PLoS ONE: kliniske betydning af MIR-137 Expression i patienter med gastrisk kræft Efter Radikal Gastrectomy

Abstrakt

dysregulering af miR-137 spiller afgørende roller i onkogenese og progression af forskellige former for kræft, men dens rolle i prognosen af ​​mavecancerpatienter fortsat ukendt. Denne undersøgelse blev designet til at undersøge udtryk og prognostisk betydning af miR-137 i mavecancerpatienter efter radikal gastrektomi. Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) blev udført for at evaluere ekspressionen af ​​MIR-137 i humane gastriske cancercellelinier og væv hos patienter med gastrisk adenocarcinom. Resultaterne blev vurderet for samarbejde med kliniske faktorer og samlet overlevelse ved hjælp af Kaplan-Meier analyse. Prognostiske værdier af miR-137 udtryk og kliniske resultater blev evalueret af Cox regressionsanalyse. Resultaterne udviste at ekspressionsniveauet af MIR-137 blev reduceret i humane gastriske cancercellelinier og væv, og nedreguleret ekspression af MIR-137 var forbundet med tumorcelledifferentiering, N stadium og TNM fase. Nedsat miR-137-ekspression i mavekræft væv var positivt korreleret med dårlig samlet overlevelse af gastrisk kræftpatienter. Yderligere multivariat Cox regressionsanalyse foreslog, at miR-137-ekspression var en uafhængig prognostisk indikator for mavekræft bortset TNM stadie. Anvendelse af prognostiske værdi af miR-137 udtryk for TNM stadie III gruppe viste en bedre risiko lagdeling for samlet overlevelse. Som konklusion resultaterne forstærkede den kritiske rolle for nedreguleret MIR-137 ekspression i gastrisk cancer og foreslog, at MIR-137-ekspression kan være en prognostisk indikator for denne sygdom. Desuden kan disse patienter med TNM stadie III mavekræft og lav miR-137 udtryk brug for mere aggressiv postoperativ behandling og tættere opfølgning

Henvisning:. Gu Q, Zhang J, Hu H, Tan Ye, Shi S, Nian Y (2015) kliniske betydning af MIR-137 Expression i patienter med gastrisk kræft Efter Radikal gastrektomi. PLoS ONE 10 (11): e0142377. doi: 10,1371 /journal.pone.0142377

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Modtaget: 14. august 2015; Accepteret: 21 oktober 2015; Udgivet: November 6, 2015

Copyright: © 2015 Gu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kina er et af de lande med den højeste forekomst af mavekræft og tegner sig for over 40% af alle nye tilfælde på verdensplan [1,2]. Trods aggressiv terapi, er prognosen af ​​fremskreden mavekræft i Kina tendens til at være dystre [3,4]. På nuværende tidspunkt, tumor-node-metastaser (TNM) iscenesættelse system Union for International Cancer Control /amerikanske fælles udvalg om kræft (UICC /AJCC) er den vigtigste prognostiske faktor for mavekræft [5]. Men da der er heterogenitet på det molekylære niveau af gastrisk cancer, er det utilstrækkeligt at kun stole på TNM stadie at forudsige prognosen for gastrisk cancer [6]. Derfor identifikation af molekylære markører, der er prædiktive for mavekræft aggressivitet og prognose af patienten som supplement til TNM stadie har potentiale til at forbedre evnen til at behandle patienter og kunne give klinisk relevante indsigter af betydning i sygdomsbehandling. Desuden vælge patienter som vil kunne drage størst fra præcision behandling er tænkt som den bedste metode til at sænke satserne for dødeligheden af ​​mavekræft bortset kirurgi.

MikroRNA’er (miRNA) er små endogene 19-25 nukleotider ikke-kodende RNA, der regulerer genekspression posttransskriptionelt gennem baseparring med 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af mål-messenger-RNA’er (mRNA’er),, at resulterer i mRNA nedbrydning eller inhibering af translation [7]. I mange humane cancere, kan miRNA fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener til at undertrykke translation eller inducere mRNA nedbrydning afhængigt af arten af ​​deres mål [8]. Tidligere undersøgelser viste, at ekspressionen af ​​miR-137 er nedreguleret, og betragtes som en prognostisk markør i forskellige typer af kræft, herunder lungekræft [9], kolorektal cancer [10], ovariecancer [11], myelomatose [12] , gastrointestinal stromal tumor [13], glioblastoma [14], og pladecellecarcinom i hoved og hals [15]. Det blev for nylig vist, at MIR-137-ekspression blev signifikant reduceret i gastrisk cancer væv, og undertrykkelsen var takt med sværhedsgraden af ​​patologiske forandringer, hvilket tyder på potentiel tumor suppressor rolle MIR-137 i gastrisk cancer [16]. Imidlertid har en omfattende analyse af ekspressionen af ​​miR-137 i korreleret til prognosen for mavecancerpatienter ikke udført og afventer yderligere udredning.

