PLoS ONE: Syndecan-3 og TFPI Colocalize på overfladen af ​​endothel, Glat muskel- og Kræft Cells

Abstrakt

Baggrund

Tissue faktor (TF) pathway inhibitor (TFPI) eksisterer i to isoformer; TFPIα og TFPIβ. Begge isoformer er celleoverfladen knyttet primært gennem glycosylphosphatidylinositol (GPI) ankre. TFPIα er også blevet foreslået at binde andre overflademolekyler, som glycosaminoglycaner (GAG). Celleoverfladen TFPIβ er blevet vist at udøve højere antikoagulerende aktivitet end TFPIα, hvilket antyder alternative funktioner for TFPIα. Yderligere karakterisering og søge efter nye TFPI bindende partnere er afgørende for helt at forstå de biologiske funktioner af celle associeret TFPI.

Metoder og Resultater

Potentiel sammenslutning af TFPI til heparansulfat (HS) proteoglycaner i syndecan familie blev vurderet ved vælte undersøgelser og flowcytometri-analyse. Celle overflade colokalisering blev vurderet ved konfokal mikroskopi, og nativ PAGE eller immunpræcipitering efterfulgt af Western blotting blev anvendt til at teste for protein-interaktion. Heparanase blev anvendt til enzymatisk nedbryde celleoverflade HS GAG’er. Antikoagulerende potentiale blev evalueret ved anvendelse af en faktor Xa (FXa) aktivitetsassay. Knock ned af syndecan-3 i endotel, – glatte muskel- og bryst kræftceller reducerede TFPI overflade niveauer med 20-50%, og en sammenslutning af TFPIα at syndecan-3 på celleoverfladen blev demonstreret. Western blotting viste, at TFPIα blev fundet i kompleks med syndecan-3. Den TFPI bundet til syndecan-3 ikke hæmmer FXa generation. Fjernelse af HS GAG ikke frigive TFPI antigen fra cellerne.

Konklusioner

Vi viste en sammenhæng mellem TFPIα og syndecan-3 i vaskulære celler og i cancerceller, som ikke synes at afhænge på HS GAG. Nr antikoagulerende aktivitet blev detekteret for TFPI forbundet med syndecan-3, hvilket kan indikere koagulations- uafhængige funktioner for denne celleassocieret TFPI pool. Dette vil dog kræve yderligere undersøgelser

Henvisning:. Tinholt M, Stavik B, Louch W, Carlson CR, Sletten M, Ruf W, et al. (2015) Syndecan-3 og TFPI Colocalize på overfladen af ​​endothel, Glat muskel- og kræftceller. PLoS ONE 10 (1): e0117404. doi: 10,1371 /journal.pone.0117404

Academic Redaktør: Aamir Ahmed, University College London, England

Modtaget: Januar 13, 2014 Accepteret: December 23, 2014; Udgivet: januar 24, 2015

Copyright: © 2015 Tinholt et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: Dette arbejde blev finansieret af forskningsbevillinger fra det sydøstlige Norge Regional Health Authority, Hamar, Norge og A. Jahre og HG Andrine Berg søn fonde. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

vævsfaktor (TF) pathway inhibitor (TFPI) er den endogene inhibitor af TF-induceret blodkoagulation, og det eksisterer i to isoformer; TFPIα og TFPIβ. Begge isoformer udøver antikoagulerende aktivitet ved at binde til de aktive steder af TF-faktor VIIa (FVIIa) kompleks og til faktor Xa (FXa) [1, 2]. Endotelceller udgør størstedelen af ​​TFPI produktion, men TFPI ekspression er også blevet påvist i andre celletyper, såsom monocytter, glatte muskelceller, blodplader [3-5], og i flere brystcancercellelinier [6, 7].

