PLoS ONE: Image-vurdering af vækst og signalændringer i cancerceller medieret af direkte celle-celle Kontakt

Abstrakt

Baggrund

Mange vigtige biologiske processer styres gennem celle-celle-interaktioner, herunder koloniseringen af ​​metastatiske tumorceller og kontrol af differentiering af stamceller inden for deres niche. På trods af den afgørende betydning af det cellulære miljø i reguleringen cellulær signalering,

in vitro

metoder til studiet af sådanne interaktioner er vanskelige og /eller indirekte.

Metode /vigtigste resultater

Vi rapporterer om udviklingen af ​​et billede-baserede metode til at skelne to celletyper dyrkes i cokultur. Endvidere celler af en type, der er i direkte kontakt med celler af en anden type (tilstødende celler) kan analyseres separat fra celler, der ikke inden for en enkelt brønd. Ændringer evalueres ved anvendelse befolkningsstatistik, som er nyttige i detektion subtile ændringer på tværs af to populationer. Vi har anvendt dette system til at karakterisere ændringer i LNCaP prostatacarcinom-cellelinie ved dyrkning i kontakt med humane vaskulære endotelceller (HUVEC’er). Vi finder, at udtrykket og fosforylering af WWOX reduceres i LNCaP celler, når der dyrkes i direkte kontakt med HUVEC’er. Reduceret WWOX signalering er blevet forbundet med nedsat aktivering eller ekspression af JNK- og p73. Vi finder, at P73 niveauer også reduceres i LNCaP celler dyrket i kontakt med HUVEC’er, men vi havde ikke iagttage en sådan ændring i JNK niveauer.

Konklusioner /Betydning

Vi finder, at metoden er statistisk robust og kan tilpasses til en bred vifte af undersøgelser, hvor cellefunktion eller signalering påvirkes af heterotypisk celle-celle-kontakt. Ironisk nok, en potentiel udfordring til metoden er den høje grad af følsomhed er i stand til at klassificere begivenheder som statistisk signifikant (på grund af det store antal celler evalueret individuelt), når den biologiske effekt kan være mindre klar. Den metode ville være bedst anvendes sammen med yderligere metoder til at evaluere den biologiske rolle af potentielt subtile forskelle mellem populationer. Men mange vigtige begivenheder, såsom etablering af en metastatisk tumor, fremkommer via sjældne men vigtige ændringer, og metoder som vi beskriver her, kan anvendes til at identificere og karakterisere miljøets bidrag til disse ændringer.

Henvisning: Lapan P, Zhang J, Hill A, Zhang Y, Martinez R, Haney S (2009) Billed-Based Vurdering af vækst og signalændringer i cancerceller medieret af direkte celle-celle-kontakt. PLoS ONE 4 (8): e6822. doi: 10,1371 /journal.pone.0006822

Redaktør: Andreas Bergmann, University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: 20. april, 2009; Accepteret: 13 Juli 2009; Udgivet: 31 August, 2009

Copyright: © 2009 Lapan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en kompleks sygdom, der ofte karakteriseres som. dysreguleret vækst [1]. Mens roden af ​​kræft celledeling er resultatet af et tab af vækst og cellecyklus myndighedskontrol inden kræftcellerne selv, ændringer i den måde kræftceller interagerer med det omgivende miljø er også afgørende for tumor udvikling og klinisk cancer [2], [3]. Disse omfatter proliferative og invasive signaler transmitteret fra stromale celler og proangiogene signaler fra cancerceller til endotelet. Disse interaktioner mellem kræftceller og deres omgivelser har været sværere at karakterisere og målrette for terapeutisk intervention end iboende ændringer kræftceller, da

in vitro

modeller af celle-celle interaktioner er vanskeligt at etablere og standardisere, især på skalaen nødvendigt til lægemiddelscreening. På trods af disse vanskeligheder, har samspillet mellem kræftceller og deres omgivelser vist sig at være en effektiv strategi til behandling af kræft [4], og derfor øget opmærksomhed på, hvordan kræftceller fungerer som tumorer er en vigtig problem.

Metoder til

in vitro

undersøgelse af cancer celle interaktioner med stromale og endotelceller er blevet udviklet, såsom hvordan kræftceller inducerer angiogenese og rekruttere makrofager [5] – [8]. Relaterede fremgangsmåder tillader studiet af intercellulær signalering gennem en cokultur fase til induktion parakrin og heterotypiske kontakt-afhængige ændringer, efterfulgt af separation af de celletyper til kvantificering af transskriptionsprofilering, western blotting eller beslægtede metoder. Evnen til at påvise ændringer i prøver dyrket i direkte cokultur, blandet monokultur (ved brug af indsatse eller relaterede fysiske barrierer), og standard monokultur hjælp aircondition medier tillader sådanne processer, der kan henføres til bestemte niveauer af interaktioner. Mens værdifuld, disse systemer bære begrænsninger ved at stole på reaktioner, der skal midles over hele prøven for hver behandling, og typisk involverer betydelig bearbejdning for at adskille celletyper efter direkte cokultur at generere homogene prøver til profilering eller beslægtede analyser. Integrationen af ​​kvantitative fluorescens mikroskopi (High Content Screening, eller HCS) i den tidlige lægemiddelopdagelsesprocessen og biologisk grundforskning [9] – [11] giver metoder til at forbedre cokultur studier ved at lette direkte måling af morfologi, proliferation og cellulær signalering i celler dyrket i direkte kontakt med forskellige celletyper.

