PLoS ONE: posttranskriptionel og Epigenetisk forordning af antigen forarbejdningsmaskiner (APM) Komponenter og HLA-I i livmoderhalskræft fra Uighur Women

Abstrakt

Normalt funktion af human leukocyt antigen klasse I (HLA-I) og antigen maskiner (APM) proteiner er nødvendig for T-celle-medieret anti-tumor eller antiviral immunitet, mens tumor overlevelse indikerer en fejl i vært i immun-overvågning i forbindelse med dysfunktion i antigen-præsentation, primært som følge af deregulering i HLA -I og APM udtryk eller funktion. Den posttranskriptionel regulering af HLA-I og APM udtryk kan associere med epigenetiske modifikationer i udvikling af kræft, som ikke var beskrevet hidtil. Her viste vi, at udviklingen af ​​cervikal intraepithelial neoplasi (CIN) og cervikal pladecellecarcinom (CSCC) i Uighur kvinder blev ledsaget med hel eller delvis tab af protein ekspression af HLA-I, ß2-m og APM bestanddele, herunder transportøren forbundet med antigen forarbejdning (TAP1 /2), lav molekylmasse protein (LMP2, LMP7), endoplasmatisk reticulum aminopeptidase 1 (ERAP1), chaperone molekyler indbefatter calreticulin (CLR), calnexin (CNX) og ERp57, og dette blev bevist igen ved analyse af transkription af de samme gener ud over tre gener HLA-A, B og C koder for HLA-i. Ved bisulfit sekventering tilgang, identificerede vi target CpG øer methyleret på genet promoter region TAP1, TAP2, LMP7, tapasin og ERp57 i cervikale carcinomceller. Yderligere analyse af CpG stedspecifikke methylering af disse gener i tilfælde af CSCC og CIN demonstrerede en omvendt korrelation af ændret CpG ø methylering af TAP1, LMP7, og ERp57 med ændringer i proteinekspression. Endvidere promotor methylering af disse gener var signifikant højere i tilfælde positive for human papillomavirus 16 (HPV 16) end negative. Vores resultater foreslog, at epigenetiske modifikationer er ansvarlige for afvigende ekspression af visse HLA-I og APM-gener, og kan hjælpe til at forstå uåbenbarede mekanismer tumorundvigelse fra immune overvågning i cervikal carcinogenese

Henvisning:. Hasim A, Abudula M, Aimiduo R, Ma JQ, Jiao Z, Akula G, et al. (2012) posttranskriptionel og Epigenetisk forordning af antigen forarbejdningsmaskiner (APM) Komponenter og HLA-I i livmoderhalskræft fra Uighur kvinder. PLoS ONE 7 (9): e44952. doi: 10,1371 /journal.pone.0044952

Redaktør: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, Sverige

Modtaget: 20. januar 2012; Accepteret: 14. august 2012; Udgivet: 14. september 2012 |

Copyright: © Hasim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet med midler fra den autonome region Xinjiang Uighur Fund (2009211B14) og National Natural Science Foundation of China (81.060.164). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

dannelsen og overlevelse af en tumor celle er et tegn på vellykket immun flugt og en fejl i vært immun overvågning og eliminering. Normale funktion af human leukocyt antigen klasse I (HLA-I) og antigen forarbejdningsmaskiner (APM) er en forudsætning for T-celle-medierede medfødte og adaptive immunresponser mod virusinfektion eller cellulær carcinogenese [1] – [3]. HLA-I er en central spiller og arbejder sammen med APM medlemmer i montage, lastning, og præsentere endogene antigene peptid samt regulere cellulære og humorale immunitet [4] – [5]. Således eliminering af tumorceller af immunsystemet i høj grad afhænger af ekspressionen af ​​APM og HLA-I.

