PLoS ONE: Urin Exosomer for Non-Invasiv Vurdering af genekspression og mutationer af prostata Cancer

Abstrakt

Formål

Analysen af ​​exosom /mikrovesikel (ekstracellulære vesikler (EVS)) og RNA pakket i dem (exoRNA) har potentialet til at give en ikke-invasiv platform til at opdage og overvåge sygdomme relateret genekspression potentielt

i stedet

af mere invasive procedurer såsom biopsi. Imidlertid har få studier testet den diagnostiske potentiale EV analyse hos mennesker

Eksperimentel Design

evne EV analyse præcist at afspejle prostata væv mRNA-ekspression blev undersøgt ved at sammenligne urin VE TMPRSS2:. ERG exoRNA fra præ-radikal prostatektomi (RP) patienter versus tilsvarende RP væv i 21 patienter. For at undersøge forskellen udtryk for TMPRSS2: ERG tværs patientgrupper en tilfældig urinprøve blev truffet uden prostata massage fra en kohorte af 207 mænd, herunder prostata biopsi negative (Bx Neg, n = 39), prostata biopsi positive (Bx Pos, n = 47 ), post-radikal prostatektomi (post-RP, n = 37), un-biopsi raske mænd med samme alder (nr Bx, n = 44), og unge mandlige kontroller (CONT, n = 40). Brugen af ​​elbiler blev også undersøgt som en potentiel platform for ikke-invasivt differentiere Bx Pos versus Bx Neg patienter via påvisning af kendte prostatakræft gener TMPRSS2:. ERG, BIRC5, ERG, PCA3- og TMPRSS2

Resultater

I denne tekniske pilotundersøgelse urin elbiler havde en følsomhed: 81% (13/16), specificitet: 80% (4/5) og en samlet nøjagtighed: 81% (17/21) for ikke-invasiv påvisning af TMPRSS2: ERG versus RP væv. Satsen for TMPRSS2: ERG exoRNA detektion fandtes at stige med alderen og ekspressionsniveauet korreleret med Bx Pos status. Modtager operatør karakteristiske analyser viste, at forskellige kræftrelaterede gener kunne skelne Bx Pos fra Bx Neg patienter, der anvender exoRNA isoleret fra urin elbiler: BIRC5 (AUC 0,674 (CI: 0,560-0,788), ERG (AUC 0,785 (CI: 0,680-0,890), PCA3 (AUC 0,681 (CI: 0,567-0,795), TMPRSS2: ERG (AUC 0,744 (CI: 0,600-0,888), og TMPRSS2 (AUC 0,637 (CI: 0,519 til 0,754)

Konklusion

Denne pilotundersøgelse tyder på, at urinen elbiler har potentiale til at blive brugt som en platform til ikke-invasivt differentiere patienter med prostatacancer med meget god nøjagtighed. der er behov for større undersøgelser for at bekræfte potentialet for klinisk anvendelighed.

citation:.. Motamedinia P, Scott AN, Bate KL, Sadeghi N, Salazar G, Shapiro E, et al (2016) Urin Exosomer for Non-Invasiv Vurdering af genekspression og mutationer af prostatakræft PLoS ONE 11 (5): e0154507 . doi: 10,1371 /journal.pone.0154507

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

modtaget: august 6, 2015; Accepteret: 14. april, 2016 Udgivet: Maj 4, 2016

Copyright: © 2016 Motamedinia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. J Lin modtog en Doris Duke Charitable Foundation Award. Denne undersøgelse blev støttet af Exosom Diagnostics, Inc. bidragyder ydet støtte i form af lønninger til forfattere ANS, KLB, GS, MJD, WDC, LMR, og havde en yderligere rolle i studie design, indsamling af data og analyse, og forberedelse af manuskriptet. . De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« afsnittet

Konkurrerende interesser: ANS, KLB, GS, WDC, LMR og MJD var ansatte eller konsulenter til Exosom Diagnostics, Inc. på det tidspunkt, Studiet. WDC er aktionær i Exosom Diagnostics, Inc. LMR har aktieoptioner i Exosom Diagnostics, Inc. Disse konkurrerende interesser ikke påvirker forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Exosomer og mikrovesikler er lipiddobbeltlagsvesikler (sædvanligvis 30-200 nm i diameter). Under dannelse, exosomer og mikrovesikler (samlet omtalt heri som ekstracellulære vesikler (elbiler)) indkapsler en del af stamcellen cytoplasma herunder membranproteiner, cytosoliske proteiner [1] og nukleinsyrer (hovedsagelig RNA omtalt heri som exoRNA) [2, 3]. De elbiler derefter frigivet fra celler og kan høstes fra kropsvæsker, herunder blod og urin. Til dato har der været nogle væsentlige undersøgelser for at forstå den potentielle diagnostiske anvendelse af elbiler.

