PLoS ONE: IQGAP3 Fremmer EGFR-ERK Signaling og vækst- og metastaser af Lung Cancer Cells

Abstrakt

Proteiner af IQGAP familien display kompliceret og ofte modstridende aktiviteter i tumorigenese. IQGAP1 har veldokumenteret onkogent potentiale og IQGAP2 har formodet tumor-undertrykkende funktion. IQGAP3 er den seneste tilføjelse til denne familie og forbliver sin rolle i udviklingen af ​​kræft, der skal defineres. Her demonstrerer vi IQGAP3 udtryk markant forøget i lungekræft væv på både mRNA og protein niveauer. Overekspression af IQGAP3 forfremmet tumorcellevækst, og migration og invasion, mens knockdown af IQGAP3 udstillet modsatrettede effekter. Endvidere undertrykkelse af IQGAP3 i en lungecancer-cellelinie forårsagede en reduktion i tumorigeniciteten af ​​disse celler i lungevæv efter intravenøs injektion. Desuden viste vi, at IQGAP3 er i stand til at interagere med ERK1 og styrke sin phosphorylering efter behandling med EGF. Disse data tyder på, at IQGAP3 kan bidrage til patogenesen af ​​lungekræft ved at modulere EGFR-ERK signalering

Henvisning:. Yang Y, Zhao W, Xu QW, Wang XS, Zhang Y, Zhang J (2014) IQGAP3 Fremmer EGFR-ERK Signaling og vækst- og metastaser af Lung Cancer Cells. PLoS ONE 9 (5): e97578. doi: 10,1371 /journal.pone.0097578

Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: Februar 20, 2014 Accepteret: April 21, 2014; Udgivet: 21. maj 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde modtaget støtte fra National Basic Research Program Kina (2011CB946103), National Naturvidenskab Foundation of China (31.330.025 og 30.830.091), Beijing Municipal Natural Science Foundation (7.122.104) og 111 Projekt Kina (B07001). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft indtager førstepladsen i kræft dødelighed både i Kina og på verdensplan [1], [2]. I Kina er der ca. 300.000 nye lungekræft tilfælde og mere end 250.000 dødsfald fra denne sygdom hvert år [3]. Histologisk så mange som 85% af lungekræft er ikke-småcellet lungekræft typen (NSCLC), og størstedelen af ​​disse er enten adenocarcinom eller pladecellecarcinom [4] – [7]. Som lungekræft kan være okkulte, de fleste patienter er ubrugeligt og har metastaser til regionale lymfeknuder eller til fjerne steder på tidspunktet for diagnosen. De NSCLC patienter med fjernmetastaser overleve i kort tid (fra 9 til 12 måneder) [5], [8]. Der er derfor et presserende behov for at optrævle de molekylære mekanismer, der fører til invasion og metastase i lungekræft [9], [10]. Sådanne oplysninger vil lette udviklingen af ​​nye behandlingsformer tillader forbedring af resultatet i patienter med lungecancer [11], [12].

Terapeutiske tilgange mod EGF eller EGFR repræsenterer en lovende retning for lungekræft terapi [13], [14]. EGFR udtrykkes i normale celler i epidermal, mesenkymale og neurogen oprindelse, og dets aktivering er strengt kontrolleret i normale væv [15], [16]. Men bindingen af ​​EGFR efter dets ligand resulterer i receptor homo- eller heterodimerisering og aktivering af dets indre tyrosinkinaseaktivitet [17]. Downstream signaleringskaskade er derfor indledt, i sidste ende fører til ændringer i sådanne celle adfærd som proliferation, migration og differentiering [15], [16]. Vigtigt er konstitutiv aktivering af EGFR eller forøget signalering EGF hyppigt findes i forskellige kræfttyper, især i lungekræft, hvor det er forbundet med cancer initiering, tumorvækst /progression, metastase og dårlig prognose [17] – [20].