I de senere år er der gjort fremskridt i forståelsen hvordan peptider præsenteret af HLA-I-molekyler. Især er det kendt som proteaser er inddraget, og hvordan intracellulære veje påvirke antigen præsentationer i professionelle antigenpræsenterende celler og i forskellige typer af malign sygdom [6] – [8]. APM af cellen er et komplekst system af interagerende proteiner, herunder proteasom subunits, lav molekylær-masse proteiner 2 og 7 (lmp2 og LMP7), transportører forbundet med antigen behandling 1 og 2 (TAP1 og TAP2), endoplasmatisk reticulum aminopeptidase 1 (ERAP1), og ER chaperoneproteiner calnexin, calreticulin, og tapasin. Derudover thiol oxidoreduktase ERp57 er ansvarlig for præsentation af HLA-I peptid-komplekser på celleoverfladen og er afgørende for genkendelse af viralt inficerede eller malignt transformerede celler, vedligeholdelse af selv-tolerance, og overvågning af nyligt opstået tumorer af immunsystemet [ ,,,0],9]. Nedregulering af HLA-I og APM komponenter er blevet observeret i mange tumorer og er tæt forbundet med tumor immunoevasion, vækst og metastatisk evne [6] – [8]. De molekylære mekanismer bag den relativt lave transskription af HLA-I og APM komponenter i kræftceller er stort set uforklarlige. Epigenetiske modifikationer af det menneskelige genom, herunder afvigende DNA methylering, repræsenterer tumor genetiske begivenheder, der funktionelt svarer til genetiske ændringer. Nedregulering af HLA-I-ekspression forårsaget af hypermethylering af HLA-I-generne er blevet dokumenteret i esophageal pladecellecarcinom, coloncarcinom og melanom-cellelinjer, og dette kunne vendes ved behandling med DNA methyltransferase-inhibitorer [10] – [11].

humant papillomvirus (HPV) -infektion spiller en central rolle i patogenesen af ​​cervikal intraepithelial neoplasi (CIN) og livmoderhalskræft med HPV-infektion for at være en nødvendig, men ikke altid tilstrækkelige, forårsage [12]. Udvikling af menneskelige livmoderhalskræft uden medvirken af ​​en specifik HPV er usædvanlig, og det er almindeligt accepteret, at der ud over HPV-infektion, andre cofaktorer, herunder endogene hormoner, genetiske faktorer, såsom HLA-I, og andre faktorer i forbindelse med værtens immunrespons kan have en vigtig rolle i udviklingen af ​​cervikale læsioner [13].

livmoderhalskræft i Uighur er opstået med høj sygelighed og dødelighed kvinder i Xinjiang-regionen og betragtes som en stor hændelse sygdom i regionen i Kina [14]. HPV-infektion menes at være den vigtigste årsag til cervikal udvikling cancer og infektion af virusset, især de højrisiko-HPV’er er påviselig i Uighur kvinder med livmoderhalskræft ved en hastighed sammenlignelig med andre populationer i og uden for Kina [15] . Vores tidligere undersøgelser har vist, at tendensen i tab på HLA-I proteinekspression var sammenlignelig for både kvinder fra Uighur og Han etniske grupper i livmoderhalsen udvikling af kræft, men det samlede tab på HLA-I i prøver fra livmoderhalsen pladecellekræft (CSCC) og dens forløber læsioner (CIN II eller III) var højere i Uighur kvinder (27% og 53%, henholdsvis) end i Han kvinder (18% og 37%, henholdsvis) [16]. Det ser ud til, at etniske forskelle kan have, til en vis grad, indflydelse på tumor udvikling på grund af de forskellige genetiske baggrund, levevilkår eller geografiske miljø. Derfor overvejer at afvigende overfladeekspression af HLA-I i livmoderhalskræft forbundet med høj-risiko HPV 16 infektion ofte forårsaget af fraværet af APM [17] – [18], ville man spørge, om epigenetiske modifikationer ville modulere overfladeekspression af HLA jeg direkte eller indirekte af tavshed eller inaktiverende af APM komponent gener og føre til udvikling af livmoderhalskræft i Uighur kvinder.

i denne undersøgelse fokuserede vi på 10 kandidatgener hører til HLA-i og APM familien, analyseret associering af cancerudvikling med ændret genekspression på forskellige niveauer, herunder genpromotor methylering, transkription, og proteinekspression. Disse data giver indsigt i ukendte mekanismer cervikal carcinogenese i forhold til forordningen HLA-I og APM udtryk og kan give med molekylær markør profil for tidlig diagnose baseret på påvisning af epigenetiske ændringer og ekspressionen af ​​disse gener. Desuden denne undersøgelse giver yderligere forståelse af virkningen af ​​HLA-I medieret antigen præsentation i antiviral eller anti-tumor-immunitet eller abnormiteter forårsaget af, eller fører til, livmoderhalskræft carcinogenese.