Prostatakræft er den hyppigste kræftform hos mænd og den næsthyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA [4] . Serum prostataspecifikt antigen (PSA) anvendes som en biomarkør for prostatakræft selv er blevet kritiseret denne strategi grundet dens lave følsomhed og specificitet [5]. Schröder

et al

[6] fandt, at 1055 mænd skal screenes og 37 mænd ville skal behandles for at redde et liv. Dette over-diagnose og overbehandling resulterer i nedsat livskvalitet og øgede udgifter til sundhedsvæsenet, der fremhæver det presserende behov for mere følsomme og specifikke diagnostiske strategier [7,8]. I 2009 blev det rapporteret, at prostata-relaterede gener kan med held påvises i urin elbiler [9]. Vi har for nylig avancerede metoder til i) hurtigt isolere intakte elbiler fjerne afhængigheden af ​​ultracentrifugering og muliggør tilpasning til laboratoriet indstillingen kliniske og ii) opnå høj integritet exoRNA vigtig for pålidelig transkriptionelle analyse [10,11].

I 2005 , Tomlins

et al

. [12] rapporterede identifikation af prostataspecifikt TMPRSS2: ERG fusion mutation mellem androgen drevne gen transmembrane protease serin 2 (TMPRSS2) og onkogenet Ets Relateret Gene (ERG). Den mest almindelige fusion begivenhed (TMPRSS2 exon 1 med ERG exon 4) er blevet rapporteret at have en forekomst på mellem 20% -80% i prostatakræft [13,14]. Fusion status er blevet undersøgt via forskellige teknikker, herunder fluorescens

in situ

hybridisering (FISH) og RT-PCR [15]. Andet gen almindeligvis undersøgt i prostatakræft er PCA3, oprindeligt navngivet Differential Display kode 3 (DD3), PCA3 er en ikke-kodende gen højt udtrykt i prostatacancer [16]. Andre gener, som har været impliceret i prostatakræft omfatte baculovirale IAP gentagelse indeholdende 5 (BIRC5), også kendt som survivin [17] og ERG [18]. Kallikrein 3 (KLK3), også kendt for at kode PSA [19], er en prostata relateret gen, hvis mRNA-niveauer er tidligere blevet anvendt til at standardisere genekspression i urin sedimenter [20].

Tidligere studier undersøge prostata markørgenprodukter ekspression i urin have krævet prostata massage fremskaffes tilstrækkelige celler til RNA-analyse. De nærmere af massage varierer meget blandt de studier, fra anvendelsen af ​​mild digital tryk til de laterale lapper til fast tryk over hele kirtel [20-26]. Sådanne manipulationer kan medføre ubehag for patienten og inter-udbyder variabilitet. Derudover krævede prostata massage før urinopsamling mandater en direkte interaktion med en læge via et kontor besøg forud for hver prøvetagning, hvilket resulterer i øgede omkostninger. Den nuværende pilotundersøgelse undersøger potentielle diagnostiske anvendelighed af elbiler i en tilfældig urinprøve taget uden forudgående prostata massage. Vi bruger detektion af prostata specifikt genfusion begivenhed (TMPRSS2: ERG) i urin elbiler inden radikal prostatektomi (RP) sammenlignet med matchede væv fra kirurgiske prøve at undersøge evnen af ​​urin elbiler at afspejle vævsekspression. Vi yderligere at undersøge brugen af ​​elbiler som en platform til ikke-invasivt differentiere mænd med biopsi bevist prostatakræft (Bx Pos) fra dem med negative prostata biopsier (Bx Neg) ved hjælp af tidligere beskrevne gener impliceret i prostatakræft.

