PLoS ONE: Koordineret Aktivering af Candidate Proto-onkogener og Cancer testikler antigener via Promotor Demethylering i hoved- og halscancer og lungekræft

abstrakt

Baggrund

Epigenetisk rettelser er impliceret i patogenesen af ​​faste tumorer, dog protoonkogener aktiveres af promotor demethylering er sporadisk rapporteret. Vi brugte en integrativ metode til at analysere udtryk i primær hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) og farmakologisk demethylerede cellelinjer at identificere afvigende demethyleret og udtrykte kandidat proto-onkogener og kræft testikler antigener i HNSCC.

Metode /Principal resultaterne

Vi bemærkede koordineret promotor demethylering og samtidig transkriptionel opregulering af proto-onkogen kandidater med promotor homologi, og fylogenetiske fodaftryk af disse promotorer viste potentielle steder til transkription faktor BORIS anerkendelse. Aberrant BORIS ekspression korrelerede med opregulering af kandidat protoonkogener i multiple humane maligniteter herunder primære ikke-småcellet lungekræft og HNSCC, inducerede koordineret proto-onkogen promotor demethylering og ekspression i ikke-tumorigene celler, og transformerede NIH3T3-celler.

konklusioner /betydning

En koordineret, epigenetisk demaskering af flere gener med vækstfremmende aktivitet forekommer i aerodigestive kræftformer, og BORIS er impliceret i den koordinerede promotor demethylering og reaktivering af epigenetisk tavshed gener i humane kræftformer.

Henvisning: Smith IM, Glazer CA, Mithani SK, Ochs MF, Sun W, Bhan S, et al. (2009) Koordineret Aktivering af Candidate Proto-onkogener og Cancer testikler antigener via Promotor Demethylering i hoved- og halscancer og lungekræft. PLoS ONE 4 (3): e4961. doi: 10,1371 /journal.pone.0004961

Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope Medical Center, USA

Modtaget: Oktober 5, 2008; Accepteret: 3 februar 2009; Udgivet: 23 marts 2009

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. NIH T32 tilskud, Klinisk Innovator Award fra Flight Attendant Medical Research Institute, og National Cancer Institute SPORE (5P50CA096784-05 ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epigenetisk ændringer i promotor methylering og histonacetylering har været forbundet med kræft-specifikke udtryk forskelle i humane maligniteter.

methylering er primært betragtet som en mekanisme af tumorsuppressorgen (GTS) inaktivering, og omfattende hel-genom profilering tilgange til promotor hypermethylering har identificeret flere nye formodede GTS tavshed ved promotor hypermethylering.

Indirekte beviser understøtter en rolle for

hypo

methylering i tumor udvikling. Global genomisk hypometylering er blevet rapporteret i næsten alle solide tumorer [1] – [3]. Mus med funktionel forstyrrelse af DNA methyltransferase 1 (

DNMT1

) funktion demonstrerer betydelig genomisk hypometylering i alle væv og udvikle aggressive T-celle lymfomer med kromosomal ustabilitet [4]. I solide humane tumorer, meta-analyse viser en overordnet sammenhæng mellem global hypometylering og avanceret tumor stadie [3].

Til dato er blevet rapporteret kun sporadiske eksempler på promotor hypometylering forbundet med umaskeret udtryk for formodede onkogener, herunder :

R-Ras

i gastrisk kræft [5],

c-Neu

i transgene musemodeller [6],

Hox11

proto-onkogen i leukæmi [7] ,

BCL-2

gen hypometylering og højt niveau ekspression i B-celle kronisk lymfatisk lymfom [8], demethylering i MMTV /N-rasN transgene mus [9], og sjælden aktivering af to

RAS

familiemedlemmer i tyktarmskræft og småcellet lungecancer [10]. Disse observationer vise, at proto-onkogener med vævsspecifikke eller udviklingsmæssigt begrænset udtryk-dvs under tidlig vækst, differentiering, eller gametogenese-kan være uhensigtsmæssigt igen udtrykt i kræft via epigenetiske ændringer, herunder demethylering.