IQGAP familie af proteiner er godt bevaret i organismer fra gær til pattedyr [21]. Det består af tre medlemmer, IQGAP1, IQGAP2 og IQGAP3 [22] – [24]. Blandt disse IQGAP1 er den bedst undersøgte [25]. Navnet IQGAP er afledt af de multiple funktionelle domæner disse molekyler harbour såsom fire IQ motiver og en RasGAP-relateret domæne (GRD) [26], [27]. IQGAP1 indeholder også formodede coil-coil homodimerisering domæner, et tryptophan repeat motiv (WW) med ukendt funktion, en calponin-homologidomæne (CHD) der interagerer med F-actin, og en RasGAP_C-terminus (RGCt), som interagerer med talrige proteiner, herunder E-cadherin og β-catenin [27]. IQGAP1 er blevet foreslået at fungere i regulering af cytoskelettet og cellevandring [28] – [30]. Der er også beviser, som indikerer IQGAP1 spiller en rolle i cancer progression [31], [32]. Derimod IQGAP2 synes at virke som en tumorsuppressor [33]. IQGAP3 er den seneste tilføjelse til denne familie [24]. Foreliggende data tyder på, at det er involveret i proliferation af epitelceller [34], [35], men dens rolle i tumorigenese er endnu ikke fastslået. I den aktuelle undersøgelse, giver vi den første bevis på, at IQGAP3 fremmer lungekræft vækst og metastase ved at styrke EGFR-medieret ERK signalering. IQGAP3 kan derfor spille en rolle, der svarer til IQGAP1 i tumorigenese.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af de etiske komitéer i Peking University Health Science center (Beijing, Kina) og den 306. Hospital i Folkets Befrielseshær i Kina (Beijing, Kina). For dyreforsøg, blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse og når observeret lidelse var for stor, blev human eutanasi brugt. Skriftligt samtykke blev opnået fra individuelle patienter til anvendelse af vævsprøver.

cellelinier og patientprøver

A549 og Hela-celler blev dyrket i RPMI 1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Life Technologies , Carlsbad, CA, USA). HEK293T celler blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum. Celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære.

I cellesignalerende assays blev celler serum berøvet (0,5% føtalt bovint serum) i 16 timer forud for stimulering med 100 ng /ml EGF (Peprotech, Rockville, NJ, USA) for forskellige længder af tid som angivet.

25 parrede lunge tumorvæv og tilstødende normale vævsprøver blev opnået fra 306. Hospital af Folkets Befrielseshær i Kina.

plasmider og transfektion

Myc-pCAGGS-IQGAP3 og kontrol pCAGGS vektorer blev venligst stillet til rådighed af Dr. Kozo Kaibuchi. HA-mærket ERK1 eller ERK2 udtrykke vektorer blev konstrueret ved hjælp af standard molekylære teknikker og verificeret ved sekventering.

Celler blev transficeret med jetPRIME transfektion reagens (POLYPLUS transfektion, Illkirch, Frankrig).

siRNA transfektion og lentiviral Infektion

Små interfererende RNA oligonukleotider (oligoer) mod IQGAP3 eller kontrol siRNA oligonukleotider blev opnået fra GenePharma Co., Ltd (Shanghai, Kina). Målretningsindstillingerne sekvenser af disse siRNAs var som følger: si IQGAP3-1:5′- GAGCCAACCAGGACACUAA-3 ‘; si IQGAP3-2:5’- GGCAGAAACUAGAAGCAUA-3 ‘; kontrol siRNA: 5’- UUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ‘. siRNA oligoer (50 nM) blev transficeret ind A549 celler med jetPRIME transfektionsreagens.

Alternativt siRNA target sekvensen blev klonet ind lentivirusvektoren pLL3.7. Efter sekvensverificering blev shRNA plasmid og pakkevektorer psPAX2 og PLP /VSVG transficeret i pakkende cellelinie HEK293T hjælp jetPRIME. Mediet blev skiftet 8 timer efter transfektion. 48 timer senere blev viral supernatant høstet og inkuberet med A549-cellelinien i nærværelse af 8 pg /ml polybren (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). For stabilt transficeret udvælgelse cellelinje blev GFP-fluorescens anvendt som en sortering markør. Celler med . 75% infektion effektivitet blev brugt til yderligere analyse

Reverse transkriptase-PCR og Real-time PCR

TRlzol (Life Technologies) blev anvendt til at isolere total RNA og derefter omvendt transskriberet til cDNA ved revers transkription System (Promega, Madison, WI, USA). Kvantitativ realtime PCR blev udført på en Bio-Rad Real-Time PCR-system. Sekvenserne af realtime primere til IQGAP3 var som følger: fremad, 5′-GTTCATCCATAGAGCCTGCCA-3 ‘; omvendt, 5’-GCGATGCTCTCACCAATAAGG-3 ‘. De realtime primere til GAPDH er blevet beskrevet før [36]. Genekspression blev kvantificeret som udbyttet af IQGAP3 forhold til den for GAPDH.