Materialer og metoder

Sample indkøb

The Columbia University Board Institutional Review godkendt denne undersøgelse. Skriftligt samtykke blev opnået for de indsamlede prøver. Tilfældige urinprøver indsamlet uden prostata massage, blev opnået fra 207 mænd grupperet i: biopsi negativ (Bx Neg, n = 39), biopsi positive (BX Pos, n = 47), post-radikal prostatektomi uden tegn på resterende sygdom (post -RP, n = 37), alder matchede mænd (ingen historie af prostatakræft) (ingen Bx, n = 44) og raske kontroller (mænd 35 år) (Cont, n = 40). Urinprøver blev opbevaret ved 4 ° C indtil anvendelse. Af note, Bx Neg gruppen omfattede patienter med høj kvalitet prostata intraepitelialneoplasi (HGPIN) og /eller atypisk lille acinære proliferation (ASAP) på biopsi. Alle urinprøver blev leveret til analyse hinanden og på en blindet måde. Radikal prostatektomi væv blev opnået fra 21 patienter, for hvem matchende urinprøver indsamlet forud for RP var til rådighed (n = 21). Den formalinfikseret paraffinindlejret RP væv blev skåret ved 5 um og monteret på objektglas, som pr Patologisk Afdeling protokollen. Vævet blev derefter nedfrosset ved -80 ° C indtil anvendelse.

urinprøve forarbejdning

Urinprøver blev forarbejdet som tidligere rapporteret [10] ved brug af 20 ml urinprøver. En 0,8 um filter (Nalgene, NY) blev anvendt til at fjerne hele celler og cellerester. Mikrovesikler /exosomer blev isoleret ved anvendelse af en 100k MWCO filtrering koncentrator (Millipore, MA) som tidligere beskrevet (10). Efter tilsætningen af ​​urinprøven, blev filtreringen koncentrator centrifugeret ved 4.500 x

g

i 5 minutter, og filtratet kasseret, og retentatet holdes. Retentatet gennemgik herefter en 10 ml PBS vaske og to 15ml gange vask med PBS efterfulgt af centrifugering ved 4.500 x

g

i 5 minutter efter tilsætningen af ​​hver PBS vask. 4 pi RNasin (Promega, WI) blev tilsat til den isolerede elbiler før RNA-ekstraktion for yderligere at fjerne enhver RNase-aktivitet. exoRNA blev isoleret fra den vaskede EV fraktion under anvendelse af RNeasy PLUS (Qiagen, MD) ifølge producentens instruktioner, som anvender en DNA spinkolonne til fjernelse af genomisk DNA (gDNA) fra prøven.

Tissue behandling

Patienter med præ-radikal prostatektomi urinprøver blev udvalgt tilfældigt til at undersøge overensstemmelsen mellem TMPRSS2: ERG påvisning i urin og detektion i væv. RP væv blev valgt således, at en grundig analyse af multipel tumor foci og normale væv regioner kunne analyseres. Formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) væv fra tumorfoci og normale prostata områder blev sektioneret ved 5 um og anbragt på objektglas. I alt 4-6 objektglas fra hver tumor fokus eller normalt område blev kompileret og nucleinsyrer blev isoleret ved anvendelse af QIAamp DNA FFPE væv (Qiagen, CA) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev vævssnit skrabet over i et Eppendorf-rør i et RNase frit miljø. At afvokse vævssnit blev 1,5 ml Histologi Grade Xylen (VWR International, PA) tilsat til afsnittene, glassene kortvarigt hvirvlet og centrifugeret ved 20.000 x g i to minutter ved stuetemperatur. Supernatanten blev fjernet med pipette. Prøver blev ligeledes hvirvlet og spundet efter tilsætning af 1,5 ml, derefter 1 ml 100% ethanol (Electron Microscopy Sciences, PA). Pellets blev fuldt tørret ved inkubering reducerede rør ved 37 ° C i 20 minutter. 180 pi Buffer ALT blev tilsat direkte til pellets, som var fuldt homogeniseres under anvendelse af et væv-ruptur enhed. 20 pi proteinase K blev tilsat og blandet med prøverne, som derpå blev inkuberet i 1 time ved 56 ° C, derefter 1 time ved 90 ° C. Rør blev kortvarigt spundet og prøver blev overført til QIAamp MinElute kolonner i 2 ml indsamling rør. Efter 1 minuts 6000 × g spin gennemstrømningen blev kasseret, og søjlerne blev overført til friske rør. Søjler blev spundet to gange ved 6000 x g i 1 minut efter tilsætning af 500 pi AW1 Buffer og 500 pi AW2 Buffer. For at fjerne al ethanol, blev søjlerne spundet på 20.000 × g i 3 minutter. Nukleinsyrer blev elueret fra kolonnerne i 35 pi Buffer ATE blev koncentrationen heraf målt ved NanoDrop Spektrofotometer ifølge producentens anvisninger, hvor puffer ATE (Qiagen, CA) blev anvendt som en blank.