TFPIα består af tre tandem Kunitz-hæmmende domæner, og en meget positivt ladet C-terminale ende [8], hvorimod TFPIβ indeholder de første to Kunitz-domæner efterfulgt af en anden C-terminus koder for et glycosylphosphatidylinositol (GPI) fastgørelse signal peptid, lede det til celleoverfladen [1, 9]. På grund af disse forskelle, er TFPIβ udelukkende bundet til cellemembranen, mens TFPIα kan enten secerneres til det ekstracellulære miljø, eller være bundet til celleoverfladen via en endnu ikke identificeret GPI koblet molekyle, og i nogen grad til heparansulfat (HS ) proteoglycaner (HSPGs) [9-12]. Funktionen af ​​celleoverflade associeret TFPI er ikke velkendt har imidlertid TFPIβ blevet foreslået at være ansvarlige for størstedelen af ​​den antikoagulerende aktivitet på celleoverflader, hvilket indikerer en alternativ rolle cellebundet fuld-længde splejsningsvariant TFPIα [2]. Yderligere undersøgelse af celleoverfladen associeret TFPI og formodede bindende partner (e) er derfor af afgørende betydning for den funktionelle forståelse af dette molekyle.

HSPGs er molekyler, der stikker ud fra cellemembraner eller ekstracellulære matrix. Der er to store familier; de Syndecan og glypican familier, der består af fire og seks genvarianter, hhv. Ekspressionsmønsteret af HSPGs er stærkt reguleret i en developmental-, spatial-, og celletype specifik måde [13]. Syndecans er transmembrane proteiner, mens glypicans er GPI-forankrede proteiner mangler direkte cytoplasmatisk forbindelse. Både glypicans og syndecans holde glycosaminoglycaner (GAG), hovedsagelig HS kæder, der er kovalent forbundet til proteinet kerne [13, 14]. HS kæder er af stor funktionel betydning, eftersom de interagerer med og binder til et bredt spektrum af biologiske effektor proteiner, såsom kemokiner, vækstfaktorer og ekstracellulære matrixbestanddele. Gennem disse interaktioner, HSPGs deltager i mange essentielle cellulære handlinger, såsom celleadhæsion, proliferation, differentiering og migration. HSPGs kan modulere ligand-receptorbinding ved at koncentrere cytokiner i umiddelbar nærhed af deres høje affinitet receptorer, eller funktion som co-receptorer og dermed fremme effektiv signaltransduktion [14, 15]. HSPGs kan også være involveret i patofysiologi, herunder malignitet. Modulationer af sulfateringen mønster af HS kæder har vist sig at forbedre vækstfaktor bindende og fremskynde proliferation i cancerceller [16].

Det er blevet foreslået, at HSPGs kan fungere som receptorer for internaliseringen af ​​TFPI-FXa-komplekser i endotelceller, der bidrager til den antikoagulerende effekt af TFPI [17]. Endvidere TFPI er blevet vist, at binde til glypican 3 i leverceller [18], og syndecan 4 oprenset fra endotelceller [19]. Kunitz-domæne 3 og den C-terminale ende af TFPIα er nødvendige for optimal binding til endotelcelle overflader [20, 21] og hepatomceller [22], hvilket tyder på, at kun den TFPIα isoform associerer med HSPGs.

Siden er det blevet foreslået, at TFPI kan være forbundet med HSPGs [17-19], vi lige yderligere at karakterisere beskaffenheden af ​​cellebundet TFPI. Dette blev udført ved at evaluere ekspressionen af ​​syndecans 1-4, og bindingen potentiale endogent udtrykte TFPI til syndecans på celleoverfladen af ​​primære humane endothel og glatte muskelceller, og basal brystcancerceller.

Materialer og Metoder

Etik Statement

N /A

Reagenser

Lyddæmper negativ kontrol siRNA # 5 (AM4642) blev købt fra Ambion (Foster City, CA, USA). Specialdesignede siRNA’er mod syndecans blev produceret af Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Tyskland) (S1 tabel). Kanin-anti-humant vævsfaktorinhibitoren IgG 4901 /ADG72 og rekombinant fuldlængde TFPI (ADG49) blev opnået fra American Diagnostica (Stamford, CT, USA). Gede-anti-TFPIα ab9881 og kanin-anti-syndecan-3 ab63932 var fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Kanin-IgG-UNLB og gede anti-kanin IgG (H + L) -RPE var begge fra Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL, USA). Anti-syndecan-3 (sc-30.883), anti-syndecan-3 (sc-9495), den syndecan-3 293T-kontrol lysat (sc-176304), normal gede-IgG (sc-2028), anti-actin (SC- 1616), og A /G agaroseperler (sc-2003) blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology, USA. Rekombinant syndecan-3 (3539-SD), det sekundære antistof anti-gede-IgG HRP (HAF109), og rekombinant human Active Heparanase (7570-GH) var fra R # CC-2585, Lot ingen 6F4194, Lonza.) [7] blev cultered i EBM-2 (Lonza). Alle førnævnte celle medier med supplementer er blevet beskrevet tidligere [7]. De humane glatte muskelceller koronar arterie (HCASMC;. # CC-2583, Lot ingen 3F0172, Lonza) [23] blev dyrket i SmBM basalt medium med SmGM-2 Enkelt Quots vækstfaktorer og 10% FCS. Celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære og 5% CO

2.