Materialer og Metoder

kliniske karakteristika og vævsprøver

Frisk eller formalin-fikseret og paraffin-embedded cervikale vævsprøver blev indsamlet fra Uighur kvinder med livmoderhalskræft planocellulært karcinom (CSCC) og cervikal intraepitelialneoplasi (CIN), eller uden livmoderhalskræft sygdomme , men behandles ved hysterektomi. Alle livmoderhalskræft patienter henvist mellem juni 2009 og marts 2010, fordi af livmoderhalskræft blev bedt om at deltage i vores undersøgelse i løbet af deres første besøg på Institut for Gynækologi af First Affiliated Hospital i Medical University of Xinjiang. Informeret samtykke opnåedes fra alle patienter og kontroller deltog i undersøgelsen. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i vores hospital.

gynækologisk undersøgelse blev udført i alle livmoderhalskræft kræftpatienter for mellemstationer i overensstemmelse med International Federation of Gynækologi og Obstetrik (Figo) kriterier. 152 tilfælde af formalin-fikseret, paraffinindlejrede (FFPE) vævsprøver blev opnået fra vævsprøven arkiv af den patologiske afdeling efter gennemgang af arkivers lysbilleder af erfarne patologer. De FFPE prøver (eller friske frosne cervikale væv beskrevet nedenfor) blev oprindeligt indsamlet under den indledende besøg i ambulatoriet eller ved gynækologisk undersøgelse eller efter operativ behandling under generel anæstesi. Af patienter med CSCC indskrevet i denne undersøgelse, var 29 FIGO stadie IIB, 25 FIGO stadie IIIB, 9 FIGO stadie IVB. Blandt dem var 28 tilfælde patologisk karakteriseret som godt differentieret, 19 moderat differentieret og 16 dårligt differentierede tumorer. Lymfeknudemetastase blev dokumenteret i 31 tumorpatienter. I alt 64 patienter med CIN blev udvalgt til denne undersøgelse, herunder 33 tilfælde med CIN I-II og 31 med CIN III. Den mediane alder livmoderhalskræft kræftpatienter var 49,5 år (IQ range 29-67 år). Kontrol tilfælde (n = 25) blev opnået fra patienter uden en historie af cervikale læsioner eller nogen form for kræft og planlagt at gennemgå en hysterektomi for ikke-maligne årsager i samme periode. Indikationer for hysterektomi var fibromer, prolaps uteri eller adenomyose eller hovedsageligt en kombination af fibromer med prolaps uteri.

Desuden 55 frosne biopsier, herunder 20 tilfælde af CIN, 20 CSCC og 15 kontrol tilfælde blev indsamlet i henhold til kriterierne beskrevet ovenfor, til påvisning af gentranskription ved semikvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR).

Immunohistokemisk Studies

immunhistokemisk (IHC) farvning blev udført med primær antistoffer, der genkender målproteiner og IHC Kits indeholdende biotin-mærkede sekundære antistoffer. muse mAb HLA klasse I tung kæde (HC-10,1:300; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) blev anerkendt som ß2-m-fri [19]. Kanin polyklonale anti-b2-m-antistof blev købt fra (1:100, Shanghai Jingtian, bioteknologi, Kina), TAP1 og TAP2 antistof (1:300, Santa Cruz Biotechnology, henholdsvis), LMP2 og LMP7 antistof (1:100 ; Abcam, Cambridge, MA, USA, henholdsvis), ERAP1 antistof (1:200, Abcam), ERp57 antistof (1:300, Santa Cruz Biotechnology), calnexin og calreticulin antistof (1:50, Shanghai Jingtian, bioteknologi, Kina, henholdsvis), og tapasin antistof (1:300, Santa Cruz Biotechnology). Kort fortalt blev 3-um-tykke snit skåret fra paraffinindlejrede vævsblokke. Efter at være blevet afvokset i xylen og rehydratiseret i alkohol og destilleret vand blev antigen hentes ved opvarmning i mikrobølgeovnen i 15 minutter ved 95 ° C i EDTA-buffer (pH 8,0). Efter afkøling og skylning i destilleret vand, blev endogen peroxidaseaktivitet blokeret ved inkubering sektioner i 15 minutter i 3% H