PCR-analyse

RNA fra både vævs- og urinprøver undergik revers transkriptase-reaktionen (RT) under anvendelse af Vilo RT (Invitrogen, CA) ifølge producentens instruktioner. Prøve præ-amplifikation blev udført under anvendelse af TaqMan

® PREAMP Master Mix Kit (Life Technologies, NY) ifølge fabrikantens instruktioner. Pre-amplificeret cDNA blev fortyndet 1:20 i TE-buffer. PCR blev udført med 5 pi fortyndet, præ-amplificerede cDNA til påvisning af TMPRSS2: ERG (Life Technologies, NY) (Hs03063375_ft, 106bp), KLK3 (PSA) (Hs03063374_m1, 64bp), ERG (Hs01554635_m1, 104bp), BIRC5 (Hs00153353_m1, 93bp) og PCA3 (Hs01371938_m1, 80bp), TMPRSS2 (Hs00237175_m1) på en StepOne Plus maskine (Applied Biosystems, CA). For exoRNA genekspression blev gener af interesse normaliseret til exoRNA KLK3 (C

t gen af ​​interesse – C

t KLK3). For væv genekspression gener af interesse var normaliseret til GAPDH (C

t gen af ​​interesse – C

t GAPDH).

Dataanalyse

DataAssist programmet Version 2.0 (Applied Biosystems, CA), blev anvendt til dataanalyse til bestemmelse relative kvantificering (RQ) af genekspression og betydningen af ​​ekspression (

P

-værdi). Sammenligning af kliniske og patientkarakteristika herunder box plots og ROC analyse blev udført ved hjælp af STATA IC 12.1 (StataCorp, College Station, TX).

Statistisk analyse

En t-test, en-vejs ANOVA og ROC analyser blev anvendt til at teste for statistisk signifikans.

P

0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

For at bestemme nøjagtighed, hvormed exoRNA isoleret fra urin elbiler afspejler prostata væv mRNA, vi analyserede TMPRSS2:. ERG udtryk i RP væv af 21 patienter og sammenlignet det med matchende urinprøver taget før RP. Radikal prostatektomi væv blev anvendt (i modsætning til biopsi væv), således at en mere præcis analyse kunne foretages af TMPRSS2: ERG ekspression hele prostata. En repræsentativ illustration af prostata områder ekstraheret til analyse (a ‘væv kort’) af prostatectomy væv, den patologiske status for hvert område (tumor eller godartet) og TMPRSS2: ERG status af hvert område ekstraheret, er vist i figur 1 viser den omfattende mængde væv analyseret (se S1 fig for “væv maps” af alle 21 patienter). Isoleringen af ​​mRNA fra FFPE væv blev bekræftet via analyse af qPCR amplikoner med og uden forudgående RT-reaktionen (se S2 Fig). I nogle tilfælde TMPRSS2: blev ERG ekspression påvist i “benign” vævsområder. Dette kan skyldes tilstedeværelsen af ​​mikro foci af tumor i efterfølgende sektioner af væv ekstraheret i RNA-analyse under den oprindeligt analyseret af patologen (Se S3 Fig) og kan forklare, hvorfor nogle “benign” regioner uventet viste positiv TMPRSS2: ERG ekspression . En patient blev betragtet TMPRSS2: ERG positivt, hvis TMPRSS2: ERG blev opdaget under et af de dele af prostatektomi væv ved hjælp af RT-qPCR. Denne analyse blev sammenlignet med TMPRSS2: ERG udtryk i urin elbiler bruger samme RT-qPCR reaktion og rapporteret i tabel 1. Analysen af ​​påvisning af TMPRSS2: ERG i væv versus påvisning i urin elbiler viste en meget god korrelation med en følsomhed på 81% (13/16), specificitet på 80% (4/5), PPV 93%, NPV 57% og en samlet nøjagtighed på 81% (17/21) (se tabel 2). For at afgøre, hvorfor udtryk i urin elbiler ikke altid afspejler væv udtryk, vi sammenlignede væv ekspressionsniveauerne (relativ kvantificering (RQ)) af TMPRSS2: ERG for de patienter med påviselig urin EV TMPRSS2: ERG udtryk versus patienter med målbart urin EV TMPRSS2 : ERG ekspression. Selvom begrænset stikprøvestørrelse med kun 3 TMPRSS2: ERG positive vævsprøver bliver TMPRSS2: ERG negativ i urin exoRNA, versus 13, der havde nøjagtig korrelation med positivt udtryk i både væv og urinveje elbiler, afslørede data, TMPRSS2: ERG udtryk i tumorvæv var ~ 98 gange højere (