Immunfældning og Western blot-analyse

Myc-IQGAP3 og HA-ERK1 eller HA-ERK2 konstruktioner blev transficeret i HEK293T celler. Celler blev høstet og lyseret i lyseringspuffer med proteinase inhibitor cocktail (Roche, Basel, Schweiz) og phenylmethylsulfonylfluorid. Derefter cellelysaterne blev inkuberet med muse-anti-HA-mAb (Sigma-Aldrich), anti-Myc-mAb (Sigma-Aldrich) eller et kontrolantistof (mlgG) (Sigma-Aldrich) og protein-A sepharose (GE Healthcare, USA) og opløst ved SDS-PAGE. For endogen immunopræcipitation blev cellelysat fremstillet ud fra A549-celler og immunopræcipiteret med kanin-anti-ERK1 mAb (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA).

I western blot-analyse, lige store mængder af protein fra hver prøve blev indlæst og løses med SDS-PAGE og overført til blots. Efter blokering blev blots probes med angivne antistoffer og evalueres med Odyssey Imaging System (LICOR Bioscience, Lincoln, NE, USA). Anvendte antistoffer omfattede anti-GAPDH (Bioworld Technology, Inc., St. Louis Park, MN, USA), anti-IQGAP3 (Sigma-Aldrich), anti-ERK (Cell Signaling, Beverly, MA, USA), anti-phospho-Erk

Thr202 /Tyr204 (Cell Signaling), anti-phospho-p38

Thr180 /Tyr182 (Cell Signaling), anti-phospho-Akt

Ser473 (Cell Signaling), anti-Myc og anti-HA.

tissue microarray og Immunhistokemi

En lungekræft væv microarray (TMA) blev købt fra Chaoying Biotechnology Co. (Xi’an, Kina). Snit blev inkuberet med anti-IQGAP3 antistof (1:50 fortynding) natten over ved 4 ° C. Det primære antistof blev identificeret under anvendelse af et peberrodperoxidase enzymmærket polymer konjugeret til gede-anti-muse-sekundært antistof (Promega). De farvede sektioner blev revideret og scoret af en patolog. Den negative kontrol var normalt humant lungevæv.

celleproliferationsassay

Celler blev udpladet i 96-brønds plader ved en densitet på 3 x 10

3 celler /brønd. Celleproliferation blev vurderet hver 24 timer under anvendelse af celle Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Japan). Hvert eksperiment blev udført tre gange.

Cell Migration og Invasion Assay

Migration assays blev udført i en 24-brønds Kemotaksi kammer (8 um porestørrelse, Corning Life Sciences, Corning, NY, USA) coatet med 10 ug /ml fibronectin (Sigma-Aldrich). Celler (3~5 × 10

4 celler /brønd) i 200 pi serumfrit RPMI 1640 blev podet i det øvre kammer. Derefter 600 pi RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum eller 100 ng /ml human EGF blev tilsat ind i det nedre kammer. Celler i det øvre kammer blev fjernet med en vatpind efter 20 h inkubation ved 37 ° C og 5% CO

2. Celler fastgjort til bunden af ​​membranerne blev fikseret med methanol og farvet med krystalviolet. Graden af ​​migration blev udtrykt som det gennemsnitlige antal celler i seks 10 × felter. Salg

celleinvasion assays blev udført i det væsentlige samme måde som migration assay, bortset fra, at det øvre kammer blev dækket med 30 pi Matrigel (0,5 mg /ml; BD Biosciences). Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer.