2O

2, efterfulgt af skylning i 0,01 M PBS (pH 7,4) i 10 minutter. Prøver blev præinkuberet med et protein blokeringsopløsning i 10 minutter og blev snittene inkuberet ved 4 ° C natten over i et fugtigt kammer med de angivne antistoffer, Objektglas blev vasket tre gange i PBS og derefter inkuberet med et biotinyleret sekundært antistof (Zhongshan Goldenbridge Bioteknologi Co. Ltd., Kina) i 15 minutter ved stuetemperatur. Reaktionsprodukterne blev visualiseret med diaminobenzidin (DAB Kit; Zhongshan Goldenbridge Biotechnology). PBS blev anvendt i stedet for det primære antistof som negativ kontrol og objektglas blev modfarvet med hematoxylin, dehydreret, og vurderet under lysmikroskop.

Procentdelen og intensiteten af ​​positivt farvede tumorceller i hver læsion blev undersøgt ved to patologer, der havde noget kendskab til patienternes karakteristika. En konsensus nummer blev nået for hver tumor prøve mellem de to efterforskere. Resultaterne blev scoret på en skala fra 0 til 3 med den procentsats og intensiteten af ​​positive celler blandt tumorceller. Procentdelen af ​​positive celler blev scoret som 0 til ≤10%, 1 for 11-25%, 2 til 26-50%, 3 for 51-75%, 4 for ≥76%. Intensiteten af ​​farvningen er som følger: 0 angiver fravær af farvning, 1 angiver svag farvning, 2 angiver moderat farvning, og 3 angiver intens farvning. Summen af ​​de to scoringer blev anvendt til at identificere tre kategorier af udtryk: normal udtryk (total score 7-8), delvis tab af udtryk (3-6), og samlede tab af udtryk (0-2). IHC farvning demonstrerede stærkt udtryk af HLA-I i stromale væv og tumor-infiltrerende inflammatoriske celler, hvilket giver en intern positiv kontrol, som foreslået af en tidligere undersøgelse [20].

RNA Extraction og Semi-kvantitativ RT- PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra patienternes væv under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) som anbefalet af producenten. MRNA’et (1 ug) blev revers transkriberet til cDNA med RevertAid (MBI Fermentas, Burlington, Ontario, Canada) ved 42 ° C i 60 minutter. CDNA’et (20 ng) blev amplificeret ved PCR i en 25 pi blanding under følgende betingelser: 95 ° C i 1 min, efterfulgt af 25 eller 30 cyklusser af denaturering ved 95 ° C i 30 sek, annealing ved 60 ° C i 30 sekunder, og syntese ved 68 ° C i 1 min, og en endelig udvidelse ved 68 ° C i 10 minutter. PCR-produkter blev adskilt på en 4% agarosegel, visualiseret med GoldView I (Beijing Solarbio Co, Beijing, Kina) for ultraviolet detektion og kvantificering af Gel Imaging System og professionel software (GelDoc XR, Bio-Rad Laboratories, CA, USA) . Hver analyse blev gentaget mindst to gange for at sikre gengivet mRNA, β-actin mRNA blev anvendt som en intern lastning og normalisering kontrol. Frem og bak primerpar og deres produkter er anført i tabel S1

cellelinier

SiHa humane carcinomceller blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). . Celler blev dyrket i RPMI 1640-medier (Invitrogen) suppleret med 10% FCS, L-glutamin og antibiotika (Sigma-Aldrich).

DNA Extraction, bisulfitbehandling, og bisulfit sekventering PCR (BSP)

DNA blev ekstraheret fra SiHa celler under anvendelse af et DNA-ekstraktion kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), og genomisk DNA (500 ng) blev bisulfit modificerede hjælp af EZ Methylering Gold kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) ifølge producentens anvisninger [21]. CpG ø fragment specifikke primere blev designet ved at scanne gen promotorregioner bruger specialiserede Methyl Primer Express software (ABI selskab) baseret på genetisk information fås fra Genbank databasen. Bisulfit behandlede DNA fra cervicale cancerceller blev PCR-amplificeret. Primere anvendt til efterfølgende amplifikationer er opført i tabel S2. Komplet bisulfit modifikation blev bekræftet ved sekvensanalyse. BSP amplifikationer blev udført i 50-pi reaktionsblandinger indeholdende 2 pi bisulfit modificerede genomisk DNA, 2 pi dNTP’er, 1,2 pi primere, 2 pi MgCl