QRT-PCR

Analyser for de fire syndecans blev designet ved hjælp af Universal Probe Bibliotek, Probe Finder software (Roche Applied Sciences). Probe ID og primersekvenser er tilvejebragt i S2 tabel. cDNA (19 ng) blev amplificeret i triplikater ved kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) med 100 nM probe og 200 nM primere (Eurogentec). En kunstig negativ kontrol uden syndecanekspression (Ct = 40), og et endogent kontrol (18S) Ct-værdi fastsat til gennemsnittet af alle celletyper tjente til at beregne den relative mRNA mængde (RQ) af syndecans ved ΔΔCt metoden. For en mere detaljeret beskrivelse henvises til vores tidligere publikation [7].

Små forstyrrende (si) RNA transfektion

Baseret på tidligere optimering eksperimenter, celler blev transficeret med siRNA rettet mod syndecan 1 -4, under anvendelse af lipofectamin 2000 i overensstemmelse med producentens anbefalinger. Kort sagt blev celler podet i 6-brønds eller plader med 12 brønde for at nå 30-50% konfluens den følgende dag og transficeret med 5 eller 2,5 ug lipofectamin og 1 eller 0,5 nmol siRNA, i et samlet volumen på 2 eller 1 ml frisk medium, henholdsvis. Lipofectamin-holdigt medium blev erstattet med frisk medium 5 timer efter transfektion. Celler lodes vokse i 2-3 dage før analysen.

Flowcytometri

Celler med forbigående vælte af syndecans blev analyseret for celleoverflade binding af et TFPI specifikt antistof, i det væsentlige som tidligere beskrevet [7]. Forskelle i TFPI celleoverflade niveauer blev beregnet og præsenteres som procent reduktion i forhold til at styre celler (middelværdier ± SD) baseret på median fluorescens intensitetsværdier. De mediane fluorescensværdierne for celler mærket med det irrelevante kaninantistof blev betragtet som uspecifik binding, og blev korrigeret for i hver enkelt prøve. Celler transficeret med negativ kontrol siRNA og mærket med irrelevant anti-kanin-antistof tjente til bestemmelse af baggrundsniveauet når histogram plots blev skabt (benævnt “irrelevant”). Syndecan-3 celleoverflade niveauer blev bestemt på samme måde ved hjælp af en syndecan-3 specifikt antistof.

Heparanase og heparinase behandling

For at nedbryde celleoverflade HS GAG, sammenflydende celler i 12-brønds bakker blev vasket to gange med PBS før behandlet med heparanase (1 ug /ml) eller heparinase i + III (2U /ml) i serumfrit medium (SFM) i 4-16 timer. SFM indeholdende det passende vehikel puffer tjente som kontrol. Efter behandling blev supernatanter opsamlet, og celler blev vasket to gange før lysis. Virkningen af ​​heparinase behandling blev bekræftet ved Western blotting under anvendelse af D-heparansulfat antistof, som genkender HS neo-epitoper genereret ved spaltning af HS af heparinase I + III.

Konfokal mikroskopi

Celler blev podet på sterile lamininovertrukne objektglas og inkuberet natten over ved 37 ° C. Den følgende dag blev celler vasket tre gange i PBS og fikseret i 10 minutter i 4% paraformaldehyd, standset i 15 minutter i 100 mM glycin (pH 7,4), og vasket tre gange før blokering i 2 timer i høj blokerende opløsning (0,9% NaCl, 0,5% Na

3Citrate, 3% BSA og 40 ng /pl human γ-globulin) med konstant hældning. Efterfølgende blev cellerne inkuberet med 5 ug /ml gede-anti-TFPI-antistof (ab9881), specifik for TFPIα, i en lav blokerende opløsning (0,9% NaCl, 0,5% Na