Princippet Formålet med denne forskning er at vurdere forholdet mellem ekspressionen af ​​miR 137 og samlet overlevelse af gastrisk kræftpatienter i et forsøg på at identificere den prognostiske betydning af miR-137-ekspression. Resultaterne af denne undersøgelse udviser at ekspressionsniveauet af MIR-137 var nedregulering i gastrisk cancer celler og væv, og MIR-137-ekspression var en uafhængig prognostisk indikator for mavekræft.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev revideret og godkendt af Institutional Review Board of The Second Affiliated Hospital i Xian Jiaotong Universitet og The Tilknyttede Hospital i Yan’an Universitet (Shanxi-provinsen, Kina). Alle deltagere i studiet, eller deres værge, forudsat informeret skriftligt samtykke før studere indskrivning.

Cell kultur

Immortaliserede normale menneske gastrisk epitelcelle linje GES-1 og fem menneskelige gastrisk cancer cellelinjer, herunder MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803, og AGS blev opnået direkte fra Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Alle disse celler blev rutinemæssigt dyrket og opretholdt i RPMI-1640 (Gibco) dyrkningsmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) ved 37 ° C i en fugtig celle inkubator med en atmosfære af 5% CO

2.

Kliniske prøver

Friske gastrisk adenocarcinom væv og tilstødende normale væv blev indsamlet fra to uafhængige sæt bestående 154 patienter med gastrisk adenocarcinom. Alle de deltagende patienter i denne undersøgelse var gennemgik radikale gastrektomi (R0 resektion i henhold til UICC /AJCC og D2 lymphadenectomy). Enheder af træningssæt (n = 67) blev opnået fra januar 2005 og december 2009 fra Den Anden Tilknyttede Hospital i Xian Jiaotong Universitet (Shanxi-provinsen, Kina), samt aftryk af validering sæt (n = 87) blev opnået fra januar 2008 og december 2010 fra Tilknyttede Hospital i Yan’an Universitet (Shanxi-provinsen, Kina). Prøver blev lynfrosset i flydende nitrogen indtil anvendelse. Prøver blev revurderet af to patologer uafhængigt, og den fase af mavekræft er klassificeret i henhold til TNM stadie system UICC /[5] AJCC. Patienter blev udelukket, hvis de tidligere har været udsat for nogen målrettet terapi, strålebehandling, kemoterapi og /eller indgriben terapi for mavekræft.

QRT-PCR

Total RNA indeholdende miRNA blev ekstraheret fra dyrkede celler eller væv under anvendelse miRNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA blev syntetiseret under anvendelse miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Revers transskription blev udført under anvendelse af 50 ng samlet RNA med en primer specifik for MIR-137 sammen med SYBR Green microRNA revers transkription kit. miRNA blev kvantificeret under anvendelse af SYBR Green miRNA QRT-PCR assay ifølge producentens protokol (Applied Biosystems). Den QRT-PCR-reaktionen blev udført på en 7500 Fast realtid System (Applied Biosystems). Alle kvantitative RT-PCR’er blev udført tre gange. Data blev analyseret ved anvendelse af en automatiseret baseline. Tærskelcyklen (Ct) blev defineret som den fraktionerede cyklusnummer hvor fluorescensen overskred den givne tærskelværdi. De opnåede fra QRT-PCR data blev analyseret ved anvendelse af ΔΔCt fremgangsmåden (2

ΔΔCt). PCR-primerne, der benyttes her til MIR-137 er designet som følger: MIR-137 forward primer: 5′-GCGCGC TTATTGCTTAAGAATAC-3 ‘, og revers primer: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’. U6 blev anvendt som en intern kontrol og forstærkes med forward primer: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 ‘, og revers primer: 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’.