2, 20 nM ammoniumsulfat,

. 75 nM Tris-HCI (pH 8,3), og 3 U Taq DNA-polymerase. Touch-down PCR-ordningen blev anvendt til amplifikation med følgende cykliseringsbetingelser: 95 ° C denaturering i 15 min, 95 ° C i 20 sekunder, annealing temperaturer fra 62 ° C til 56 ° C i 1 min, forlængelse ved 72 ° C i 1 min i 45 cyklusser, og endelig inkubering ved 72 ° C i 7 min. Udglødningstemperaturer var som følger: HLA-B: 60 ° C, TAP1:62 ° C, TAP2:56 ° C, LMP: 60 ° C, LMP2:58 ° C, tapasin: 58 ° C, ERAP1:62 ° C, og ERP57:56 ° C. PCR blev efterfulgt af kloning i vektorer og sekventering for at identificere bindingssteder for CpG i forbindelse med genpromotor methylering.

Genomisk DNA Isolation og kvantitativ DNA-methylering Analyse

Genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af et QIAamp DNA Mini Kit ( QIAGEN, Valencia, CA). Til kvantitativ påvisning af methyleret DNA, blev MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA, USA) anvendes til at analysere den cervikale væv DNA for CpG-indhold. Målgen specifikke primerpar blev anvendt til at sammenligne methylering niveauer af mål-fragmenter og CpG sites blandt forskellige prøver efter producentens anvisninger og som tidligere beskrevet [22] – [23]. De analyserede regioner og CpG-stederne i kandidat-gen promotorer er vist i tabel S3. De anvendte primere blev designet i henhold til Sequenom Standard EpiPanel (Sequenom november 2007-udgaven og tabel S4). PCR-amplifikation blev udført med de følgende parametre: PCR-blandingen indeholdt 10 ng behandlet med bisulfit DNA, 200 mM dNTP’er, 0,2 U Hot Start Taq DNA polymerase (QIAGEN), og 0,2 mm foran og reverse primere i et totalt volumen på 5 pi. Cyklerne omfattede en varm start ved 94 ° C i 15 minutter, efterfulgt af denaturering ved 94 ° C i 20 sekunder, annealing ved 56 ° C i 30 sekunder, forlængelse ved 72 ° C i 1 min (45 cykler), med en endelig inkubation ved 72 ° C i 3 minutter. Ikke-inkorporerede dNTP’er blev dephosphoryleret ved tilsætning af 2 ml præmix herunder 0,3 U reje alkalisk fosfat (SAP, Sequenom). Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 37 ° C i 40 min og SAP blev derefter varmeinaktiveret i 5 minutter ved 85 ° C. Efter SAP behandling blev 2 ml af PCR-produktet anvendes som en skabelon for

in vitro

transskription og RNase A-spaltning blev anvendt til den omvendte reaktion, ifølge producentens instruktioner (Sequenom). Prøverne blev konditioneret og spottet på en 384-pad Spectro-chip (Sequenom) under anvendelse af en MassARRAY nanodispenser (Samsung, Irvine, CA, USA), efterfulgt af spektral erhvervelse på en MassARRAY analysator kompakt MALDI-TOF massespektrometer (Sequenom). De methylering analyser blev udført ved hjælp af EpiTYPER ansøgning (Sequenom) til at generere kvantitative resultater for hver CpG websted eller et aggregat af flere CpG sites.

Bestemmelse af HPV genotyper

Genomisk DNA blev ekstraheret fra cervikale væv under anvendelse af en QIAamp DNA Mini Kit? (QIAGEN, Düsseldorf, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Koncentrationen og renheden af ​​DNA blev bestemt ved absorbans ved 260 og 280 nm. HPV-genotyper blev påvist ved anvendelse humant papillomvirus Genotypning Diagnose Kit (yjkuang Genetel Pharmaceuticals, Shenzhen, Kina) og analyseret ved hjælp af HPV-genotyper mikromatrice reader-system (HPV-GenoCam-9600, yjkuang Genetel Pharmaceuticals, Shenzhen, Kina)) som beskrevet [24]. Kort beskrevet blev HPV-DNA ekstraheret og PCR amplificeret under anvendelse af følgende parametre: denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 30 sekunder, 52 ° C i 45 sekunder, og 65 ° C i 90 sek. Ved slutningen af ​​den sidste cyklus blev blandingen inkuberet ved 65 ° C i 5 minutter. Genet chippen var forberedt, PCR-produkter hybridiseret, og visualiseret.