3Citrate, 1% BSA og 40 ng /ul humant y-globulin) i 4-5 timer. Celler blev vasket fem gange i PBS inden de inkuberet i 1,5 time med 1: 1500 Alexa Fluor 488 æsel-anti-gede-antistof, vasket igen fem gange og inkuberet med 5 ug /ml kanin-anti-syndecan-3-antistof (ab63932) natten over ved 4 ° C under konstant vipning. Den næste dag blev cellerne vasket fem gange, og til sidst inkuberet med 1: 1500 Alexa Fluor 633 Gede-anti-kanin-antistof i 1,5 time. Alle antistof-inkubationer blev udført ved 4 ° C. Celler blev scannet under anvendelse af et LSM 710 konfokalt mikroskop (Zeiss, GmbH, Jena, Tyskland) med en 40x vand nedsænkning mål. Den TFPI signalet blev ophidset ved 488 nm, med emission målt mellem 500-600 nm. Den syndecan-3 signal blev ophidset ved 633 nm, med emission målt over 640 nm. Pinhole bredde blev fastsat til en Airy enhed, og billeder blev indsamlet med en optisk skive tykkelse på 1 um. Konfokal billeder blev de-foldes for at kompensere for den optiske forvrængning ved at ansætte Huygens Essential software (Scientific Volume Imaging B.V .; Laapersveld, Holland). Billeder blev analyseret og præsenteres efter den billede J-programmet (version 1.4.3.67).

Lysis buffere og immunopræcipitationsforsøg

Sum102 celler, HCAECs og HCASMCs blev høstet i Triton lysis buffer (20 mM HEPES , pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, 0,2% aprotinin, 0,6% 100 mM phenylmethylsulfonylfluorid PMSF og 1,0% phosphatase inhibitor cocktail) for nativt (ikke-reducerende) PAGE analyse og for immunopræcipitationseksperimenter (reducerende betingelser).

2 ug anti-syndecan-3 eller normal gede-IgG (negativ kontrol) blev tilsat til hver cellelysat og inkuberet i immunpræcipitering natten over ved 4 ° C. Immunkomplekserne blev opsamlet ved protein A /G-agaroseperler og vasket tre gange i Triton lysepuffer før kogning i SDS-påsætningsbuffer efterfulgt af SDS-PAGE analyse.

PAGE analyser og immunoblotting

Protein celle lysater, immunopræcipitater og rekombinant TFPI-protein (100 ng) blev analyseret på præfabrikerede 4-15% Kriterium Tris-HCI-geler (# 345-0028, BioRad Laboratories) med (reducerende) eller uden 0,1% SDS (ikke-reducerende betingelser) i Tris /Glycine /SDS (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS, pH 8,3, # 161-0772,) eller Tris /Glycine rindende puffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, pH 8,3, # 161-0771, BioRad Laboratories), hhv. En indfødt prøve buffer (# 161-0738, BioRad Laboratories) blev anvendt til ikke-reducerende betingelser. Proteiner blev blottet på PVDF-membraner (RPN 303F, GE Healthcare), som blev blokeret i 1% casein i TBST i 60 minutter ved stuetemperatur, inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer, vasket tre gange 10 minutter i TBST og inkuberet med en peberrod-peroxidase-konjugeret sekundært antistof. Blots blev udviklet ved hjælp af ECL Prime (RPN 2232, GE HealthCare). De kemiluminescerende signaler blev detekteret ved Las 1000 (Fujifilm, Tokyo, Japan). Immunoblotter af immunpræcipitater blev strippet i 30 minutter mellem antistoffer. For nativ PAGE blev to identiske immunoblots kørt parallelt for at sikre specifikke signaler fra anti-TFPIα og anti-syndecan-3. Derefter immunoblots blev strippet i 45 minutter (Pierce) og testet igen for at bekræfte, at antistofferne genkendte et protein kompleks af identisk størrelse. ImageJ blev anvendt til densitometrisk kvantificering af proteinbånd på immunoblots.