HNSCC er nyttigt som en fast tumor model, som følge af den etablerede rolle epigenetiske ændringer i dens patogenese [11], samt tilgængeligheden af ​​normale, minimalt transformerede cellelinier til anvendelse i gen-opdagelse strategier [12]. Brug farmakologisk demethylering i normal, minimalt transformerede orale keratinocyt cellelinier kombineret med Cancer Outlier Profil Analyse (COPA) i primære væv som en opdagelse tilgang, vi var i stand til at definere et sæt af kandidat proto-onkogener, der gennemgår afvigende demethylering og øget ekspression i primære humane tumorer. Salg

Funktionelle data og tidligere publicerede observationer antyder, at ekspression af disse gener er forbundet med tumor promotion. Yderligere analyser viste promotor homologi og koordineret opregulering i individuelle tumorer for undergrupper af disse målgener (proto-onkogener). Vi var i stand til at udvide disse observationer til en række solide tumortyper og implicere en central transskriptionsfaktor, BORIS, i koordineret epigenetisk aktivering af proto-onkogener. Disse data indikerer, at afvigende demethylering af flere, fysiologisk undertrykte proto-onkogener sker på en koordineret måde i individuelle tumorer fra flere solide tumorer typer.

Resultater

Integrativ Opdagelsen af ​​epigenetisk afsløret Gener i HNSCC

Vi antager, at normale cellelinier indeholder methylerede gener, der typisk undertrykt i normalt væv, men at disse gener kan genbruges udtrykkes af farmakologisk manipulation. En undergruppe af disse gener ville omfatte kandidat proto-onkogener aktiveres af demethylering i humane cancere, der yderligere kan udvælges på basis af primær tumor ekspression array analyse under anvendelse integrative metoder. Vi valgte at tilpasse kendte metoder til epigenetisk screening under anvendelse af 5-aza /TSA behandling, der har vist sig at være en succes i fastlæggelsen kandidat tumorsuppressorgener. To tert-transformerede normale oral keratinocyt cellelinier blev behandlet med 5 pM 5-aza deoxycytidin i fire dage og Trichostatin A i én dag forud for høst total RNA til ekspression array analyse under anvendelse dChip [12], [13].

Samtidig udførte vi en komparativ epigenetiske tilgang udnytter Cancer Outlier profilanalyse (COPA) ved hjælp af 49 primære HNSCC og 19 normale slimhinde væv analyseret for mRNA udtryk på Affymetrix U133A mRNA udtryk microarray platform (16,383 probe sæt) indsamlet fra tidligere arbejde og offentlig kilder til udtryk (oncomine.org). COPA er især nyttig til at bestemme forskelle i udtryk for bestemte gener i delmængder af primær tumor prøver, med forbedret ydeevne i forhold til statistiske værktøjer der er afhængige af median eller gennemsnit udtryk forskellen mellem to datasæt [14]. Vi beregnede COPA på 90

percentil for vores endelige placeringer af alle 16,383 funktioner i arrays, da det resulterede i de mest udtalte forskelle i udtryk med vores stikprøvestørrelse. Statistisk signifikans af udtrykket forskelle i COPA diagrammer blev målt ved Wilcoxon Rank Sum (figur 1B).

(a) I begyndelsen blev minimalt transformerede cellelinier behandlet med 5-aza-deoxycytidin og TSA til demaskere epigenetisk lyddæmpede gener. For at korrelere epigenetisk demaskering med meningsfulde opreguleres cancerspecifikke gener, udførte vi en komparativ epigenetiske tilgang med Cancer Outlier profilanalyse (COPA) under anvendelse 49 tumorer og 19 normale væv, der var blevet karakteriseret på Affymetrix U133A mRNA-ekspression microarray platform. Gener (ved probeset) blev rangeret først ved graden af ​​upfold regulering med 5-aza /TSA behandling og sekunder ved COPA opregulering ved 90

percentil. Produktet fra disse rækker blev anvendt til at rangere alle mål og et signifikansniveau tærskel (α = 0,005) blev valgt resulterede i 106 gener, som de øverste 26 gener blev evalueret. For ikke udelukke gener uden for U133A platform, vi også overvejet alle andre gener i U133 Plus 2.0 platform på alene på grundlag af 5-aza /TSA upfold regulering. Gener blev efterfølgende screenet ved tilstedeværelsen af ​​CpG øer ved hjælp MethPrimer og alle generne blev godkendt af bisulfit sekventering af tumor og normalt væv, og QRT-PCR af cellelinjer og primære tumorer. Af de integrative mål 7/26 bestået vores validering, mens 2/46 af de ikke-integrative mål bestået. Funktionelle eksperimenter blev derefter udført på disse gener. (B) Repræsentant COPA graf over

