 400 pi propidiumiodid (PI) (50 ug /ml PI, 0,1% Triton X-100 og 0,1% natriumcitrat i PBS) (cyklus Plus DNA Staining Kit, Becton Dickinson, USA). Cellerne blev derefter analyseret ved flowcytometri under anvendelse af et software dedikeret til DNA-analyse (ModFit LT software, Verity Software House, Topsham, ME, USA). Cellerne med subdiploid DNA-indhold blev kvantificeret for at bestemme procentdelen af ​​celler, der indeholder apoptotiske, fragmenteret DNA.

Reagenser, der anvendes til at inducere apoptose af tumorceller

æggestokkene cancerceller blev præinkuberet med en pan-caspase inhibitor, N-benzyloxy-carbonyl-Val-Ala-Asp (OMe) -fluoromethylketone (zVADfmk) eller N-benzyloxy-carbonyl-Ile-Glu (OMe) -Thr-Asp (OMe) -fluoromethylketone (zIETDfmk), (begge fra Sigma, St. Louis, USA) før tilsætning af de forskellige forbindelser stimulerer apoptose.

agonistiske monoklonale antistoffer mod TRAIL-R1 (MAPATUMUMAB) og TRAIL-R2 (LEXATUMUMAB) er fuldt humane antistoffer af IgG1-isotypen [23 ], [24] og blev generøst tilvejebragt af human Genome Science (Rockville, MD, USA).

Behandling med lægemidler mod cancer

I nogle forsøg ovariecancerceller er blevet inkuberet med nogle anticancer narkotika almindeligt anvendt i æggestokkene cancerterapi: cis-diamineplatinum (II) chlorid (CPLAT); paclitaxel (TAXOL); Topotecan Hydrichloride hydrat (TOPO); Etoposid (ETOPO); Doxorubicinhydrochlorid (Doxo). Alle disse lægemidler blev købt fra Sigma Co (St Louis, USA) og blev tilsat

in vitro dele på to doser: en lav dosis, der svarer til det højeste niveau gennemsnitlige plasma observeret under lægemiddelinfusioner til cancerpatienter (dvs. 1,67 uM til CPLAT; 2,45 uM til TAXOL, 0,21 uM 8,5 uM for ETOPO;. 0,17 uM for Doxo) og en høj dosis, svarende til en fem gange højere dosis end den lave dosis

Western blot analyse

Hele celleekstrakter blev opnået lysere cellerne i en buffer indeholdende 20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,5% NP-40, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 ug /ml leupeptin, 2 ug /ml aprotinin, 25 mM NaF og 10 mM Na

3VO

4. Efter inkubation i 30 min på is blev proteinlysater renset for rester ved centrifugering ved 10.000 g i 10 minutter. Proteinkoncentrationen i den opløselige supernatant, blev bestemt under anvendelse af Bio-Rad proteinassay (Bio-Rad, Richmond, VA, USA).

A- HEY-celler er blevet inkuberet i 24 timer enten i fravær ( kontrol) eller i nærvær af LBW242 (30 uM) eller af enten cisplatin (CPLAT på 1,6 eller 8 uM) eller paclitaxel (TAXOL på 2,5 eller 12,5 uM) eller Topotecan (TOPO ved 0,2 eller 1 uM) eller etoposid (ETOPO ved 8 eller 40 uM) eller doxorubicin (Doxo på 0,17 eller 0,85 uM) alene eller i kombination med LBW242 og analyseret for induktion af celledød ved flowcytometri. Dataene repræsenterer middelværdierne ± SEM observeret i tre separate forsøg. Statistisk analyse: * p = 0,05; ** P = 0,01; *** P = 0,001. B – HEY-celler er blevet inkuberet i 24 timer i nærværelse af stigende koncentrationer af LBW242either i fravær (kontrol) eller i nærvær af cisplatin (1,6 uM) eller paclitaxel (2,5 uM) eller Topotecan (0,2 uM) og analyseret for induktion af celledød ved flowcytometri. Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM observeret i tre separate forsøg. Forskellene mellem kontrol og Topotecan (p = 0,001), kontrol og Paclitaxel (p = 0,001) og kontrol og cisplatin (p = 0,05). Var alle væsentlige