Statistiske Analyser

Alle statistiske analyser blev udført med SPSS version 17 softwarepakke. Alle P-værdier var tosidede og signifikansniveau var

P

0,05. Mann-Whitney-test blev anvendt til at teste kontinuerlige variabler for forskelle i immunohistokemisk farvning scores mellem tumor og normalt væv for HLA-I og APM komponenter. Fishers eksakte test blev anvendt til evaluering af associationer med kliniske patologiske parametre. Kvantitative DNA methylering data fra MassARRAY blev behandlet som kontinuerte variable og manglende målinger blev tilregnet i multivariable regressionsanalyser bruger prøver med erstatning for de nonmissing værdier (single beskyldninger). Lineære sammenhænge mellem 2 kontinuerlige variabler blev kvantificeret af Pearson korrelationskoefficient.

Resultater

APM Component og HLA I Expression i Livmoderhalskræft Læsioner

Alle antistoffer blev testet på formalinfikserede fast, paraffin-indstøbt, normale cervikale væv, CIN og CSCC. Repræsentative farvningsmønstre for HLA klasse I tunge kæder, ß2-M og APM komponenter er vist i fig. 1 og fig S1. Som vist i figur 1, blev Farvning af HLA klasse I tunge kæder og ß2-m lokaliseret på cellemembranerne i det cervikale epitel og interstitielle celler, hvorimod APM komponenter farvning hovedsagelig blev lokaliseret i cytoplasmaet af cervikal epitel. Anti HLA klasse I og anti ß2-m antistoffer viste stærk farvning af cellemembraner i normal cervikal væv, mens en meget variabel udtryk profil i CIN og CSCC vævsprøver, der spænder fra delvis tab til totalt tab af udtryk, men faldt udtryk, til normal ekspression. Ekspression af HLA klasse I tunge kæder, ß2-M og APM bestanddele er sammenfattet i tabel 1.

A-C. Farvningsmønstre af HLA-I, ß2-m og ERAP1 hhv. (Andre APM komponenter TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, calnexin, calreticulin, ERp57, og tapasin farvning vist i figur S1), Paneler A1-C1 skildre normale livmoderhalsen væv med normal proteinekspression. Paneler A2-C2 viser cervikal intraepithelial neoplasi med delvis tab af protein-ekspression. Paneler A3-C3 viser livmoderhalskræft med svag eller totalt tab af protein-ekspression.

Af de 64 sager, CIN og 63 tilfælde CSCC indskrevet i denne undersøgelse (tabel I og figur 2), proteinet ekspressionsniveauet af HLA klasse i og APM bestanddele blev ændret fra normal ekspression til delvist tab eller totalt tab, med udviklingen af ​​den normale epitel i livmoderhalsen til CIN og CSCC. Det samlede tab af protein-ekspression var bemærkelsesværdig for de fleste medlemmer af HLA klasse I og APM familie i CSCC sammenlignet med CIN eller normale kontroller, bortset fra CNX og CRT. Den delvise tab af protein-ekspression af HLA-I, ß2-m, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, ERAP1, tapasin og ERp57 var statistisk signifikant for CIN tilfælde sammenlignet med normale kontroller.

Analyser clinicopathologic egenskaber ( tumor grad, klinisk fase og lymfeknude metastaser) med protein ekspressionen af ​​HLA-i og APM komponenter (TAP-1, TAP-2, LMP2, LMP7, Tapasin, ERAP1, CNX, CRT og ERp57) i cervikale cancer.Results er repræsenteret som procent (%). øvre histogram A1 show HLA-I og APM komponenter udtrykt i godt differentieret tumor, A2 show udtrykt i moderat til dårligt differentieret tumor. B1 show udtrykt i ≤II en tumor og B2 viser udtrykt i ≥II B, C1 show udtrykt i lymfeknude metastaser negativ tumor og C2 viser udtrykt i lymfeknudemetastaser positiv tumor, hhv. *

P

0.05.