TF-FVIIa aktivitet

HCAEC og Sum102 celler blev transficeret med siRNA mod syndecan-3 (48 timer) i 12-brønds plader som beskrevet ovenfor. Celler blev vasket to gange i vaskeopløsning (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 4 mM KCl og 11 mM glucose, pH 7,5) og inkuberet i 1 time ved 37 ° C i reaktionsopløsningen (vaskebuffer med 5 mg /ml BSA og 5 mM CaCI

2, pH 7,5) indeholdende 10 nM FVIIa og 175 nM FX. Efter inkubation blev 50 pi overført til 100 pi stopopløsning (50 mM Tris HCI, 150 mM NaCl, 25 mM EDTA og 1 mg /ml BSA, pH 7,5) på is før inkuberet med 50 pi FXa-substrat (CS-11 ( 22)). Absorbansen ved 405 nm blev registreret ved 37 ° C i 45 minutter ved 15 sek intervaller under anvendelse af en Spectra Max Plus 384 mikropladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). De maksimale hastigheder (V

max) i mU /min blev anvendt til at beregne mængden af ​​FXa genereret ved hjælp af en standardkurve opnået med kendte koncentrationer af FXa. HCAEC celler blev behandlet med PMA (10 nM, 6 timer) før assayet at inducere TF ekspression. A ~ 600-fold opregulering af TF mRNA niveauer blev bekræftet under anvendelse QRT-PCR.

Statistiske metoder

Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af GraphPad Prism software version 5.0 (PRISM5) (GraphPad Software Inc, LaJolla , CA). Students t-test blev udført for at teste for signifikante forskelle, når data normalt fordelte. Ellers blev den ikke-parametriske Mann Whitney U test anvendes. * P 0,05, ** p 0,01 og *** p. 0,001

Resultater

Expression niveauer af syndecans i TFPI-udtrykkende celler

HSPGs der tidligere har været rapporteret til at binde TFPI. I søgen efter potentielle TFPI bindende kandidater blev mRNA ekspressionsniveauerne af syndecans 1-4 bestemt i et udvalg af TFPI-udtrykkende celler. Ekspressionsniveauerne for varierede betydeligt mellem de tre celletyper testede syndecans; HCAEC, HCASMC, og Sum102 (fig. 1). De syndecans blev udtrykt i alle cellelinjer, og ekspressionsniveauerne af syndecan-3 og 4 udviste den mindste variation blandt cellerne.

Sum102, HCAEC og HCASMC celler blev analyseret for mRNA-ekspression af syndecan 1-4 ved QRT-PCR. Den ΔΔCt metode blev anvendt til at beregne den relative ekspression (RQ) mod gennemsnitlig endogen kontrol ekspression blandt alle cellerne, og tærsklen blev fastsat til Ct = 40 (ingen amplifikation). Middelværdier + SD (n = 3 biologiske paralleller) præsenteres.

Effekt af syndecan banke ned på celleoverfladen niveauer af TFPI

For at undersøge, om de syndecans kunne være potentielle TFPI celleoverfladen bindende kandidater blev siRNA anvendte teknologi. Efter transient banke ned af syndecans 1-4 blev cellerne lov til at binde en TFPI specifikt antistof efterfulgt af farvning med en RPE-bundet sekundært antistof og flowcytometri-analyse.

Ingen signifikant fald i celleoverflade niveauer af TFPI blev observeret for nogen af ​​de celletyper efter banke ned af syndecan 1, 2 eller 4 (data ikke vist). I modsætning hertil syndecan-3 banke ned i HCAECs, HCASMCs, og Sum102 celler faldt celleoverflade niveauer af TFPI med 52 ± 9%, 23 ± 6%, og 39 ± 12% (gennemsnit ± SD), henholdsvis (fig. 2). Knock ned effektiviteten af ​​de syndecans i siRNA transficerede celler blev bekræftet af QRT-PCR og beregnet som procent banke ned i forhold til kontrol-celler transficeret med negativ kontrol siRNA. De vælte effektivitet varierede mellem 69-97% for syndecan 1, 45-85% for syndecan 2, 83-95% for syndecan-3, og 44-72% for syndecan 4 (S1 Fig.). Endvidere syndecan-3 vælte blev bekræftet ved Western blotting i alle celletyper (fig. 3A), og en 32 ± 13% (middelværdi ± SD) reduktion i Syndecan-3 antigenniveauer på celleoverfladen efter syndecan-3 knock ned blev påvist ved flowcytometri i HCAEC (fig. 3B).