MAGEA3

demonstrere statistisk metode til at finde kandidat overudtrykt onkogener. Forskel i tumor (n = 49) versus normal (n = 19) ekspression var signifikant, p-værdi 0,001 målt ved Mann-Whitney U test. (C) Promotor demethylering forårsager transkriptionel opregulering. Opregulering efter behandling med 5-aza /TSA er vist i cellelinier som målt ved QRT-PCR. Forholdet mellem 5-aza /TSA behandlet udtryk til baseline er vist for

C19ORF28

,

H19

,

TKLT1

,

GPR17

,

GRIN1

,

MAGEA2

,

MAGEA3 /6

,

MAGEA4

,

MAGEA11

. Hvert gen viste signifikant opregulering af 5-aza /TSA behandling i mindst en cellelinje. Fejl søjler viser SE

Vi bestemt gen rækker på to måder:. 1) COPA ranking på 90

percentil af opregulering i den primære tumorvæv versus normale væv udtryk og 2) upfold regulering efter farmakologisk demethylering efter dChip normalisering i cellelinier.

en integrativ rang produkt blev beregnet (figur 1A). Ved hjælp af en signifikans tærskel (α = 0,005) og efterfølgende tilfældig permutation af vores rang-lister, vi identificeret 106 gener, der blev væsentligt differentielt opreguleres baseret på epigenetisk screening og væv microarray ekspression (tabel S1). Vi empirisk valgt den øverste scoring 26 gener for yderligere analyser. Sytten af ​​26 gener, der indeholder promoter-associerede CpG øer udnytte den MethPrimer software blev udvalgt til yderligere undersøgelser [15].

I en separat parallel analyse for at tage højde for mulige aktiverede proto-onkogener ikke indgår i U133A platform, vi analyseret 32.500 gener i U133plus2 platformen rangeret alene på grundlag af 5-aza /TSA upfold regulering i vores normaliserede cellelinier, der ikke indgik i primær tumor udtryk array analyse. Vi identificerede 46 målgener med . 2-fold opregulering ved 90% konfidensinterval og en gennemsnitlig forskel værdi udtryk i forhold til baseline over 50. Blandt disse 30 blev bekræftet at have CpG øer (tabel S2)

validering af tumorspecifik promotor demethylering af målgener

CpG-øer i promotorregionen af ​​de 47 udvalgte genmål med CpG-øer blev bisulfit sekventeret i normale mucosale prøver fra patienter uden en kræftdiagnose at bekræfte epigenetisk inaktivering i modne øvre aerodigestive tarmkanalen slimhinde (tabel S1 S2). Kun 18/47 promotorområder demonstrerede komplet methylering på alle sekventerede CpG websteder i alle normale væv. Disse mål blev efterfølgende bisulfit sekventeret i 10 primære HNSCC at undersøge for tilstedeværelsen af ​​hypomethylering. (Figur 2A). Af disse mål, 9/18 viste demethylering (se tabel 1) i tumorvæv i mere end 30% af prøverne, herunder