A- LBW242 potenserer proapoptotiske virkning topotecanhydrochlorid, en topoisomerase i-inhibitor. A2780WT PINCO og FLIP (

toppaneler

) og SKOV3 PINCO og FLIP (

bundpaneler

) celler er blevet inkuberet i 24 timer enten i fravær (kontrol) eller i nærvær af enten DMSO 0,01% eller zVAD-fmk 40 uM, topotecanhydrochlorid 1 uM, TRAIL 50 ng /ml eller LBW242 + zVAD-fmk, LBW242 + topotecanhydrochlorid, TRAIL + zVAD-fmk, TRAIL + topotecanhydrochlorid, topotecanhydrochlorid + zVAD-fmk, LBW242 + TRAIL, LBW242 + TRAIL + zVAD-fmk, LBW242 + topotecanhydrochlorid + zVAD-fmk og analyseret for induktion af apoptose ved flow-cytometri. Dataene repræsenterer middelværdierne ± SEM observeret i tre separate forsøg. I A7280 WT PINCO og i SKOV3 PINCO celler LBW242 + TOPO inducerede en andel af døde celler højere end den observeret med enten LBW242 (p = 0,05) eller TOPO (p = 0,05). B og C – Evaluering af caspaser-8-aktivering i A2780 og A2780ADR celler inkuberet enten i fravær (kontrol) eller i nærvær af LBW242 eller Topotecan eller af både LBW242 og topotecan. Caspase-8-aktivitet i intakte celler blev målt under anvendelse af et caspase-8 specifik fluorigenic substrat. Originale resultater fra en repræsentativ undersøgelse er rapporteret i B, mens middelværdierne ± SEM af de procentdele af celler, som viser caspase-8-aktivering er rapporteret i C. Procentdelen af ​​celler, der udviser aktiverede caspase-8 var højere for både WT og ADR-celler i LBW242 end i NT-celler (p = 0,05) og i LBW242 + TOPO end i LBW242 eller TOPO-behandlede celler (p = 0,05)

Antistoffer

Anti. -caspase -9, -3 blev indkøbt fra Upstate (Upstate Biotechnology, Lake Placid NY, USA og R Anti-XIAP og anti-Bcl-2 blev indkøbt fra BD Pharmingen (BD Pharmingen, San Diego, USA); anti-survivin og anti-PARP blev købt fra R anti-FADD blev indkøbt fra BioSource (BioSource, Camarillo, CA, USA); anti-c-FLIP (klon NF6) og anti-c-IAP blev indkøbt fra Alexis (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA); anti-actin fra Oncogene (Oncogene forskning Products, Cambridge, MA), blev anvendt som lastning kontrol.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Graph Pad program. Alle parametre blev rapporteret som middelværdi ± SEM. For at sammenligne mellem gruppeforskelle blev robust ANOVA udført. De P-værdier rapporteret var tosidet. En P-værdi på mindre end 0,05 angivet statistisk signifikans. Isobologram analyse blev udført under anvendelse af CalcuSyn software program (Biosoft, MO, og Cambridge, UK). En kombination indeks (CI) mindre end 1,0 indikerer synergisme, en et CI på 1,0 indikerer additiv aktivitet [25].

Resultater

LBW242 forbedrer TRAIL-medieret celledød af æggestokkene kræft cellelinjer

i vores tidligere undersøgelser viste vi den pro-apoptotiske effekt af SMAC /DIABLO mimetiske forbindelse 3 i æggestokkene kræftcellelinjer A2780WT og deres resistent modstykke A2780DDP og A2780ADR [26]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi virkningen af ​​en anden SMAC /DIABLO mimetikum, LBW242, på kræft i æggestokkene modeller. Først undersøgte vi celleproliferationen i en dosis-respons-test af LBW242 alene og i kombination med TRAIL (fig. 1A). Cellelinjen A2780WT (