Celler væltes syndecan-3 ved siRNA teknologien blev analyseret for niveauer af celleoverfladen TFPI ved flowcytometri. Histogrammet præsenterer median fluorescensintensitet opnået efter TFPI specifikt antistof mærkning i A) Sum102 celler, B) HCAEC celler og C) HCASMC celler. Syndecan-3 bankede ned celler (siSDC3); stiplet linie, negative kontrolprøver siRNA; sort optrukne linje og irrelevant kontrol; gråt faststof linje. Et repræsentativt eksperiment af tre individuelle eksperimenter (n≥6 biologiske paralleller) er vist for hver celletype.

A) Syndecan-3 antigen niveauer (55 kDa monomere form) i cellelysater fra HCAECs Sum102 celler og HCASMCs ved Western blotting ved anvendelse af anti-syndecan-3 og ladningskontrol (actin). En repræsentativ membran af to er vist. Syndecan-3-protein båndintensiteter (efter normalisering mod ladningskontrol) i forhold til kontrol-celler er vist for hver celletype. Rekombinant syndecan-3 (rSDC3) fungerede som en positiv kontrol (~ 110 kDa). B) Cell overflade associeret Syndecan-3 niveauer analyseret ved flowcytometri i HCAEC celler. Histogrammet viser median fluorescensintensitet opnået efter syndecan-3-specifikt antistof mærkning. Syndecan-3 bankede ned celler (siSDC3); mørkegrå skygge, negativ kontrol siRNA; mellemgrå skyggefulde og irrelevant kontrol; lysegrå skraverede. Et repræsentativt eksperiment af to individuelle eksperimenter (n = 4 biologiske paralleller) vises.

Hverken heparanase (S2 Fig.) Og heller ikke heparinase I + III (data ikke vist) behandling af Sum102, HCAEC og HCASMC celler ændret TFPI antigenniveauer i cellesupernatanter sammenlignet med kontrolceller.

Virkning af TFPI banke ned på syndecan-3-mRNA-ekspression

Knock ned af syndecan-3 påvirkede ikke TFPI mRNA ekspression (fig. 4A) eller TFPI proteinniveauer (fig. 4B). Ikke desto mindre blev udført forsøg for at vurdere, om en ensrettet reguleringsmekanisme eksisterede. Den syndecan-3 mRNA-ekspression blev reduceret med en middelværdi på 30% i tre separate puljer af Sum102 celler, hvor begge TFPI isoformer blev stabilt slået ned (TFPI vælte effektivitet var 40-60%, som beskrevet i Stavik

et al

. 2011 [6]). Ingen forskelle i syndecan-3 mRNA ekspression niveauer blev opdaget, når kun TFPIβ isoform blev slået ned (fig. 5) (den TFPIβ vælte effektivitet var 53% og 64% for shRNA7b og shRNA 9b henholdsvis). I HCAEC og HCASMC celler, blev detekteret en 48% og 43% reduktion af syndecan-3-mRNA-ekspression i celler med 88-94% forbigående TFPI (α + β) knock down (48 timer). Endvidere vælte af TFPIα isoform alene (TFPIβ ekspression forblev upåvirket) i Sum102 celler (72 timer) og HCAECs (48 timer) resulterede i en respektiv 34% og 53% reduktion af syndecan-3-mRNA-ekspression. Den TFPI vælte effektivitetsgevinster af alle celletyper anvendte vist i S3 Fig.

A) HCAEC, Sum102 og HCASMC celler med syndecan-3 slået ned blev analyseret for TFPI mRNA-ekspression ved QRT-PCR. Den ΔΔCt metode blev anvendt til at beregne den relative TFPI ekspression (RQ) sammenlignet med kontrolceller (neg. Kontrol siRNA). Middelværdier + SD (n≥6 biologiske paralleller) af tre individuelle eksperimenter præsenteres. B) TFPI antigen niveauer blev målt ved ELISA i cellelysater fra HCAEC, Sum102 og HCASMC efter syndecan-3 vælte. TFPI antigenniveauer forhold til kontrol celler er vist. Middelværdier + SD (n≥6 biologiske paralleller) af to individuelle forsøg er vist.