TKTL1

(4/10, s 0,05),

H19

(6/10, s 0,05),

MAGEA2

(5/10, s 0,05),

MAGEA3 /6

(5/10, s 0,05),

MAGEA4

(5/10, s 0,05),

MAGEA11

(5/10, s 0,05),

GPR17

(3/10, s 0,10),

GRIN1

(6/10, s 0,05),

C19ORF28

(5/10, s 0,05), (chi-squared). For at bekræfte transkriptionel opregulering af målgener med 5-aza /TSA behandling i vores cellelinje systemet (som ses i fig S1), udførte vi kvantitativ RT-PCR på 5-aza /TSA-behandlede normale celler sammenlignet med mock-behandlede celler til disse ni gener (figur 1C). Hvert gen viste signifikant opregulering af 5-aza /TSA behandling i mindst en cellelinje understøtter funktionelt gen regulering af promotoren hypometylering. Brug af den oprindelige kohorte af 10 primære tumorer, udførte vi en foreløbig analyse for at bestemme forholdet af promotor hypometylering til ekspression. QRT-PCR-ekspression med hydrogensulfit sekventering af den respektive promotor nedenfor er vist i figur 2b-j. Vi anvendte Mann-Whitney U test til sammenligning QRT-PCR ekspression af de methylerede og ikke-methylerede grupper. Tre gener havde statistisk signifikant øget udtryk i umethyleret gruppe:

MAGEA2

(p = 0,007),

MAGEA3 /6

(p = 0,007),

MAGEA11

(p = 0,05). Mulige sammenhænge mellem udtryk og promoter methylering status i denne lille gruppe blev også foreslået for

TKTL1

(p = 0,06),

MAGEA4

(p = 0,09),

C19ORF28

( p = 0,09),

GRIN1

(p = 0,06), men

H19 Hotel (p = 0,7), men

GPR17

(p = 0,38) viste ikke denne forening.

(a) Vist er de bisulfit sekventering resultater i 10 tumorer og 10 normaler til:

TKTL1

(4/10, s 0,05),

H19 Hotel (6 /10, s 0,05),

MAGEA2

(5/10, s 0,05),

MAGEA3 /6

(5/10, s 0,05),

MAGEA4

(5/10, s 0,05),

MAGEA11

(5/10, s 0,05),

GPR17

(3/10, s 0,10),

GRIN1

(6/10, s 0,05),

C19ORF28

(5/10, s 0,05). (B-j) QRT-PCR-ekspression med hydrogensulfit sekventering af den respektive promotor nedenfor (hvid er ikke-methyleret, grå er methyleret). Signifikans blev målt ved sammenligning af ekspression af methyleret til umethyleret af Mann-Whitney U test. Signifikans blev fundet i MAGEA2 (p = 0,007), MAGEA3 /6 (p = 0,007), MAGEA11 (p = 0,05). Stærke associationer mellem udtryk og promotor methylering status blev også fundet for TKTL1 (p = 0,06), MAGEA4 (p = 0,09), C19ORF28 (p = 0,09), GRIN1 (p = 0,06). H19 (p = 0,7) og GPR17 (p = 0,38) viste ikke associationer mellem bisulfit sekventering og udtryk i denne kohorte. Fejl barer skildrer standard fejl.

Funktionel validering af kandidatgener

Vi derefter foretaget transiente transfektioner at evaluere og /eller bekræfte vækstfremmende virkninger af disse ni mål, der viser tumorspecifik promotor hypometylering. Selvom H19 koder for en ikke-translateret RNA transkript, vises H19 produkt for at inducere vækst i lunge- og brystcancercellelinier [16] og kan inducere lægemiddelresistens i hepatocellulært carcinom [17]. Figur 3A viser resultater opnået ved transient transfektion af en

H19

konstruktion i OKF6-Tert-1R-celler. På fire dage, var der en 41,4% (± 15%) stigning i vækst i den transficerede tom vektor. MAGE-familien består af beslægtede familiemedlemmer, der vides at være opreguleret i en række forskellige tumortyper [18], men er for nylig blevet impliceret i induktion af transkriptionel omprogrammering i tumorceller [19].

MAGEA2

inducerede en 72,7% (± 26%) stigning i væksten på dag tre (figur 3B).

MAGEA4

transfektion inducerede en 203% (± 17%) stigning i vækst (figur 3D). Funktionelle forskelle vækst blev testet, men ikke fundet for

C19ORF28

.