P

= 0,009) hos patienter med påviselig urin exoRNA TMPRSS2: ERG udtryk. I et andet tilfælde TMPRSS2:. Blev ERG detekteret i urin exoRNA men kunne ikke påvises i den begrænsede væv til rådighed for analyse (se tabel 1, patient 10)

repræsentant tegneserie, der viser udvælgelsen af ​​godartet (blå) og cancer (pink) regioner fra en radikal prostatektomi. Tumoren og godartede regioner blev undersøgt for TMPRSS2: ERG mRNA-ekspression (Rød ‘+’ angiver positiv TMPRSS2: ERG udtryk, Blue ‘-‘ angiver ingen TMPRSS2: ERG udtryk). T: E-TMPRSS2:. ERG, A-anterior, P-posterior, L-venstre, R-højre Vejviser

For yderligere at undersøge anvendelsen af ​​elbiler at opdage TMPRSS2: ERG udtryk blev tilfældige urinprøver indsamlet fra 207 mænd stratificeret i 5 grupper: Transrektal ultralyd (TRUS) prostata biopsi negativ (Bx Neg, n = 39), TRUS biopsi positive (Bx Pos, n = 47), post-radikal prostatektomi ( post-RP, n = 37), alder matchede mænd, der ikke undergår biopsi (Ingen Bx, n = 44) og kontroller (hanner under en alder af 35 år, Cont, n = 40). Patient karakteristika er vist i tabel 3. Der var ingen forskel i den gennemsnitlige alder, bortset fra kontrol hanner (

P

0,05). Serum PSA blev kun reduceret betydeligt i den post-RP-gruppe (

P

0,001) i overensstemmelse med prostata fjernelse

Forekomsten af ​​TMPRSS2: ERG udtryk (figur 2a) var. højeste i Bx Pos gruppen med 66% udtrykker TMPRSS2: ERG i overensstemmelse med tidligere resultater [12-14]. Interessant nok blev 44% af Bx Neg patienter fundet at udtrykke TMPRSS2: ERG. Post-RP patienter havde ingen TMPRSS2: ERG udtryk i overensstemmelse med prostata-specifikke ekspression af genet, som er tabt efter prostata fjernelse [12]. Kun 5% af kontrol mænd ( 35 år gamle) udtrykte TMPRSS2: ERG i modsætning til 41% i ‘alderskategori’ Ingen Bx kontroller (hanner af lignende alder til Bx Pos og Bx Neg grupper, men som ikke har en indikation for prostata biopsi). Vi undersøgte yderligere niveauet af TMPRSS2: ERG udtryk ved RQ af TMPRSS2: ERG tværs grupper (figur 2b). TMPRSS2: ERG udtryk var højest i Bx Pos gruppe (

P

= 0,013) i overensstemmelse med den bekræftet forekomst af kræft (se S4 Fig for kassediagram distribution af delta C

t). Vi fulgte også urin TMPRSS2: ERG detektering i patienter før og efter RP, når de foreligger. Selvom begrænset stikprøve størrelse, alle 3 patienter, der var exoRNA TMPRSS2: ERG positiv forud for RP viste sig at have nogen exoRNA TMPRSS2: ERG udtryk post-RP, hvilket tyder på, at TMPRSS2: ERG påvist i disse urin elbiler var faktisk prostata-specifikt.

a) Sats for TMPRSS2: ERG påvisning i urin elbiler. Foret stænger-TMPRSS2: ERG positive, massive søjler-nr TMPRSS2: ERG udtryk. Sats vedrører TMPRSS2: ERG positive patienter. b) Relativ kvantificering (RQ), i TMPRSS2: ERG ekspression versus Bx Neg patienter. TMPRSS2: ERG udtryk blev standardiseret til KLK3 overensstemmelse med andre prostata biomarkør undersøgelser [20]. Bx Neg-biopsi negative (n = 39), Bx Pos-biopsi positiv (n = 47), Cont-kontrol hanner 35 år (n = 40), Ingen Bx-ingen biopsi (alder matchede kontrol) (n = 44), RP-radikal prostatektomi (n = 37). Data præsenteret som RQ ± SEM.