Statistisk analyse

Statistisk analyse var udført under anvendelse af GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) og SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Den samlede overlevelse blev defineret som tiden mellem den første dag i diagnose og datoen for kræft dødsfald eller den sidste opfølgende besøg. Pearsons χ

2 eller Fishers eksakte test blev anvendt til at analysere forholdet mellem MIR-137-ekspression og klinisk-patologiske faktorer. Kumulative overlevelsesrater blev beregnet ved Kaplan-Meier-metoden og forskellene mellem undergrupperne blev undersøgt ved log-rank test. Numre med risiko blev beregnet for begyndelsen af ​​hver periode. Den prognostiske værdi af miR-137-ekspression blev bestemt ved univariate og multivariate analyse. Alle P-værdier var tosidet, og P 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

Expression analyse af miR-137 i humane gastriske kræftceller

For. at fastslå ekspressionsniveauet af mIR-137 i humane gastriske cancerceller, vi først evalueret mIR-137-ekspression ved QRT-PCR i immortaliserede normal human gastrisk epitelcellelinie GES-1 og fem humane gastriske cancercellelinier, herunder MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803, og AGS. Som vist i fig 1A, de humane gastriske cancerceller udtrykte signifikant lavere niveauer af MIR-137 end GES-1. Kollektivt disse observationer antyder, at MIR-137-ekspression er nedsat hos gastriske cancerceller sammenlignet med den immortaliserede normal human gastrisk epitelcelle og nedsat MIR-137 ekspression kan være relateret til onkogenese af gastrisk cancer.

(A ) QRT-PCR-analyse for miR-137 ekspressionsniveauerne i udødeliggjort normal human gastrisk epitelcelle linje GES-1 og fem menneskelige gastrisk cancer cellelinier (MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803, og AGS). (B-C) Procenten af ​​patienter med lav MIR-137-ekspression øget ledsaget med sygdomsprogression fra TNM stadium I-III i (B) træningssættet (n = 67) og (C) Validering sæt (n = 87). * P. 0,05

Foreninger mellem miR-137 udtryk og clinicopathologic faktorer

De ekspressionsniveauerne af miR-137 blev yderligere målt til at analysere deres forhold til clinicopathologic faktorer. Patienterne blev inddelt i høj og lav ekspression gruppe efter forholdet mellem deres normale /cancer væv median ekspressionsniveauer af MIR-137 ifølge resultaterne af QRT-PCR (cut-off-forhold = 1,5). Og ifølge det kriterium, ca. 56,72% (Uddannelse sæt, 38 af 67), og 49,43% (Validering sæt, 43 af 87) tumorer blev scoret så lavt miR-137 udtryk. Som vist i tabel 1, blev ekspressionen af ​​MIR-137 signifikant associeret med tumorcelledifferentiering (P = 0,009 og P = 0,002, henholdsvis), N etape (P = 0,019 og P 0,001, henholdsvis), og TNM fase (P = 0,007 og P = 0,007, henholdsvis) i de to uafhængige sæt. Desuden i træningssættet, MIR-137 ekspression blev også signifikant relateret til T etape (P = 0,002). Desuden steg den procent af patienter med lav miR-137-ekspression ledsaget med sygdomsprogression fra TNM stadie I-III i de to uafhængige sæt (Fig 1B og 1C).

prognostiske værdi af miR-137 udtryk i patienter med mavekræft

for yderligere at undersøge den prognostiske værdi af miR-137-ekspression i mavecancerpatienter, vi sammenlignet den samlede overlevelse efter miR-137 udtryk, og blev udført Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. Som vist i figur 2, patienter med lav MIR-137-ekspression viste signifikant kortere samlet overlevelse end de høje dem i de to uafhængige sæt (P 0,001 og P 0,001, henholdsvis), hvilket indikerede en vital effekt af MIR-137-ekspression på kliniske resultat i gastrisk kræftpatienter. Desuden univariate analyser for samlet overlevelse i denne undersøgelse viste, at lave miR-137 udtryk er en signifikant negativ prognostisk prædiktor for patienter med mavekræft i træningssættet (hazard ratio [HR], 6,30; 95% CI, 2,17-18,27; P = 0,001) og validering sæt (HR, 3,74; 95% CI, 1,81-7,73; P 0,001). Desuden, tumorcelledifferentiering (P = 0,023 og P = 0,048, henholdsvis), T etape (P = 0,002 og P = 0,012, henholdsvis), N etape (P = 0,004 og P = 0,001, henholdsvis), TNM stadie (P 0,001 og P 0,001, henholdsvis) alle også væsentligt påvirket overlevelsen af ​​gastrisk cancer (tabel 2). Desuden blev Cox multivariat regression analyser udført for at udlede uafhængige risikofaktorer skøn relateret til den samlede overlevelse. Som det fremgår af nedenstående tabel 3, blev TNM stadie og miR-137 udtryk både anerkendt som uafhængige og væsentlige prognostiske parametre i de to uafhængige sæt (Training sæt: TNM stadie: HR, 12.83; 95% CI, 3.48 til 47,30; P 0,001; miR-137 udtryk: HR, 6,80; 95% CI, 2,06-22,48; P = 0,002; Validering sæt: TNM stadie: HR, 5,21; 95% CI, 2,04-13,31; P = 0,001; miR-137 udtryk: HR, 2,41; 95% CI, 1,13 til 5,11;. P = 0,023, henholdsvis)