Sammenhængen mellem ekspression af HLA klasse I, ß2-m, og APM komponenter og klinisk-patologiske egenskaber blev undersøgt i CSCC læsioner. Som det kan ses i figur 2A, der var en omvendt korrelation med nedregulering af HLA-I, ß2-m TAP1, LMP7, og ERp57 proteinekspression og tumor differentiering kvalitet. Brug af Figo mellemstationer kriterier, ERp57 proteinekspression var signifikant lavere i nederste trin tumorer end i højere stadier (figur 2B). Desuden nedregulering af HLA-I, TAP1, LMP7, tapasin, CRT, og ERp57 havde en omvendt korrelation med lymfeknudemetastaser (figur 2C). Begge korrelationer var statistisk signifikante (P 0,05). Den nedregulering af ß2-m, TAP1, TAP2, LMP7, ERAP1, tapasin, og ERp57 proteinekspression positivt associeret med HLA-I-ekspression i CIN læsioner, mens SS2-m, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, ERAP1, ERp57, og tapasin udtryk positivt associeret med HLA-i i kræft. Nedregulering af enhver APM komponent undtagen calnexin og calreticulin var signifikant associeret med HLA klasse I nedregulering i CIN og CSCC (P 0,05).

For yderligere at verificere resultaterne af immunhistokemisk farvning analyse, opdaget vi transkriptionen af ​​HLA klasse i og APM bestanddele ved semi-kvantitativ RT-PCR. Ekspressionsniveauet af HLA-A, -B og -C koder for HLA-I var lavere i både CIN og CSCC end i kontroller (figur 3). De udskrifter af TAP-1/2 og LMP2 /7 var svært at opdage, og ingen transskription af Tapasin og ERp57, i CIN og CSCC væv. Imidlertid blev ingen forskel fundet for CNX og CRT transskription mellem CIN eller CSCC og kontroller (figur 4). Selvom prøverne for RT-PCR og IHC-analyse var fra forskellig oprindelse, disse resultater antydede, at tendensen i nedregulering af målgenekspression både transkriptionel og translationel niveau var sammenlignelig i udviklingen af ​​livmoderhalskræft, især i patogenesen af ​​forstadielæsioner.

M: 100-600 bp markør stiger. Banerne 1 viser normal cervikal væv, 2 og 3 viser CIN, 4 viser CSCC væv. mRNA niveauer blev normaliseret for p-actin mRNA (D). Manglen mRNA-ekspression af en enkelt allel af HLA-I vil påvirke den normale overfladeekspression af HLA-I molekyler ifølge påvist ved IHC protein.

Ekspressionsniveauer af APM komponenter (TAP-1, TAP-2, LMP2, LMP7, Tapasin, ERAP1, CNX, CRT og ERp57) blev analyseret ved Semi-kvantitativ RT-PCR i normalt livmoderhalsen væv, CIN og CSCC. Sammenlignet med kontrollen, CIN og CSCC, blev mRNA-niveauer normaliseres til p-actin mRNA. Den øvre histogram har vist ekspressionsniveauerne af de APM bestanddele i i normal uterin cervix væv, CIN og CSCC. Resultaterne af RT-PCR er repræsenteret som middelværdi ± SD fra 15 kontroller, 30 CIN og 33 CSCC hhv. *

P

0.05.

methylering Profiler af APM Gene Familie i en CSCC cellelinje

På grund af det teoretiske forhold mellem gen promoter hypermethylering som en epigenetisk modifikation med nedregulering af gentranskription, vi analyseret HLA-B, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, ERAP1, tapasin, og ERp57, på grund af nedregulering af disse gener i livmoderhalskræft eller forstadielæsioner, for status for methylering af CpG-øer i promotorregionen i SiHa cervical carcinoma celler ved bisulfit sekventering tilgang. Ved forstærkning af target CpG øer identificeret ved professionel software med bisulfate sekventeringsprimere (BSP, figur 5) ved hjælp af genomisk DNA som skabelon, og efterfulgt af kloning og sekventering, vi fandt forskellige udstrækninger af CpG stedet methylering af TAP1, TAP2, LMP7, tapasin og ERp57 gener. Der blev imidlertid ikke methylering detekteret for HLA-B, LMP2, og ERAP1. Alle de CpG-stederne i methylerede kandidatgener er vist i tabel S4, hvor placeringen af ​​primere blev præsenteret i understregninger, målrette bindingssteder for CpG i kursiv og methylerede CpG’er med fed.