Syndecan-3-mRNA-ekspression blev målt ved QRT-PCR i tre uafhængige stabile kloner med begge isoformer af TFPI (a + p) slået ned (shRNA 4, 6 og 7), og to uafhængige stabile kloner med kun TFPIβ isoform slået ned (shRNA7β og 9β). Resultater blev normaliseret mod endogen kontrol og relative udtryk (RQ) blev beregnet i forhold til de tomme vektor kontrolceller (pSiRPG). Middelværdier + SD (n = 3 biologiske paralleller) præsenteres.

TFPI og syndecan-3 colokalisering

For yderligere at undersøge om den reducerede binding af celleoverfladen TFPI skyldtes en direkte virkning af syndecan-3 vælte, undersøgte vi, om TFPIα og syndecan-3 colocalized på celleoverfladen. Colokalisering blev bekræftet ved hjælp af dobbelt farvning og konfokal mikroskopi i Sum102, HCAEC, og HCASMC celler. Den colokalisering blev ikke ensartet fordelt, snarere koncentreret til trange steder af cellemembranen (fig. 6, S4 fig., Og S5 fig.).

Fikserede celler blev farvet med dobbelt TFPI (grøn) og syndecan- 3 (rød) primære antistoffer og Alexa Fluor sekundære antistoffer med 488 og 633 nm excitationsbølgelængder henholdsvis før billeder blev taget med konfokal mikroskopi. Gul farve i overlay billederne demonstrerer rumlige overlap mellem TFPI og syndecan-3. Sum102 celler (top), HCAEC celler (midten) og HCASMC celler (nederst). Scale bar 50 pm (30 pM for zoomede billeder). Et repræsentativt eksperiment af tre individuelle eksperimenter er vist for hver celletype.

Identifikation af en TFPI-syndecan-3 proteinkompleks

Selv om konfokal billedbehandling foreslog, at TFPIα og syndecan-3 opholdt på samme fysiske placering (fig. 6, S4 fig., og S5 fig.), nativ PAGE efterfulgt af efterfølgende Western blotting blev udført for at teste for en interaktion mellem de to molekyler (fig. 7A). I proteinlysater fra Sum102, HCAEC, og HCASMC celler, to proteinkomplekser migrerer ved tilsyneladende masser af ~ 150 kDa og ~ 180 kDa blev anerkendt af både anti-TFPIα og anti-syndecan-3 (fig. 7A). De to komplekser sandsynligvis skyldes forskellige posttranslationelle modifikationer, såsom glycosylering. Svagere bånd blev observeret for HCAEC celler, hvilket afspejler de lavere proteinkoncentrationer anvendt. De relativt store størrelser af de observerede komplekser viste, at TFPIα (fig. 7B, 45 kDa) var til stede med den dimeriserede form af syndecan-3, som har en omtrentlig størrelse på 110 kDa (fig. 7C). De størrelse skøn skal dog tolkes med en vis forsigtighed, da ikke-reducerende (native) betingelser blev anvendt, og også fordi præcis adskillelse af højmolekylære komplekser ved elektroforese i almindelighed er udfordrende.

Proteinlysater blev isoleret fra celler, der udsættes for nativ PAGE-analyse eller immunopræcipitationsforsøg og analyseret ved Western blotting. A) Native PAGE af lysater fra Sum102 celler (20 ug), HCAECs (12 ug) og HCASMCs (18 ug) immunoblottedes med anti-TFPIα (øverst) og anti-syndecan-3 (nederst) (en repræsentant membran ud af tre er vist), B) SDS-PAGE af fuldlængde rekombinant TFPIα protein immunoblottedes med anti-TFPIα, og C) SDS-PAGE af syndecan-3 293T-kontrol lysat immunoblottedes med anti syndecan-3. D) HCAEC (40 ug), E) SUM102 (160 ug) og F) HCASMC (40 ug) lysater blev underkastet immunpræcipitation under anvendelse af to forskellige Syndecan-3-antistoffer (n = 2 for sc-30.883, n = 1 for SC- 9495) eller kontrol gede-IgG (n = 2). Lysater og immunopræcipitater blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​endogen syndecan-3 og TFPI ved immunoblotting. Rekombinant TFPIα protein (øverste venstre panel) og cellelysat (nederste venstre panel) blev anvendt som positiv kontrol for immunblotting i D-F.