øverste venstre panel

) blev kun lidt hæmmet i sin vækst ved LBW242 tilføjede alene; imidlertid den kombinerede behandling af LBW242 med TRAIL resulterede i en markant synergistisk inhibering af cellevækst. Den samme slags sensitivitet blev observeret for HEY cellelinie (

nederste venstre panel

). Isobologram analyse bekræftede synergistisk anti-tumor aktivitet LBW242 plus TRAIL (for A2780WT CI = 0,77 og HEY CI = 0,80). Den synergistiske interaktion mellem LBW242 og TRAIL i A2780WT og HEY cellelinier kan intuitivt visualiseres ved at plotte cellevæksten data ved hjælp målinger ved LBW242 0 uM med og uden TRAIL som 100%, og alle de efterfølgende målinger udtrykt i forhold til sin egen kontrol (se fig. S1). Dette tal afslører en yderligere reduktion i celleantal forårsaget af tilsætningen af ​​LBW242 på toppen af ​​den, der induceres ved TRAIL alene (fig. S1).

De grå bjælker repræsenterer middelværdier ± SEM. Ovariecancerceller isoleret fra tumorbiopsier er blevet dyrket i 24 timer enten i fravær eller i nærvær af LBW242 (10 uM) eller TRAIL (50 ng /ml) eller begge stoffer på de ovennævnte koncentrationer.

Underpanel på højre

: Andelen af ​​døde celler var højere i LBW242 eller TRAIL eller LBW242 + TRAIL-behandlede celler end i kontrol ikke-behandlede celler (p = 0,01); endvidere procentdelen af ​​døde celler var lavere i LBW242 + TRAIL end i TRAIL eller LBW242-behandlede celler (for både p = 0,05).

Underpanel på venstre

: Cellen nummer var signifikant lavere i LBW242 + TRAIL end i TRAIL eller LBW242-behandlede celler (for både p = 0,05)

A2780ADR og SKOV3 (

højre paneler

) cellelinjer var den mest fornuftige for den hæmmende virkning af LBW242 på celledeling, som moderat blev forøget med TRAIL tilføjelse. Isobologram analyse viste en additiv effekt af LBW242 plus TRAIL i inhibering af væksten af ​​disse cellelinjer (for A2780ADR CI = 0,97; for SKOV3 CI = 1,0).

De samme behandlinger blev udført på A2780WT og SKOV3 cellelinjer til vurdere effekten af ​​LBW242 på procentdelen af ​​apoptotiske celler (fig. 1B). De A2780WT celler var næppe følsomme over for de enkelte behandlinger med enten LBW242 eller TRAIL alene, men meget følsom over for den kombinerede behandling (CI = 0,70). SKOV3-celler var følsom over for pro-apoptotiske effekt af LBW242, men næppe følsom for TRAIL; den kombinerede tilsætning af de to lægemidler yderligere øget hastigheden af ​​apoptose (Cl = 0,79) (Fig 1B.)

Disse data indikerer, at:. æggestokkene cancercellelinier er følsomme over for LBW242 virkninger, især i kombineret behandling med STI; LBW242 udøver en synergistisk eller additiv anti-tumor aktivitet med TRAIL i æggestokkene kræftceller.

Eksperimenter udført ved hjælp af agonistisk anti-TRAIL-R1 (MAPATUMUMAB) eller anti-TRAIL-R2 (LEXATUMUMAB) mAbs dokumenteret, at den sidstnævnte tilsættes sammen med LBW242 inducerede en høj apoptose af alle fire ovarian cancer cellelinjer her studeret (data ikke vist).

c-FLIP

L overekspression hæmmer den pro-apoptotiske virkning af LBW242

i tidligere undersøgelser blev det påvist, at under TNFa stimulation, caspase-8 er en kritisk apoptotisk protease i IAP-antagonist-induceret celledød [27] – [30]. At udforske en mulig rolle af caspase-8 aktivering i LBW242-medieret celledød, vi brugte cellelinjer stabilt transfekteret med c-flip

L (A2780WT FLIP, A2780ADR FLIP og SKOV3 FLIP), en naturlig caspase-8-hæmmer. A2780WT, A2780ADR og SKOV3 celler udtrykker lave niveauer af c-FLIP, c-FLIP

L bliver den eneste isoform påvises i disse celler (fig. 2 og fig. S2). I modsætning hertil, som det forventes, A2780WT FLIP, A2780ADR FLIP og SKOV3 FLIP udtrykker høje niveauer af c-FLIP

L (fig. 2 og fig. S2). C-FLIP

S var ikke målbart i alle disse cellelinjer (fig. S2).