Luciferase Reporter Assay

The Elk-1 transkriptionel aktivitet blev målt med Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). IQGAP3 siRNA eller NC siRNA blev cotransficeret ind i A549-celler med plasmiderne PFR-Luc (reporterplasmid), pFA2-Elk-1 (transaktivator plasmid) eller pRL-TK. Fireogtyve timer senere blev cellerne serum-udsultet i 16 timer, derefter stimuleret med eller uden 100 ng /ml EGF i 6 timer. Celler blev høstet og lyseret. Alle reporter assays blev gentaget mindst tre gange in triplo. Ildflueluciferase og Renilla luciferaseaktivitet blev målt med en Centro LB960 luminometer (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland). Ildflue-luciferase-aktivitet blev beregnet og normaliseret baseret på Renilla luciferaseaktivitet. Luciferaseaktivitet i kontrol siRNA-transficerede celler uden EGF stimulering blev sat som 1.

Tumor Metastase analyse

in vivo

NOD /SCID-mus blev købt fra Vital River Laboratory Animal Technology Co Ltd (Beijing, Kina). Mus er blevet rejst under en patogen-fri facilitet på Peking University Health Science Center (Beijing, Kina).

A549 celler blev inficeret med kontrol shRNA eller shIQGAP3 lentivira. Celler (1,5 x 10

6) i 0,1 ml PBS blev injiceret i halevenen på 6 uger gamle NOD /SCID-mus. Seks uger efter infektion blev musene aflivet ved cervikal dislokation. Så lunger blev fjernet, vejet, fotograferet, og fikseret i 4% formalin. Vævssnit blev også farvet med hematoxylin-eosin (H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

IQGAP3 Expression opreguleres i lungekræft Tissue

En potentiel rolle i tumorgenese var først. foreslået for IQGAP3 af bioinformatiske analyser af IQGAP3 udtryk i tumorvæv. ECgene (https://genome.ewha.ac.kr/ECgene/) viste forhøjede niveauer af IQGAP3 i forskellige tumorvæv eller celler af oprindelse i æggestokkene, lunge, tyktarm, mave, knoglemarv og bryst (figur 1A ). RT-PCR blev efterfølgende udført for at verificere disse data. Mens IQGAP3 ekspression i normale væv var begrænset til tyktarmen, tyndtarmen og testis, blev høje niveauer af IQGAP3 mRNA observeret i en række tumorer, herunder lungekræft, leverkræft, nyrekræft, gastrisk cancer, blærecancer, coloncancer og leukæmi ( data ikke vist). Endvidere oplevede vi produktion af autoantistoffer mod IQGAP3 i en signifikant fraktion af patienter med IQGAP3-positive lungecancer [37]. Det fik os til yderligere at undersøge aktiviteten af ​​dette molekyle i udvikling lungekræft. IQGAP3 blev opreguleret på mRNA-niveau i 20 lungekræft væv sammenlignet med tilstødende ikke-kræft væv i 25 parrede prøver ved real-time PCR-analyse (figur 1B). Vi undersøgte dernæst IQGAP3 proteinekspression i et væv array med 89 parrede lungekræft væv. Forhøjede niveauer af IQGAP3 protein blev observeret i 80 cancervæv (figur 1C og tabel S1). Af note, viste statistisk analyse, at der ikke var nogen signifikant korrelation mellem IQGAP3 protein opregulering og parametre som alder, køn eller histologisk bedømmelse (tabel S1).

(A) EST ekspression analyse af IQGAP3 genet i normale og cancervæv baseret på ECgene databasen. (B) Kvantitativ realtids-PCR for IQGAP3 ekspression i 25 par af lungekræft versus tilgrænsende ikke-kræft væv. IQGAP3 ekspression blev normaliseret mod GAPDH. Relative niveauer blev beregnet for hver prøve, og en værdi på 1 fik for tilstødende ikke-kræftvæv af patient 13. Forsøg blev gentaget tre gange. Data fra et repræsentativt forsøg er præsenteret som gennemsnit ± SD. (C) Immunohistokemisk analyse af IQGAP3 proteinekspression i lungekræft versus tilgrænsende ikke-kræft væv. Repræsentative billeder er vist for et pladecellecarcinom og en adenocarcinom. Ca, Cancer væv; Adj, hosliggende ikke-kræft væv. Forstørrelse, × 200.