(a) Forbigående transfektion af en

H19

konstruere ind OKF6-Tert-1R-celler (på dag 4 , 41,4% ± 15% stigning vækst). (B) Forbigående transfektion af en

MAGEA2

konstruere ind OKF6-Tert-1R-celler (på dag 3, 72,7% ± 26% vækst stigning). (C) Forbigående transfektion af en

TKTL1

konstruere ind OKF6-Tert-1R-celler (på dag 4, 50,1% ± 38% vækst stigning). (D) Forbigående transfektion af

MAGEA4

konstruere ind OKF6-Tert-1R-celler (på dag 4, 203% ± 17% vækst stigning). Til (e) vi udviklet en kvantitativ analyse til måling umethylerede initiativtagere, betegnes Quantitative Unmethylation-Specific PCR (QUMSP). QUMSP procentdel af

C19ORF28

,

GRIN1

,

H19

,

MAGEA11

,

MAGEA2

,

MAGEA3 /6

,

GPR17

, og

TKTL1

blev gennemført i en separat kohorte af hoved- og halscancer patienter, der bruger 25 tumorer og 11 øverste aerodigestive slimhinder prøver til analyse promotor demethylering. Statistisk signifikante forskelle blev fundet i

GRIN1

,

MAGEA11

,

MAGEA2

. Næste promotor demethylering blev betragtet som en årsag til mRNA ekspression stigninger i expo datasæt. (F) viser QUMSP resultaterne for en uafhængig kohorte af 14 lunge raske og 13 lunge tumor patienter. Væsentlige forskelle i QUMSP blev fundet i

H19

,

MAGEA11

,

MAGEA2

, og

MAGEA3 /6

.

i figur 3C,

TKTL1

inducerede en 50,1% (± 38%) stigning i væksten på dag fire. Forbedret ekspression af TKTL1 er for nylig blevet impliceret i omdannelsen af ​​celler til aerob, glycolytisk metabolisme samt øget proliferation i colon cancerceller [20] – [25]. TKTL1 er uafhængigt associeret med ringe overlevelse i larynx carcinoma, colon og urothelial cancere, samt fjernmetastaser i ovariecancer [22], [23], [26] For yderligere at bekræfte TKTL1 som kandidat proto-onkogen i HNSCC udførte vi vedhængende koloni fokus analyser i TKTL1 lav- udtrykke HNSCC cellelinjer JHU-011 og JHU-028, og fandt en betydelig vækst stigning i begge cellelinier (figur 4 A, B). Vi derefter beskæftiget shRNA konstruktioner i en TKTL1 højt udtrykkende cellelinie UM-22B i forankringsuafhængig vækst-assays, og noterede et dramatisk fald i størrelsen og antallet af kolonier (Figur 4 C, D) sammenlignet med mock-transficerede celler.

(a) TKTL1 tvungen overekspression via transient transfektion i baggrunden lav udtrykker JHU-011-celler inducerer øget forankringsafhængige kolonidannelse og (b) TKTL1 shRNA i high-udtrykkende FaDu cellelinien inducerer væksthæmning. (C) Anchorage uafhængig vækst af UM-22B-celler er signifikant inhiberet af TKTL1 shRNA (d), med fald i koloni størrelse. (* = P 0,01, ** = p 0,001, chi firkant).

Kandidat proto-onkogen ekspression og promoter demethylering i andre typer human cancer

For at bestemme om kandidat proto-onkogen ekspression blev ændret på en bredere vifte af tumortyper, analyserede vi udtryk data tilgængelige via Expo datasæt for 1041 humane tumorer i alle histologier [27]. Data, var første median-udtryk normaliseret ved hvert array derefter ved median normalisering af sonde sæt træk på tværs af de 1041 tumorer fra mange cancertyper, herunder lunge- og urotelial, men ikke HNSCC. Vi valgte en delmængde af disse tumorer, ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), lymfom, melanom, pancreascancer, prostatacancer, og urothelial cancere, til præsentation (figur 5A-D).

H19

var signifikant opreguleret i NSCLC (p = 0,008) og i urotelial cancer (p = 0,0013), som beregnet af Mann-Whitney U test sammenligner matrix-normaliseret ekspression i tumortype til alle andre tumorer. Vi bemærkede signifikant forøget ekspression af MAGEA2 i NSCLC (p = 0,005), men ikke i urothelial cancere (p = 0,18).