Kaplan-Meier analyser af den samlede overlevelse efter miR-137-ekspression i (A) Uddannelse sæt (n = 67) og (B) Validering sæt (n = 87). P-værdi blev beregnet ved log-rank test. Vejviser

Stratificeret analyse på TNM stadie

For at bestemme om miR-137 udtryk kunne stratificere patienter med forskellig TNM stadie stratum, gjorde vi stratificerede analyser af mavecancerpatienter med TNM stadie i + II og TNM stadie III og evalueret den prognostiske værdi af miR-137 udtryk i de to uafhængige sæt hhv. Som anført i tabel 4, kun de gastriske cancerpatienter med TNM stadie III kunne stratificeres af MIR-137-ekspression betydeligt, prognosen for TNM stadie III mavecancerpatienter med høj MIR-137-ekspression var betydeligt bedre end dem med lav MIR-137 udtryk i de to uafhængige sæt (Uddannelse sæt: P = 0,006, Validering sæt: P = 0,016, henholdsvis fig 3)

Kaplan-Meier analyser af den samlede overlevelse efter miR-137-ekspression i. (A) Uddannelse sæt, TNM stadie I + II (n = 32), (B) Uddannelse sæt, TNM stadie III (n = 35), (C) Validering sæt, TNM stadie I + II (n = 37), og (D) Validering sæt, TNM stadie III (n = 50). P-værdi blev beregnet ved log-rank test.

Diskussion

Kina er stadig et af de lande med den højeste forekomst af mavekræft selv om det i mange industrialiserede lande er faldet i de seneste årtier, og fremskredent stadium sygdommen allerede er til stede i langt de fleste af patienterne [1,2,4]. I øjeblikket TNM af UICC /AJCC er den vigtigste prognostiske faktor for mavekræft [5]. Men da der er heterogenitet på det molekylære niveau af gastrisk cancer, er det utilstrækkeligt at kun stole på TNM stadie at forudsige prognosen for gastrisk cancer [6,17]. Derfor identifikation af molekylære markører, der er prædiktive for mavekræft aggressivitet og prognose af patienten som supplement til TNM stadie har potentiale til at forbedre evnen til at håndtere patienter og kunne give vigtige klinisk relevante indsigt i sygdomsbehandling. Desuden vælge patienter, som kunne gavne størst fra præcision behandling og målrettede behandlinger er tænkt som den bedste metode til at reducere dødeligheden af ​​mavekræft. Forskning om forholdet mellem miRNA og mavekræft har efterhånden fået opmærksomhed fra forskere i almen kirurgi feltet, og denne forskning er blevet et vigtigt forskningsemne i de senere år [7]. I den foreliggende undersøgelse vurderede vi ekspressionsniveauet af MIR-137 i humane gastriske cancercellelinier med kvantitativ real-time PCR, resultaterne udviste at de humane gastriske cancerceller, herunder MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC- 803, og AGS udtrykt signifikant lavere niveauer af mIR-137 end GES-1, som er en immortaliseret normal human gastrisk epitelcellelinje. Dette resultat indikerede, at unormal MIR-137 ekspression kan være relateret til onkogenese af gastrisk cancer. Men afklaring af underliggende mekanisme af dysregulering af miR-137 i mavekræft celler og væv venter, yderligere undersøgelser.