Ændring af IQGAP3 Expression modulerer vækst, migration og invasion af tumorceller

For at undersøge den funktionelle konsekvens af opreguleret IQGAP3 udtryk i kræft, vi overvågede ændringer i celle adfærd efter ændring af dets ekspressionsniveau i cancercellelinier. IQGAP3 blev først overudtrykt i HeLa-celler, som havde et relativt lavt niveau af endogen IQGAP3 ekspression. Overekspression af IQGAP3 fremmes celleproliferation i disse celler (figur 2A). Desuden tvungen ekspression af IQGAP3 resulterede i forbedret cellemigration og invasion (figur 2B, C).

Myc-IQGAP3 eller kontrol vektorer blev transficeret ind i HeLa-celler og derefter celler blev høstet ved 24 timer efter transfektion for migration og invasion assay. Celler til proliferation assay blev høstet ved angivne tidspunkt. (A) IQGAP3 protein ekspression af transfektanter blev verificeret ved Western blotting. Celleproliferation blev analyseret under anvendelse af celle Counting Kit-8. (B, C) cellemigration og invasion assays blev udført under anvendelse af kemotaxi kamre med eller uden belægning med Matrigel. Hvert assay blev gentaget mindst 3 gange. Data fra et repræsentativt forsøg er præsenteret som gennemsnit ± SD. *,

P

0,05; ***,

P

. 0,001

For yderligere at vurdere virkningerne af IQGAP3 om kræft cellevækst og migration, blev IQGAP3 udtryk slået ned i lungekræft cellelinje A549 , som havde et relativt højt niveau af ekspression af endogent IQGAP3. To shRNA konstruktioner rettet mod forskellige IQGAP3 sekvenser blev anvendt, som begge førte til effektiv nedregulering af IQGAP3 i sammenligning med ikke-specifik kontrol (figur 3A). Som forventet, knockdown af IQGAP3 undertrykte proliferation af A549 celler (figur 3B). Desuden blev reduceret IQGAP3 ekspression også ledsaget af nedsat migration og invasion i A549-celler (figur 3C, D). Det er velkendt, at EGFR-signalering er kritisk involveret i udvikling lungekræft. Vi har derfor yderligere testet, om IQGAP3 ekspression kan modulere celle følsomhed over for EGF stimulus. Som vist i figurerne 3E og F, knockdown af IQGAP3 forårsagede inhibering af cellemigration og invasion svarende til den induceret af EGF. Tilsammen tyder disse data IQGAP3 har onkogent potentiale.

A549 celler blev transficeret med shRNA konstruktioner til knockdown endogen IQGAP3 udtryk. (A) IQGAP3 proteinniveauer efter infektion med kontrol (NC) eller to forskellige shIQGAP3 lentivirus (KD1 og KD2). (B) Proliferation blev analyseret under anvendelse af Cell Counting Kit-8 for lentivirus-inficerede A549-celler. (C, E) Migration af lentivirus-inficerede A549-celler i kemotaksi kammer assay i fravær (C) eller nærvær (E) af human EGF (100 ng /ml). (D, F) Invasion af lentivirus-inficerede A549 celler i hele Matrigel i fravær (D) eller tilstedeværelse (F) af human EGF. Hvert assay blev gentaget mindst 3 gange. Data fra et repræsentativt forsøg er præsenteret som gennemsnit ± SD. *,

P

0,05, **,

P

0,01, ***,

P

. 0,001

Knockdown af IQGAP3 Undertrykt lungekræft Metastase

i betragtning af den potente virkning af IQGAP3 udtryk på proliferation og migration af cancerceller dyrkes

in vitro

, vi næste forsøgt at afgøre, om det også påvirket tumorigenese

in vivo

hjælp en etableret model af metastatisk lungekræft [38], [39]. A549 celler, der huser en lentiviral vektor der udtrykker IQGAP3-specifikke shRNA blev injiceret i halevenen af ​​NOD /SCID-mus. Dyr blev aflivet på dag 42, og lungerne blev fjernet og analyseret. Sammenlignet med mock kontroller, IQGAP3 Knockdown celler syntes at være mindre tumorigene

in vivo

, som foreslået af stærkt reduceret bulk og vægt af de berørte lunger (figur 4A, B). Immunohistokemisk farvning viste, at relativt normal lunge struktur blev opretholdt i IQGAP3 Knockdown grupper, mens det var næsten fuldstændig ødelagt af de multiple tumorknuder i mock kontrol (figur 4C). Tager de relaterede

in vitro

data i betragtning, det reducerede tumorigent potentiale IQGAP3 Knockdown celler

in vivo

kan skyldes enten nedsat kolonisering eller proliferation eller begge dele.