TFPI-syndecan-3 interaktion blev også analyseret ved immunopræcipitation. Immunopræcipitation af syndecan-3 fra HCAEC lysat under anvendelse af to forskellige Syndecan-3-antistoffer afslørede samtidig udfældning af TFPI (fig. 7D), hvilket antyder, at TFPI forbundet med syndecan-3. I overensstemmelse med det native PAGE-analyse (fig. 7A), TFPI-syndecan-3-kompleks var også til stede i SUM102 (fig. 7E) og HCASMC lysat (fig. 7F), selv om TFPI udfældning optrådte noget svagere.

TFPI fordeling efter syndecan-3 banke ned

for at etablere skæbne TFPI i syndecan-3 mangelfulde celler, blev TFPI antigen målt ved ELISA i supernatanten af ​​Sum102 og HCAEC celler efter banke ned af syndecan -3. Dette resulterede i en stigning 20-30% af TFPI antigenniveauer i supernatanten sammenlignet med kontrolceller (fig. 8).

TFPI antigenniveauer (total) blev målt ved ELISA i supernatanter fra Sum102 (venstre) og HCAEC (højre) efter syndecan-3 vælte. Relative TFPI antigenniveauer sammenlignet med kontrolceller er vist. Middelværdier + SD (n≥9 biologiske paralleller) af to (HCAEC) og tre (Sum102) individuelle eksperimenter præsenteres.

TF-FVIIa aktivitet på overfladen af ​​syndecan-3 vælte celler

for at undersøge, om TFPI bundet til syndecan-3 kunne arrestere TF koagulerende aktivitet, vi målte TF-FVIIa aktivitet på overfladen af ​​Sum102 og HCAEC celler før og efter forbigående banke ned af syndecan-3. TF-FVIIa-aktivitet blev bestemt indirekte ved kvantificering af FXa genereres i en kolorimetrisk analyse, hvor FVIIa og FX blev eksogent tilsat til adhærente celler. Ingen ændringer i FXa generation efter syndecan-3 banke ned blev observeret i nogen af ​​de to celletyper (fig. 9). Som forventet blev et ~ 2 gange stigning i TF-FVIIa-aktivitet observeret efter tilsætning af anti-TFPI til analysen (positiv kontrol).

Sum102 og HCAEC celler bankede ned af syndecan-3 (siSDC3) var analyseret for TF-FVIIa celleoverfladen aktivitet, indirekte, som FXa generation. HCAEC celler blev stimuleret med 10 nM PMA i 6 timer inden analyse. Anti-TFPI blev sat til et eksperiment med HCAEC celler. Middelværdier + SD (n≥8 biologiske paralleller) af tre individuelle eksperimenter præsenteres.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse har vi påvist en sammenslutning af endogent udtrykte TFPI til transmembrane syndecan-3 HSPG molekyle. Vores tilgang har været at vælte ekspressionen af ​​HSPGs tilhører den syndecan familien, og at analysere de TFPI antigen overflade niveauer ved flowcytometri. Vi valgte endothel, glat muskel- og brystcancerceller med høj endogen TFPI ekspression til undersøgelse. De syndecanekspression niveauer varierede mellem disse celletyper i overensstemmelse med, at HSPG ekspression afviger i en celle type- og udviklingsmæssig specifik måde [13, 24]. Reducerede celleoverflade niveauer af TFPI blev påvist ved flowcytometri efter syndecan-3 banke ned i alle tre celletyper, hvilket indikerer involvering af syndecan-3 i celleoverfladen sammenslutning af TFPI. Desuden faldt syndecan-3 mRNA-ekspression i HCAECs og Sum102 celler med TFPIα slået ned, og i Sum 102 celler med både TFPI isoformer (α + β) slået ned, men ikke TFPIβ alene, støtter yderligere en relation mellem syndecan-3 og TFPI, specifikt TFPIα isoformen. Om dette er en direkte eller indirekte regulering er endnu ikke klarlagt.

Tidligere syndecan 4 oprenset fra EA.hy926-celler er blevet vist at binde TFPI i en fastfase-assay [19]. Så vidt vi ved, vi hermed give den første rapport om TFPI association til en syndecan molekyle på celleoverfladen.