For at afgøre, om urin elbiler kan bruges til at undersøge andre gener forbundet med prostatakræft vi undersøgte den differentielle ekspression af androgen receptor (AR), BIRC5, ERG, PCA3, TMPRSS2: ERG og TMPRSS2 i Bx Pos versus Bx Neg patienter (figur 3a). Analyse af RQ viste, at alle gener undtagen AR blev forøget betydeligt i Bx Pos patienter versus Bx Neg patienter (se S5 Fig for kassediagram distribution af delta C

t). Analyse af korrelationen mellem ERG og TMPRSS2: ERG ekspression (figur 3b) viste, at der var en stærk tendens mellem de to gener (R

2 = 0,826) stemte overens med urin-celle og væv data antyder, at den mest almindelige fusion (TMPRSS2 (exon 1) med ERG (exon 4)) kan give anledning til øget ERG udtryk [12,18]. Denne tendens var ikke indlysende, når TMPRSS2: ERG udtryk var korreleret med PCA3 udtryk (R

2 = 0,110) (figur 3c). ROC-analyser blev også udført for at bestemme evnen af ​​disse gener til at diskriminere biopsi status (figur 4). Resultaterne bekræftede, at BIRC5, ERG, PCA3, TMPRSS2: ERG og TMPRSS2 var i stand til at differentiere Bx Pos fra Bx Neg patienter (tabel 4)

a) Relativ kvantificering (RQ) af genekspression at afgøre, om eventuelle gener. er signifikant højere udtrykt i Bx Pos patienter. AR (Bx Neg n = 38, Bx Pos n = 47), BIRC5 (Bx Neg n = 39, Bx Pos n = 45), ERG (Bx Neg n = 33, Bx Pos n = 41), PCA3 (Bx Neg n = 38, Bx Pos n = 46), TMPRSS2: ERG (Bx Neg n = 17, Bx Pos n = 31) og TMPRSS2 (Bx Neg n = 39, Bx Pos n = 45). Alle gener, bortset AR viste sig at have signifikant højere ekspression sammenlignet med Bx Neg patienter. Solide sværd-Bx Neg, foret stænger-Bx Pos. Data præsenteret som RQ ± SEM. b) Korrelation mellem ekspressionen af ​​TMPRSS2: ERG og ERG blev bestemt under anvendelse delta Ct mod KLK3 i Bx Pos (sort) og Bx Neg (grå) patienter. c) Korrelation mellem ekspressionen af ​​TMPRSS2: ERG og PCA3 blev bestemt under anvendelse delta C

t mod KLK3 i Bx Pos (sort) og Bx Neg (grå) patienter. delta C

t = C

t gen af ​​interesse – C

t KLK3

Individuel ROC kurver for AR, BIRC5, ERG, PCA3, TMPRSS2:. ERG og TMPRSS2. T: E-TMPRSS2: ERG. AR (Bx Neg n = 38, Bx Pos n = 47), BIRC5 (Bx Neg n = 39, Bx Pos n = 45), ERG (Bx Neg n = 33, Bx Pos n = 41), PCA3 (Bx Neg n = 38, Bx Pos n = 46), TMPRSS2: ERG (Bx Neg n = 17, Bx Pos n = 31) og TMPRSS2 (Bx Neg n = 39, Bx Pos n = 45)

diskussion

Analyse af RNA i urin har store konsekvenser for udviklingen af ​​ikke-invasive tests der undersøger forskellen genekspression og mutation afsløring. Trods det enorme potentiale, at ikke-invasiv analyse af underliggende sygdom kan have i at vejlede en læge, en nøgle begrænsninger vedrørende anvendelsen af ​​kropsvæsker er, om de nøjagtigt afspejler genekspression ændringer i forælder væv. Vores analyse har udnyttet urin EV exoRNA at afgøre, om det er: 1) afspejler væv genekspression, og 2) i stand til at skelne BxPos fra BxNeg patienter ikke-invasivt. På grund af den ~ 25% iboende falsk negativ rate af TRUS-guidede prostata biopsi at opdage kræft og den begrænsede mængde væv adspurgte under biopsi, valgte vi at udnytte patienter planlagt at gennemgå RP for at sammenligne overensstemmelsen mellem TMPRSS2: ERG mRNA detektion i væv versus i urin elbiler. TMPRSS: ERG detektion var specielt udvalgt til at bestemme denne sammenhæng på grund af dens kendte specificitet til prostata væv. Urinary exoRNA analyse var i stand til ikke-invasivt at detektere væv ekspression af TMPRSS2: ERG mRNA med meget god nøjagtighed og en samlet konkordans på 80%. I nogle tilfælde TMPRSS2: blev ERG ekspression påvist i “benign” vævsområder. Dette kan skyldes tilstedeværelsen af ​​mikro foci af tumor i efterfølgende sektioner af væv ekstraheret i RNA-analyse under den oprindeligt analyseret af patologen (Se S3 Fig). Dette er en iboende problem med denne type RP væv analyse, men kan forklare, hvorfor nogle “godartede regioner uventet viste positiv TMPRSS2:. ERG udtryk