NOD /SCID-mus modtog en intravenøs injektion af 1,5 × 10

6 A549-celler stabilt transficeret med shIQGAP3 (IQGAP3-KD2) eller kontrolvektorer (NC), og blev aflivet på dag 42 efter podning med tumoren (n = 7 for hver gruppe). (A) Gross udseende lungevæv. (B) Lung vægt. De vandrette og fejl søjler viser den gennemsnitlige vægt og standardafvigelse. (C) H 0,01

IQGAP3 interagerer med ERK1

Som forudsagt af Scansite (https://scansite.mit.edu/), IQGAP3 indeholder flere ERK D domæner, som vides at mediere interaktion med ERK familiemedlemmer. For at undersøge denne mulighed, vi transficeret HEK293T celler med Myc-IQGAP3 og HA-ERK1 eller HA-ERK2 konstruktioner. Cellelysat blev fremstillet og immunudfældet med anti-HA eller anti-myc antistoffer. Det resulterende bundfald blev gensidigt detekteret med anti-Myc eller anti-HA. Det var af særlig interesse, at immunoudfældning af IQGAP3 blev observeret med ERK1, men ikke med ERK2 (figur 5A). Desuden søgte vi at afgøre, om en lignende interaktion sker mellem endogent udtrykte proteiner. Cellelysat fra A549-celler blev immunopræcipiteret med kanin-anti-ERK1 mAb og IQGAP3 blev faktisk påvist i præcipitatet med anti-IQGAP3 antistof (figur 5B). Disse resultater indikerer, at IQGAP3 kan interagere med ERK1, enten direkte eller indirekte via et større kompleks.

(A) Myc-IQGAP3 og HA-ERK1 eller HA-ERK2 konstruktioner blev transficeret i HEK293T celler. Cellelysat blev fremstillet og immunudfældet med muse-anti-HA-mAb, anti-Myc mAb eller kontrol antistoffer (mlgG). Det resulterende bundfald, sammen med det ubehandlede lysat (input) blev opløst på SDS-PAGE, overført til blots og sonderet med anti-myc og anti-HA. (B) Interaktion af IQGAP3 med ERK1 blev også undersøgt i A549 celler med endogent udtrykte proteiner. Cellelysat blev fremstillet ud fra A549-celler og immunopræcipiteret med kanin-anti-ERK1 mAb. Tilstedeværelsen af ​​IQGAP3 i bundfaldet blev evalueret anti-IQGAP3 antistoffer. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange og resultater fra et repræsentativt forsøg er vist.

IQGAP3 Fremmer EGF induceret ERK Phosphorylering

Samspillet mellem IQGAP3 og ERK1 bedt yderligere undersøgelse af indflydelse af IQGAP3 om ERK aktivering og signalering. Overekspression af IQGAP3 i Hela-celler havde minimal virkning på phosphorylering af ERK, i modsætning til hvad der er blevet rapporteret for IQGAP1 [40]. Når de stimuleres med EGF, men de IQGAP3 transfektanter demonstrerede stærkt forbedret ERK phosphorylering sammenlignet med mock kontrol (figur 6A). AKT og p38 aktivering på den anden side blev ikke ændret (data ikke vist). I overensstemmelse med disse resultater, knockdown af IQGAP3 ekspression i A549-celler resulterede i svækkelse af EGF-induceret ERK-phosphorylering, mens AKT og p38 phosphorylering ikke blev påvirket (figur 6B). Desuden viste dual luciferase reporter assays, knockdown af IQGAP3 inhiberer den transkriptionelle aktivitet af Elk1 som er kendetegnende for ERK-aktivering i EGF stimulerede A549-celler (Figur 6C). At evaluere potentialet korrelation mellem forøget ERK-signalering og accelereret proliferation af IQGAP3-transficerede celler, U0126, som er en MEK1 /2-inhibitor blev tilsat til kulturen. Som vist i figur 6D, hæmning af ERK-aktivering afskaffede spredning fremmende effekt af IQGAP3. Disse resultater understøtter det koncept, at onkogene aktivitet af IQGAP3 er sandsynligvis medieret af forøget ERK-signalering.