TKTL1

også viste overekspression i NSCLC (p = 0,05), men ikke urotelial cancer (p = 0,55), og

MAGEA4

blev overudtrykt i NSCLC (p = 0,04), men ikke signifikant, så i urotelial cancer (p = 0,12). For at bekræfte målspecifik demethylering bemærket i primære tumorer, vi udtænkt en hurtig, kvantitativ analyse for specifikt at måle ikke-methyleret promotorer, som vi betegnet Kvantitativ Unmethylation-specifik PCR (QUMSP). Femogtyve HNSCC tumorer og 11 øvre aerodigestive mucosale prøver blev analyseret for promotoraktivitet demethylering (figur 3E). Tumorspecifik demethylering blev fundet i

GRIN1

(p = 0,005),

MAGEA11

(p = 0,001), og

MAGEA2

(p = 0,002). Vi udførte en tilsvarende analyse ved hjælp af en separat, uafhængig kohorte af 13 NSCLC prøver med 14 lunge prøver fra patienter uden neoplastisk sygdom og bekræftet promotor hypometylering i målgener. Signifikante forskelle på

H19 Hotel (p = 0,02),

MAGEA11

(p = 0,03),

MAGEA2

(p = 0,005) og

MAGEA3 /6

(p = 0,02). Se figur 3F.

EXPO datasæt repository blev brudt for tumorvæv genekspression målt ved Affymetrix U133 Plus 2,0 mRNA udtryk platform. Oprindeligt data var median-normaliseret ved ekspression array og hvert gen var median normaliseret for dette tal. Kun undergrupper af ikke-småcellet lungecancer, lymfom, melanom, pancreascancer, og urotelial cancer vises. (A) viser ekspressionen af ​​

H19

i disse kræftformer. (B)

MAGEA2

udtryk, (c)

TKTL1

udtryk, og (d)

MAGEA4

. Statistisk signifikans blev målt i hver tumortype ved sammenligning af genekspression i tumoren type ekspression i alle de resterende 1041 prøver. Tumor typer uden p-værdier ikke nærme statistisk signifikans. Lung og urotelial viste signifikant udtryk overlap.

afvigende ekspression af kandidat proto-onkogener sker på en koordineret måde i de enkelte primære tumorer

I løbet af disse analyser, vi hurtigt bemærket, at transkriptionel opregulering via promotor hypometylering tendens til at forekomme synkront i en undergruppe af tumorer. I vores kohorte af 49 primære HNSCC analyseret via ekspression array analyse, konstruerede vi en matrix af Pearsons korrelationskoefficienter mellem ekspressionsniveauerne af hvert mål (figur 6A). For vores ni målgener blev betydelig klyngedannelse af forøget ekspression noteret i MAGEA familien af ​​gener. H19 blev ikke medtaget på grund af sit fravær på U133A platformen. En separat klynge af tilhørende overekspression blev noteret for

TKTL1

,

GRIN1

, og

GPR17

. Fra NSCLC udtryk data fra Expo datasæt vi skabt lignende matricer til at undersøge sammenhænge mellem de enkelte gener. Vi bemærkede, at MAGEA familie udtryk og

H19

udtryk viste særdeles signifikante sammenhænge i enkelte NSCLC (se figur 6B). I modsætning hertil var der ingen mål for målgruppen korrelationer for NSCLC udtryk for den anden klynge (

TKTL1

,

GRIN1

, og

GPR17

), der udviste koordineret ekspression i HNSCC.

(a) viser genekspression korrelation p-værdi matrix til co-ekspression for hvert gen par på tværs af alle tumorer. Denne sammenligning viser korrelationen mellem hvert gen par i 49 hoved- og halskræft. (B) Gene pair ekspression p-værdi korrelation matrix for 80 NSCLC. Af note C19ORF28 ikke er flisebelagt på dette array platform. (C) Analyse af promotorregioner for generne. Vist er en Fylogram af vores initiativtagere til interesse baseret på ClustalW analyse efter justering multipel sekvens. Regionen signifikant homologi vises efter sekvens alignment og E statistik fra EMBL-EBI s PromoterWise sammenligning. (D) Promotor hypometylering (QUMSP) korrelation p-værdi matrix for HNSCC (25 tumorer). (E) Promotor hypometylering (QUMSP) korrelation p-værdi matrix for NSCLC (13 tumorer).