Især i A2780WT, ADR og SKOV3 celler (Fig. 2,

venstre panel

s

) transficeret med tom vektor (PINCO), den eneste behandling med LBW242 eller TRAIL inducerer en moderat apoptotisk effekt, mens den kombinerede behandling af LBW242 med TRAIL inducerer en bemærkelsesværdig stigning i celledød. I de celler, der overudtrykker c-flip

L (fig. 2,

højre panel

s

) virkningen af ​​LBW242 behandling alene eller i kombination med TRAIL er meget hæmmet, hvilket understøtter den hypotese, at SMAC /DIABLO mimetiske kan handle gennem induktion af en caspase-8-aktivering pathway

til dette formål celler blev også behandlet med en pan-caspaseinhibitor zVAD, eller med en specifik caspase-8-hæmmer, zIETD.; i fig. 3 procentdelen af ​​celledød blev rapporteret. Som forventet zVAD beskytter celler fra den apoptotiske virkning af både enkelt- og kombinationsbehandlinger, hvilket således indikerer caspaseaktivering involvering i LBW 242 + TRAIL-medieret celledød. Desuden er det muligt at konstatere, at virkningen af ​​zIETD er sammenlignelig med den for zVAD, hvilket således indikerer en nøglerolle caspase-8-aktivering under den kombinerede virkning af LBW242 og TRAIL behandlinger (fig. 3,

venstre panel

s

).

LBW242 tilsat sammen med TRAIL induceret caspase-8-aktivering

Biokemiske analyser blev udført ved at undersøge ekspressionen af ​​forskellige proteiner involveret i den apoptotiske vej hos A2780WT PINCO, A2780ADR PINCO, SKOV3 PINCO og A2780WT FLIP, A2780ADR FLIP og SKOV FLIP cellelinjer behandlet som ovenfor nævnt. I fig. 4 A, B og C efter 24 timer behandlinger, er det muligt at bemærke, at XIAP niveauer ikke påvirkes af LBW242. Dette resultat er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser, at LBW242 hæmmer XIAP aktivitet, uden at påvirke dens udtryk [17] – [21]. Som forventet på baggrund af tidligere rapporter [17] – [21], LBW242 dramatisk downmodulates c-IAP1 niveauer, et fænomen tydeligt ses i alle cellelinjer, herunder dem overekspression c-flip

L. Behandling af ovarie cancer cellelinjer med LBW242 inducerede en virkning på c-IAP2 ekspression meget forskellig fra den observeret for c-IAP1. Faktisk 24 timers udsættelse af cellerne til LBW242 inducerede en klar upmodulation af c-IAP2 niveauer (fig. 4), i overensstemmelse med en tidligere rapport [31]. Da det forventes, gjorde c-flip

L overekspression ikke ændre virkningen af ​​LBW242 på c-IAP2 niveauer (fig. 4). På den anden side, TRAIL inducerede en moderat stigning af c-IAP2, en konstatering i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [32]. Navnlig c-FLIP overekspression forhindrede den stimulerende virkning af spor på c-IAP2 niveauer (fig. 4). Den kombinerede behandling med LBW242 og TRAIL resulterede i en markant upmodulation af c-IAP2 niveauer (fig. 4). Endvidere LBW242 inducerede ikke enten caspase-8, caspase-9 eller caspase-3-aktivering, som det kan udledes af fraværet af nogen væsentlig reduktion af procaspase-8, -9 og -3 niveauer og af forekomsten af ​​aktiv caspase spaltede fragmenter (se fig. 4 A til C og fig. S3). I overensstemmelse med disse resultater, LBW242 undladt at fremkalde spaltning af PARP, en følsom mål af aktiveret caspase-3 (fig 4A til C).