Tre af de 21 patienter havde påviselige TMPRSS2: ERG udtryk i væv, men målbart TMPRSS2: ERG i urin elbiler. Ved yderligere analyse af disse data kan det foreslås, at ikke kan påvises lavt niveau ekspression i væv i EVT og kan ses som en potentiel begrænsning. Dette bør dog overvejes med forsigtighed, da der kun var tre sådanne prøver til rådighed for analyse og en større undersøgelse vil skulle gennemføres for at støtte denne konklusion

I et tilfælde, TMPRSS2:. ERG blev påvist i urin EVs men var fraværende i vævet til rådighed for analyse. Da hele-mount prostata sektioner ikke var tilgængelige for total kirtel analyse, er det muligt, at patienten kan have haft en TMPRSS2: ERG positivt fokus i et væv region utilgængelig for analyse. Dette understreger den potentielle fordel urin elbiler, da de kan afspejle en større andel af prostata volumen end, hvad der er opnåelige via andre prøveudtagningsmetoder såsom biopsi.

Evnen til at bruge tilfældige urinprøver (indsamlet uden prostata massage) tilladt os at analysere en lang række emner, herunder unge, raske mænd ( 35 år), der er angivet, som forventet, at meget få havde påviselig TMPRSS2: ERG niveauer (5% (2/40)). Dette var i modsætning til ældre mænd i Bx Pos (66%), Bx Neg (44%) og nr Bx (41%) patientgrupper. Dette tyder på, at sandsynligheden for en TMPRSS2: ERG fusion begivenhed kan stige over tid (dvs. med alderen), i overensstemmelse med tidligere rapporter om, at prostatakræft forekomsten stiger med alderen [27]. Vores opdagelse sats af TMPRSS2: ERG via exoRNA i Bx Pos patienter, var i toppen af ​​intervallet for, der tidligere er rapporteret for TMPRSS2: ERG detektion via urin celle analyse i prostatacancer positive patienter, der lå 37-69% (22/32 (69%) [28], 10/15 (67%) [26], 8/19 (42%) [21], 56/138 (41%) [22], 29/78 (37%) [25 ], 9/13 (69%) [29]) med satser afsløring så lave som 10/42 (24%), når der ikke prostata massage blev udført før urinopsamling [29] og 46/196 (24%), når en TMPRSS2 : ERG afsløring cut-off af 10 eksemplarer blev anvendt [30]. Hos patienter uden prostatacancer (bestemme via negativ biopsi), påvisning af TMPRSS2: ERG via urin celle analyse var lavere end vores opdagelse sats via EV analyse og varierede fra 7-21% (2/30 (7%) [25], 4/30 (13%) [26], 4/24 (17%) [28], 20/96 (21%) [22] og så lavt som 6% uden forudgående prostata massage, 15/247 (6%) [29] Mens der var et stort antal Bx Neg og nr Bx patienter med en påviselig TMPRSS2:. ERG fusion begivenhed i vores aktuelle undersøgelse, TMPRSS2: ERG ekspressionsniveauet (analyseret via RQ) var højest i Bx Pos gruppe i overensstemmelse med den . bekræftet forekomst af kræft Low-ekspression i Bx Neg og nr Bx grupper kan repræsentere falske RNA-transkripter snarere end forurening, da der var en fuldstændig mangel på TMPRSS2: ERG exoRNA (0% (0/40)) i 40 post- radikal prostatektomi patienter testet. anvendelsen af ​​et udtryk afskæringen som den anvendes af Leyten et al, [30] kan potentielt give for differentieringen mellem lav-niveau falsk genekspression (såsom det ses i Bx Neg og alder-matchede ingen Bx patienter) og stabil genekspression observeret i Bx Pos patienter. Man kan kun gisne om, hvorfor EV analyse viser mere positive TMPRSS2: ERG udtrykker patienter end analysen af ​​urin celler især i Ingen Bx og Bx Neg grupper. Et forslag kan være, fordi elbiler repræsenterer en større undersøgelse af prostata, da de konstitutivt slipper potentielt alle celler. Dette er i modsætning til analysen af ​​prostata afledt urin celler, som vendes ved en meget lavere hastighed. Således analysen af ​​elbiler i Bx Neg (og nr Bx) grupper kan give større mulighed for at afsløre falske TMPRSS2: ERG læser i forhold til urin prostata celle analyse