Samme med de andre miRNA, er det blevet rapporteret, at miR-137 var tæt korreleret med dannelsen og udviklingen af humane cancere [8,18]. Som vigtige komponenter i genregulering i mange humane cancerceller, kunne miR-137 regulerer forskellige gener og påvirke deres funktioner i mange cellulære veje. Celleproliferation og migration af brystcancer kunne undertrykkes ved MIR-137 ved at undertrykke østrogen relateret receptor a (ERRA) [19]. Mens der i colorektale cancerceller, ektopisk MIR-137-ekspression også kunne standse cellecyklus, undertrykke cellevækst og inhiberer celleinvasion ved at målrette celledeling kontrolprotein 42 homolog (Cdc42) [20]. For nylig, Wu et al. indikerede, at MIR-137 fungerede som tumorsuppressor på gastriske cancerceller ved målretning AKT2 og længere påvirker Bad og GSK-3β, og potentielt involveret i tumorgenese og metastase af gastrisk cancer [16]. Zheng og hans kolleger påviste, at ektopisk ekspression af MIR-137 var tilstrækkelig til at inhibere gastrisk cancer celleproliferation [21]. Desuden Steponaitiene R et al. udviste at MIR-137 methylering er en hyppig begivenhed i gastrointestinale cancere, som forekommer tidligt i trinvis måde under gastrisk carcinogenese og omvendt korrelerer med global methylering [22]. De ovennævnte undersøgelser bekræftede, at MIR-137 spiller en rolle, der ligner tumor suppressor miRNA. Men alle disse undersøgelser hovedsageligt udført i de gastriske cancer cellelinjer er forholdet mellem ekspressionsniveauet af MIR-137 og de kliniske karakteristiske faktorer af patienter med gastrisk cancer ikke klarlagt. I den foreliggende forskning, vi evaluerede forbindelsen mellem ekspressionen af ​​MIR-137 og prognose af patienter med gastrisk cancer efter radikal gastrektomi, og fandt, at MIR-137-ekspression var en uafhængig prognostisk faktor for den generelle overlevelse for patienter udover TNM stadie , og prognosen af ​​patienterne med lav mIR-137-ekspression var betydeligt ringere end dem med høj. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at identificere MIR-137-ekspression som en selvstændig dårlig prognostisk faktor for samlet overlevelse af mavecancerpatienter efter radikal gastrektomi. Baseret på denne forudsætning, at anvende den prognostiske værdi af miR-137 udtryk for TNM stadie III gruppe viste en bedre risiko lagdeling for samlet overlevelse hos patienter med sen-fase mavekræft. Dog bør den potentielle ændring af klinisk praksis valideres i et randomiseret kontrolleret forsøg i fremtiden.

Til dato, da miRNA udgør en spirende hotspot for kræftforskning, er der en stigende interesse med hensyn til miRNA svar til miljømæssige eksponeringer og livsstil, herunder social status, levevilkår og livsstil adfærd, såsom rygning og alkoholforbrug. Stanitz E et al. viste, at miR-21 og miR-143 var opreguleret, og miR-34a blev nedreguleret i prøver af gastrisk kræft i de vestlige lande [23]. I lyset af disse forhold, uanset om miR-137 underekspression også er observeret i mavekræft prøver af patienter fra vestlige lande skal vurderes i fremtiden. Desuden kunne mavekræft af samme histopatologi fra forskellige geografiske regionens befolkning viser differentierede miRNA og protein ekspressionsmønstre, som kan skyldes, at der findes forskellige risikofaktorer for carcinogenese.

Der er flere begrænsninger af denne undersøgelse. For det første er denne undersøgelse begrænset af retrospektiv karakter af analyse og udvælgelseskriterierne bias kan ikke helt udelukkes, selvom vi indsamlet data fra en fremadrettet vedligeholdt database. For det andet var der heterogenitet i de tærskelværdier, der anvendes til at bestemme cutoff af miR-137-ekspression i denne forskning. blev den mest konsekvent anvendes, men en række forskellige tærskler er blevet rapporteret medianværdier. For det tredje er der ikke omfattede data fra sygdomsfri overlevelse i denne undersøgelse. Der er mange faktorer, såsom de opfølgende undersøgelser og den postoperative behandling, kan påvirke den sygdomsfrie overlevelse. Og sygdomsfri overlevelse data skal indsamles på de fremtidige undersøgelser. Endelig antallet af patienter inkluderet i denne undersøgelse er relativt lille. Store prospektive randomiserede kontrollerede kliniske undersøgelser er nødvendige for at identificere den prognostiske værdi af MIR-137 ekspression i patienter med gastrisk cancer.

Sammenfattende resultaterne af denne undersøgelse viser, at MIR-137 er en lovende markør til at forudsige den samlede overlevelse af patienter med mavekræft efter radikal gastrektomi. Desuden kan disse TNM stadie III mavekræft patienter med lav miR-137 udtryk brug for mere aggressiv postoperativ behandling og tættere opfølgning.