Når LBW242 blev lagt sammen med TRAIL markant forstærkede virkningen af ​​denne død ligand på caspase-8 og caspase-3-aktivering og på PARP-spaltning i A2780 WT, A2780 ADR og SKOV 3 cellelinier transficeret med de tomme vektorer, men ikke i dem, der overudtrykker c-FLIP

L (fig. 4 A til C) . Det er vigtigt at bemærke, at caspase-8-aktivering udløst af TRAIL og hovedsagelig af LBW242 + TRAIL, fører til at byde nedbrydning og således opnå aktivering af den indre apoptotiske vej (fig. 4 A til C). Bid nedbrydning blev næsten fuldstændig forhindret af c-FLIP overekspression (Fig. 4 A til C).

LBW242 forbedrede pro-apoptotiske effekt af lægemidler mod cancer på æggestokkene kræftceller

standard medicinsk behandling for kræft i æggestokkene indebærer i første omgang brug af Platin og taxol anticancer narkotika. Derfor virkede det af interesse at vurdere en mulig kooperativ virkning af nogle anticancer lægemidler, såsom cisplatin, taxol, topotecan, etoposid og doxorubicin i kombination med LBW242. I et første sæt eksperimenter vi behandlet således HEY-celler med cisplatin eller paclitaxel eller Topotecan eller etoposid eller doxorubicin, tilsat ved to doser, en lavere klinisk dosis svarende til den maksimale dosis observeret under infusion af disse lægemidler til kræftpatienter og en 5 gange højere supraclinical dosis, alene eller i kombination med et plateau dosis LBW242 (30 uM). Resultaterne af dette forsøg viste klart, at LBW242 kunne potensere de cytotoksiske virkninger af alle disse lægemidler (fig. 5A). Isobologram analyse viste synergistisk anti-tumor aktivitet LBW242 plus cisplatin (CI = 0,82) eller plus paclitaxel (CI = 0,70) eller plus Topotecan (0,72) eller plus etoposid (CI = 0,73) eller plus Doxorubicin (p = 0,78). I et andet eksperiment testede vi kapaciteten af ​​forskellige doser af LBW242 at øge cytotoksiciteten induceret af en klinisk dosis cisplatin, taxol eller topotecan. Dette forsøg viste, at LBW242 på en dosis-afhængig måde forøgede den cytotoksiske reaktion på disse lægemidler, nå de maksimale virkninger ved 20-30 pM doser (fig. 5B). Isobologram analyse viste synergistisk anti-tumor aktivitet LBW242 plus Topotecan (CI = 0,70) eller Taxol (CI = 0,71) eller cisplatin (CI = 0,82).

På baggrund af disse resultater, i et andet sæt eksperimenter, vi fokuseret vores opmærksomhed på kapacitet LBW242 at forstærke effekten af ​​Topotecan, et lægemiddel, der anvendes i æggestokkene kræftbehandling og er kendt som en potentiel caspase-8 aktivator [33].

i fig. 6A er det muligt at konstatere, at Topotecan udøver en markant pro-apoptotisk virkning ved kombination i kombination med LBW242 og TRAIL i A2780WT PINCO celler; den celledød af tumorceller forårsaget af disse midler, når de anvendes i kombination er stærkt inhiberet af pan-caspase inhibitor zVAD-fmk og derfor er hovedsageligt medieret gennem caspaseaktivering.

A2780WT FLIP celler den apoptotiske induktion udløst af associationen mellem LBW242, TRAIL og Topotecan er næsten fuldstændigt inhiberet, hvilket antyder en vigtig rolle af caspase-8 i induktion af tumorcelledød (fig. 6A).

er blevet bekræftet Disse observationer i SKOV3 PINCO og SKOV3 FLIP celler (fig. 6A). En rolle for caspase-8 aktivering i Topotecan-induceret død ovariecancerceller blev yderligere understøttet af eksperimenter af kvantificering af caspase-8 aktivering.