ERG genekspression niveauer blev også undersøgt for at fastslå, om. en korrelation mellem exoRNA udtryk for TMPRSS2: ERG og ERG var tydelig. Urinary EV resultater understøttes kraftigt tidligere rapporter, at øget ERG udtryk kan være forbundet med den TMPRSS2: ERG fusion begivenhed [12,18,31]. Analyse af ERG udtryk viste sig at klare sig bedre end analysen af ​​TMPRSS2: ERG udtryk i differentiere Bx Pos fra Bx Neg patienter. Dette kan skyldes TMPRSS2: ERG påvist ved vores assay kan udgøre kun en brøkdel af ERG relaterede fusionsbegivenheder [18]. Således kan vores analyse af ERG udtryk alene potentielt afhente ekstra ERG fusion begivenheder uden opdaget af vores TMPRSS2: ERG analysen med ERG alene en mere følsom markør i vores undersøgelse

For at undersøge brugen af ​​elbiler som en platform. til ikke-invasivt differentiere Bx POS og Bx Neg patienter uden prostata massage, analyserede vi evnen hos andre gener tidligere impliceret i prostatacancer at differentiere Bx POS og Bx Neg patienter ved hjælp urinvejene EV platform. Relativ kvantificering analyse viste, at exoRNA for BIRC5, ERG, PCA3 og TMPRSS2: ERG standardiseret til KLK3, differentierede Bx Pos fra Bx Neg patienter. AR udtryk ikke var i stand til at skelne mellem disse grupper. Denne tendens blev afspejlet i ROC analyse af disse gener. Det er svært at postulere, hvorfor dokumenterede ændringer i AR udtryk i kræft ikke var afspejlet i vores exoRNA undersøgelse, bortset fra at måske AR udtryk ikke er reguleret på mRNA niveau, men snarere på proteinniveauet.

Denne pilotundersøgelse viser potentiel anvendelighed af exoRNA at undersøge prostata-relateret genekspression isoleret fra en enkelt, tilfældig urinprøve. Specifikt EV analyse har en ~ 80% nøjagtighed til påvisning af TMPRSS2: ERG mutation, forudsat ingen falske negative i radikal prostatektomi prøver, og påvirkes af niveauet af genekspression i vævet. Evnen til at adskille Bx Pos fra Bx Neg patienter ved anvendelse af en ikke-invasiv urinprøve uden anvendelse af en prostata massage blev også demonstreret, og støtter den fremtidige udvikling af en potentiel EV baseret urin diagnostisk test for prostatakræft. Større årgange er nu behov for at bekræfte disse undersøgelser. Endelig skyldes den allestedsnærværende frigivelse af elbiler fra celler, er det muligt, at urin elbiler kan blive en roman, non-invasiv platform til at undersøge andre organer i urogenitale kanal, herunder nyrer og blære.

Støtte Information

S1 fig. Cartoon af Prostata vævssnit tages for komparativ analyse af TMPRSS2:. ERG genekspression i Tissue Versus Urinary exoRNA

Tegnefilm viser godartet (blå) og cancer (lyserød) regioner fra en radikal prostatektomi, der blev udvalgt til RNA ekstraktion og genekspression analyse . Tumor og godartede regioner er positive for TMPRSS2: ERG udtryk er angivet med en rød ‘+’. Negativ TMPRSS2: ERG udtryk angives med en blå ‘-‘. Purple ‘+’ bruges til at angive positiv TMPRSS2: ERG udtryk i en poolet prøve af væv. T: E-TMPRSS2: ERG, A-anterior, P-posterior, L-venstre, R-højre. ‘Niveau’ angiver det område af adspurgte for genekspression analyse (urinrøret til sædblærer) prostata

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154507.s001

(TIFF)

S2 Fig. Påvisning af mRNA-transkripter i FFPE Tissue.

Agilent Bioanalyzer DNA chip analyse af amplikoner genereret via PCR på ingen template-kontrol (NTC) og prøver med revers transkriptase reaktion (RT) og uden revers transkriptase (nr RT) reaktion. Den “NO RT” prøver undladt at generere amplikoner overensstemmelse med de RNA-specifikke primere og probe for hvert gen. Prøver undergår RT-reaktionen genererede amplikoner af lignende størrelse til ABI rapporterede amplikonstørrelse. NTC undladt at generere amplikoner tyder ingen forurening.