(A) Hela-celler transient transficeret med Myc-IQGAP3 eller kontrol vektor (mock) blev serum berøvet (0,5% føtalt bovint serum ) i 24 timer, før de blev stimuleret med 100 ng /ml EGF. Celler blev høstet på forskellige tidspunkter og undersøgt for ERK phosphorylering. (B) A549-celler blev inficeret med shIQGAP3 lentivirus (IQGAP3-KD1 eller KD2) eller kontrol-virus (NC) og serum berøvet (0,5% føtalt bovint serum) før stimulering med 100 ng /ml EGF. Niveauer af phosphoryleret ERK, total ERK, phosphoryleret p38 og phosphoryleret AKT blev evalueret med western blot ved forskellige tidspunkter efter EGF-stimulering. (C) Luciferase reporter assays blev udført for at måle Elk1 aktivitet nedstrøms for kaskade af EGFR-ERK-signalering i A549-celler transficeret med siRNA oligoer. (D) Proliferation af Hela-celler, der huser IQGAP3-udtrykkende eller styrevektorer blev analyseret under anvendelse af Cell Counting Kit-8 med tilsætning af 20 uM U0126 eller DMSO. Hvert assay blev gentaget mindst 3 gange. Dataene fra et repræsentativt forsøg er præsenteret som gennemsnit ± SD. *,

P

0,05; **,

P

0,01

Diskussion

Til dato har tre medlemmer af IQGAP familien blevet beskrevet [22] – [24].. Der er beviser for, at IQGAP1 primært fungerer som et onkogen [27]. IQGAP2 viser anti-tumor aktivitet, på trods af sin strukturelle lighed med IQGAP1 [33]. Her viste vi, at IQGAP3 er stærkt udtrykt i en stor del af prøverne lungekræft. Mens tvungen udtryk for IQGAP3 forårsager accelereret proliferation og migration /invasion af kræftceller, undertrykkelse af dets udtryk fører til en reduktion i tumorigent potentiale. På molekylært niveau, IQGAP3 interagerer med ERK1 og fremmer EGF-induceret aktivering af ERK, som igen synes at være tæt forbundet med sin tumor-fremmende aktivitet.

IQGAP3 er placeret på 1q21.3, som er en hotspot for genamplifikation i kræft [24]. DNA-amplifikation ved 1q21.3 har f.eks blevet rapporteret at være forbundet med gastroøsofageal carcinom og infiltrerende duktalt carcinom i brystet [41], [42]. Desuden gevinster på 1q21.3 har en signifikant sammenhæng med reduceret samlet overlevelse tid i leiomyosarcoma af livmoderen [43]. Bioinformatik analyse viser, at IQGAP3 er opreguleret i flere cancertyper, herunder ovarie, lunge, tyktarm, mave, knoglemarv og bryst maligniteter (figur 1A). Den aktuelle undersøgelse specifikt dets rolle i lungekræft. Blandt 25 par af lungekræft og tilstødende ikke-cancervæv, viste 20 cancervæv en stigning i IQGAP3 mRNA. Opregulering af IQGAP3 udtryk blev bekræftet på proteinniveau ved visning af stærkere immunhistokemisk farvning i kræft end i ikke-kræft væv i 80 ud af 89 lungekræft prøver. Vi spekulere, at IQGAP3 kan repræsentere et vigtigt gen, som kritisk involveret i maligniteter karakteriseret ved 1q21.3 amplifikation. Det ville være interessant at bestemme, om 1q21.3 amplifikation bidrager til opregulering af IQGAP3 som findes i lungecancer og hvorvidt 1q21.3 amplifikation observeret i gastroesophagale carcinomer eller brystcancer er forbundet med øget IQGAP3 ekspression. Selv i vores undersøgelse, vi viser, at upreguation af IQGAP3 er en fælles begivenhed i lungekræft, bør vi nævne, at der er et par lungekræft prøver, der viser uændrede eller endog faldet udtryk for IQGAP3. Dette er ikke overraskende. For eksempel, Her2, den repræsenterende onkogen i brystkræft, er kun opreguleret i ca. 20% brystcancer [44], [45]. Nogle gener, såsom p16, som kan opreguleres eller nedreguleres i tumorer og virker som enten en tumor suppressor eller et onkogen afhængigt af konteksten af ​​kroppen [46]. Derfor, uanset om det andet udtryk mønster af IQGAP3 foreslår en mere forvirre regulering og funktion af IQGAP3 i tumor udviklingsbehov yderligere undersøgelser.