Expression mønstre korrelerer med promotor homologi for promotor demethyleret målgener

Vi derefter ønskede at bestemme, om promotor homologi var forbundet med den sammenkædede ekspression af de to protoonkogen klynger. Vi bruges efterfølgende European Bioinformatics Institute ClustalW værktøj (figur 6C) for Fylogram analyse efter multipel sekvensalignment af de respektive promotorer. For at bekræfte homologi kvantitativt, brugte vi EMBL-EBI s PromoterWise sammenligning værktøj, der findes betydelige parvise områder af promotor homologi i

GPR17

,

GRIN1

, og

TKTL1

. Som forventet fra tidligere undersøgelser, at MAGE-En familie klynge, som MAGE-A familiemedlemmer og H19 er kendt for at have konsensus-bindingssteder for methylering følsomme bindende faktorer

CTCF

CTCFL

/

BORIS

. Desuden er denne anden gruppe af

GRIN1

,

GPR17

, og

TKTL1

grupperet sammen af ​​sekvenshomologi.

Endelig ønskede vi at se, om graden af ​​promotor hypometylering var korreleret i individuelle tumorer. For både primær HNSCC (figur 6D) og NSCLC (figur 6E), blev der flere signifikante korrelationer mellem methylering status findes mellem mål, men methylering status ikke klynge i grupper defineret af MAGE-En familie /H19 udtryk klynge eller af

TKTL1

,

GRIN1

,

GPR17

klynge. Snarere var der signifikante korrelationer mellem alle identificerede kandidat proto-onkogener. Hypomethylering derfor synes at forekomme i et beslægtet måde i individuelle tumorer for alle målgener, men den samtidige ekspression af gener i de to klynger var forbundet med promotor homologi snarere end methylering status. Dette indebar, at specifikke transkriptionelle faktorer kan være involveret i reguleringen af ​​epigenetisk demaskering og /eller transkriptionel aktivering baseret på promotor homologi blandt disse kandidat proto-onkogener.

BORIS udtryk er forbundet med proto-onkogen aktivering i primære tumorer, inducerer promotor demethylering, kandidat proto-onkogen udtryk, og transformation celle

Den indlysende tilstedeværelsen af ​​flere MAGE gener blandt vores mål fik os til at studere opstrøms regulatoriske veje for kendte kræft-testis-antigener. BORIS og CTCF er en unik sammenhørende par af transkriptionelle faktorer involveret i epigenetisk regulering, der deler en identisk DNA-bindende domæne. BORIS er transkriptionelt til tavshed i de fleste normale væv, men udtrykt i normal embryonale, kim celle, og kræft væv. Vi bestemmes, hvis udtryk for BORIS korreleret med kandidat proto-onkogen udtryk i en separat kohorte af 36 primære HNSCC. Figur 7A præsenterer en zonekort konstrueret af median normaliserede, QRT-PCR udtryk data fra vores proto-onkogener, sorteret efter BORIS udtryk. I disse 36 kræftformer, blev BORIS overekspression signifikant korreleret til overekspression af 6/9 proto-onkogener herunder:

MAGEA3 /6

(p = 0,0017),

MAGEA4

(p = 0,04),

MAGEA11

(p 0,001),

GPR17

(p = 0,01), og

C19ORF28

(p = 0,001). For yderligere at undersøge korrelationen mellem BORIS udtryk med vores målgener i solide kræftformer, analyserede vi EXPO datasæt data for 1041 humane tumorer i en bred vifte af væv kilder og histologier. Signifikant positiv korrelation af BORIS udtryk med udtryk for hver af vores ni proto-onkogener blev bemærket:

GRIN1

(p 0,001),

C19ORF28

(p 0,001),

H19

(p 0,001),

MAGEA11

(p 0,001),

MAGEA2

(p 0,001),

MAGEA3 /6

(p = 0,003),

MAGE4

(p 0,001),

TKTL1

(p 0,001),

GPR17

(p 0,001), (figur S2). Selv BORIS transkripter er normalt påvises i normale celler, bestemte vi, at 59% af alle tumorer har en BORIS niveau, der overstiger median ekspression af alle generne, og 90% af tumorer har en BORIS ekspressionsniveau 25% af medianen udtryk værdi for alle gener, hvilket indikerer, at afvigende BORIS udtryk er en fælles begivenhed i human cancer.