Hver lodret indikerer en individuel CpG websted . Optrukket linje positioner BSP primere. Alle BSP primere er designet til at dække det transkriptionelle startsted bør være tæt på transskriptionsstartstedet. Paneler AH skildre HLA-B, TAP-1, TAP-2, LMP2, LMP7, Tapasin, ERAP1 og ERp57.

DNA Methylering i cervixlæsioner og dens Association med mRNA ekspression og HPV-infektion

Ved tilgang med Sequenom MassARRAY platform for kvantitativ påvisning af denatureret DNA, fandt vi, at den globale methylering niveauet af target CpG øer af TAP1, LMP7 og ERp57 generne var signifikant højere i genomisk DNA af CSCC end i både CIN eller normal kontroller (

P

0,05), men ingen forskel blev fundet for TAP2 og tapasin (tabel 2). Den methylering niveau TAP1 var signifikant højere i både CIN og CSCC end i kontrollerne (

P

= 0,015 og 0,001 henholdsvis). Af LMP7 og ERp57 gener, methylering niveau i CSCC, men ikke i CIN, signifikant forskellig fra kontrolgruppen (

P =

0,001). Yderligere analyse af enkelt CpG stedspecifikke methylering inden TAP1, LMP7, og ERp57 angivet en betydelig stigning i methylering niveau af de fleste af de CpG steder på mål CpG øerne TAP1, LMP7, og ERp57 gener i CSCC sammenlignet med kontroller, mens der ikke statistisk signifikans blev fundet mellem CIN og kontrol (

P

0,05).

Yderligere analyse af de data, der resulterede fra den kvantitative analyse af enkelt CpG websted methylering af Sequenom MassARRAY platform, har vist, at TAP1 genet indeholder 23 CpG sites og niveauet methylering mellem to eller tre CpG websteder fra CpG_1, CpG_2.3, CpG_4, CpG_16, CpG_19, CpG_20, CpG_21, CpG_22 og CpG_23 forbundet med hinanden, men ingen sammenhæng blev fundet for den forholdet methylering af andre CpG sites. LMP7 gen indeholder 22 CpG sites og niveauet methylering mellem CpG_1, CpG_2, CpG_6, CpG_8, CpG_9, CpG_12, 13, 14, CpG_20 og CpG_22 forbundet med hinanden. ERp57 gen indeholder 9 CpG steder, hvor CpG_1, CpG_2, CpG_5, CpG_6, CpG_7 har betydning mellem kontrol og kræft gruppe. Selv om der ikke statistisk signifikans blev fundet af hele mål CpG fragment methylering niveau TAP2 mellem tre grupper, analyse af data skyldes kvantitativ analyse af TAP2 enkelt CpG websted methylering har vist, at der var betydelige forskelle i methylering niveau CpG_8 sites mellem CSCC og kontroller, men ingen sammenhæng blev fundet for methylering forholdet mellem andre CpG sites (

P

0,05).

Desuden sammenlignende analyse af TAP1, LMP7, og ERp57 methylering med proteinet ekspressionsniveauer og HPV16 infektion højrisiko viste en omvendt korrelation af ændret CpG ø metylering med ændringer i protein ekspression af tilsvarende gener. Desuden methylering niveauet af disse gener var signifikant højere i tilfælde positive for HPV 16 infektion end i negative (tabel 3 og 4).

Diskussion

Reduceret immunokompetence forbundet med nedregulering af HLA-i-ekspression er ofte blevet rapporteret for patienter med øget tumorinvasion og metastase, hvilket indebærer, at den funktionelle abnormitet af HLA-i i cellulær antigenpræsentation sandsynligvis være en vigtig begivenhed i tumorudvikling og progression [20], [ ,,,0],25] – [26]

i denne undersøgelse har vi undersøgt sammenhængen mellem cervical carcinogenese og patogenese af dets precursor læsioner med afvigende regulering af HLA-i og APM-ekspression på forskellige niveauer, herunder genpromotor methylering, transkription. og proteinekspression.