dysregulering af ekspressionen af ​​IQGAP3 i cancer væv tyder på en potentiel rolle for dette molekyle i tumorigenese. I overensstemmelse med dette koncept, overekspression af IQGAP3 forbedret tumorcellevækst, migration og invasion, mens knockdown af IQGAP3 ekspression viste modsatrettede effekter. IQGAP3 er derfor funktionelt ligner IQGAP1, som er kendt for at have onkogent potentiale [31], [32]. Ligesom andre medlemmer af IQGAP familien, IQGAP3 besidder strukturelle motiver, der kan binde ERK. Ved gensidig co-immunpræcipitationseksperimenter, bekræftede vi samspillet mellem IQGAP3 og ERK1. Den funktionelle betydning af denne interaktion er støttet af augmented phosphorylering af ERK og øget Elk1 transkriptionel aktivitet ved EGF-stimulering i IQGAP3-transficerede celler. Vigtigere var spredning fremmende effekt næsten helt afskaffet ved ERK signalering inhibitor U0126, hvilket indikerer, at IQGAP3 udøver sin funktion hovedsageligt ved regulering af ERK-signalering. Det er interessant at bemærke, at på trods af deres funktionelle lighed, IQGAP3 og IQGAP1 vise tydeligt forskellige specificiteter for binding partnere. Mens IQGAP1 primært binder sig til ERK2, IQGAP3 interagerer udelukkende med ERK1 [40]. Betydningen af ​​en sådan selektivitet skal stadig bestemmes, men vi spekulere at IQGAP1 og IQGAP3 kan samarbejde om regulering af ERK-signalering, og derved udøver en synergistisk effekt på tumor progression.

Intravenøs podning af nøgne mus har været meget anvendt til vurdere metastatiske potentiale cancerceller [38], [39]. Under anvendelse af denne model, knockdown af IQGAP3 i lungecancerceller blev fundet at kraftigt svække dets evne til at skabe metastatiske læsioner i lungen. Dette resultat er i overensstemmelse med vores

in vitro

data, som viser ændrede cellemigration og invasion efter manipulation af IQGAP3 ekspression. De specifikke detaljer i disse mekanismer fortsat uklare. Konfokal mikroskopi afslørede, at IQGAP3 er beriget på forkant migrere celler (Figur S1), tyder på mulige involvering i dannelsen af ​​førende kanter. Desuden genekspressionsprofilering viste et forøget niveau af E-cadherin i IQGAP3 Knockdown celler (figur S2). Det er velkendt, at E-cadherin er meget vigtigt for celleadhæsion. Nedregulering af det sammen med tilhørende cateninkomplekset er samtidig med reduceret intercellulær vedhæftning og forbedret invasive kapacitet [47], [48]. Som sådan kan IQGAP3 lette cellemigration og invasion dels gennem suppression af E-cadherin ekspression.

Sammenfattende vores undersøgelser viser for første gang involveringen af ​​IQGAP3 i udvikling lungekræft og de potentielle molekylære mekanismer der ligger til grund dens tumor-fremmende aktivitet. Disse resultater udvider vores viden om komplicerede rolle IQGAP familien i tumorigenese. Yderligere undersøgelse af potentialet i disse molekyler som mål for terapeutisk opfindelse er berettiget.

Støtte Information

figur S1.

IQGAP3 blev beriget ved forkanten af ​​migrerende celler. A549-celler blev anbragt på dækglas overtrukket med 10 ug /ml fibronectin (Sigma-Aldrich).