(a)

BORIS

udtryk korrelerer med udtryk for målgener i HNSCC (QRT-PR) zonekort (Pearson korrelation) (b) Forbigående transfektion af

BORIS

konstruktion i NIH-3T3 og OKF6-Tert1R cellelinier.

BORIS

overekspression medført øget cellevækst i 3T3-cellelinien (på dag 3, 77% ± 34% vækst stigning) og i OKF6-Tert1R cellelinie (på dag 3, 161% vækst ± 78% øge). Cell vækst baseline beregnes ved at dividere værdier ved dag 1 s Calcein signal. (C) Anchorage uafhængig vækst blev analyseret efter transfektion med tom vektor (EV), CTCF, og BORIS ved forskellige koncentrationer af doxycyclin, med repræsentative koloni (nedenfor). (D) QUMSP ni mål af interesse efter transfektion med tom vektor (ubehandlet) og BORIS konstruktion (behandlet) i nærvær af 0,0625 ug /ml doxycyclin. (E) Fold øge Quantitiative RT-PCR af ni mål af interesse efter BORIS transfektion normaliseret til værdier efter transfektion med tom vektor.

For at udforske de funktionelle og epigenetiske effekter af BORIS, tetracyklin inducerbare pBIG2i-BORIS konstrukter blev forbigående transficeret ind i NIH-3T3 og OKF6-Tert1R cellelinier i nærvær af doxycyklin, hvilket resulterer i forøget adhærerende cellevækst i vildtype, BORIS ikke-udtrykkende NIH3T3, og OKF6-Tert1R cellelinier. 3T3-celler havde en 77% ± 34% vækst stigning på dag tre. OKF6 cellelinjer havde en 161% ± 78% vækst stigning på dag tre (Figur 7B). Vigtigere, blev disse virkninger ses, når niveauet af

BORIS

udtryk blev reguleret til at være magen til de niveauer, der findes i primære tumorer.

Denne effekt blev ikke set med forøgede koncentrationer af doxycyclin, der inducerede høje niveauer af

BORIS

udskrifter. En analyse af udskrifter viste, at ekspressionen af ​​syv af ni målgener blev øget betydeligt i OKF6-Tert1R celle udtrykker BORIS (figur 7E). For at teste om BORIS udtrykt ved lave niveauer kan bidrage til transformation, studerede vi NIH3T3-celler for forankringsuafhængig vækst. Efter 12 dage blev et betydeligt antal kolonier (30 +/- 3) observeret i test af BORIS-udtrykkende celler, men ikke i celler transficeret med et kontrolplasmid (Figur 7C).

Endelig, for at teste muligheden at BORIS kan være forbundet med epigenetiske ændringer samt transkriptionel opregulering af vores målgener, vi kvantitativt analyseret for methylering status for vores kandidat proto-onkogener efter BORIS transfektion og bemærkede, at seks ud af ni mål (C19 ORF28, GPR17, GRIN1, MAGEA2 , MAGEA3 /6, og MAGE11) viste en stigning i demethyleret promotor større end 100% så tidligt som 48 timer efter induktion af BORIS (figur 7D).

diskussion

De data præsenteret ovenfor, peger at HNSCC og NSCLC gennemgår aktivering af kandidat proto-onkogener med tilhørende demethylering på en koordineret måde i individuelle tumorer. Vi var i stand til at påvise transformation-associerede virkninger af BORIS udtryk ektopisk i BORIS-negative cellelinjer samt vækst effekter med individuelle målgener der har vist sig at være epigenetisk aktiveret og udtrykt af BORIS. Det betyder dog ikke udelukke bidrag endnu uidentificerede gener til BORIS relaterede effekter eller et andelsselskab virkning mellem identificerede målgener.