Vi har udviklet og afprøvet en algoritme til kvantificering ændringer i epitelcancerceller dyrket i direkte kontakt med endothelceller. Fremgangsmåden identificerer celletype og placering for at bestemme nærhed af endotelceller for cancerceller, og kvantificerer cellulære funktioner, herunder celle sundhed, og omfanget af aktivering af signalveje for celler tilstødende til endotelceller og sammenligner disse funktioner til epitelceller, der er ikke -adjacent til endotelceller. Processen kan vendes, til at karakterisere ændringer i endotelceller, der skyldes interaktioner med cancerceller. Virkningen af ​​kræftceller på endotelceller kan måles ved at sammenligne disse to grupper inden for samme prøve uden separering af celler. Vi demonstrerer tilgang med prostata og bryst kræftceller, og validerer den ved at demonstrere, at genekspression ændringer identificeret i transkriptionelle profilering undersøgelser er observeret i prøver undersøgt med de metoder, der er beskrevet.

Materialer og metoder

Cells, medier, reagenser og dyrkningsbetingelser

HUVEC-celler blev indkøbt fra Cambrex (Cat #: CC-2519) og opretholdt i EBM-2 medium (endotelcellevækst medium: CC-3162 med 2% FBS) , HUVEC-celler blev dyrket i ikke mere end ti passager. Den prostatacancer LNCaP (ATCC, Manassas, VA) blev dyrket i RPMI1640 tilsat glutamat, ikke-essentielle aminosyrer, penicillin-streptomycin og 10% FBS (alle fra Invitrogen, Carlsbad, CA).

Mus anti-CD31 (Cat #: 550.389) var fra BD Pharmingen (San Diego, CA), Mouse anti-CDw75 (IgM) (Cat #: ab9515-500) var fra Abcam (Cambridge, MA), kanin-anti WWOX (28- 42) (Kat #: AP1008) var fra Calbiochem /EMD Chemicals (Gibbstown, NJ), kanin anti- (pThr33) WWOX (Kat #: AP1009), var fra Calbiochem /EMD Chemicals, muse-anti P73 (Cat #: 32- 4200) var fra Zymed /Invitrogen, muse-anti-c-Jun (Cat #: OP55) var fra Calbiochem, muse-anti-JNK1 (Cat #: MAB17761) var fra R anti-WWOX, anti-pWWOX, anti-P73, anti-c-Jun, anti-JNK1 blev alle anvendt i en fortynding på 1:100. Efter tre gange vask med PBS, Alexa-mærkede sekundære antistoffer (Molecular Probes /Invitrogen) tilsat ved en 1:200 fortynding og DAPI blev tilføjet til plet kerner, som angivet i figurteksterne.

cokultur, separation og RNA forberedelse til Transskription Profilering

LNCaP og HUVEC-celler blev ekspanderet separat i T75-kolber. HUVEC’er blev dyrket til 70% konfluens, på hvilket tidspunkt 7 × 10

5 LNCaP-celler blev udsået, og celler blev dyrket i EBM2-2% FBS i 48 timer. Celler blev trypsinbehandlet og resuspenderet i 1 ml (for en T75 kolbe) iskold PBS /0,1% BSA ( 4 × 10

6 celler /ml), 25 pi CD31-bundne Dynabeads (4 × 10

8 perler /ml) (Invitrogen: 111-55D) tilsat, blandet godt og inkuberet ved + 4C under forsigtig vipning og rotation i 20 min. 1 ml iskold PBS /0,1% BSA blev tilsat, og prøven blev anbragt på en Dynal MPC (Magnetic Particle Concentrator, Invitrogen) i 2 minutter for at sedimentere perlerne. Supernatanten, som indeholdt LNCaP-celler, blev reddet separat, og perlerne blev resuspenderet i 1 ml iskold PBS /% 0.1BSA igen, og supernatanten blev fjernet og gemt. Vaskeprocessen blev gentaget 4 gange, og supernatanterne hældt sammen. Puljen blev spundet ned, og pelleten blev mærket LNCaP fraktion og perlerne blev mærket som HUVEC fraktionen. RNA lysepuffer blev tilsat til begge fraktioner, og RNA blev oprenset under anvendelse af et Qiagen miniRNA kit (Valencia, CA). mRNA prøver blev fremstillet og forarbejdet til transskriptionsprofilering hjælp af Affymetrix U133A GeneChips som tidligere beskrevet [12].

Proximity algoritme

Cell cokulturer farves med DAPI, som vil farve kerner af alle celler og en anden celletype specifik farvning. Vi bruger enten CD44 til identifikation HUVEC-celler eller CDw75 at identificere LNCaP-celler. Fluorescens kvantificeres ved anvendelse af en Cellomics VTi højt indhold scanner. Billeder blev analyseret i CellProfiler [13] billede x-y koordinat placering af en kerne inden for et givet billede. Under anvendelse af de nukleare x-y-koordinater, kan x- og y-forskydninger af en celle fra en anden celle beregnes. Disse forskydninger giver længden af ​​siderne i en retvinklet trekant.

afstanden d mellem beregnes ved hjælp af disse forskydninger og Pythagoras ‘læresætning de to kerner, whereand er x afstanden mellem x

1 og x

2 og er y afstanden mellem y

1 og y

2. Hvis afstanden d er mindre end den gennemsnitlige diameter af cellerne, er de to celler anses for at være ved siden af ​​hinanden. Derimod hvis afstanden d er større end den gennemsnitlige diameter af cellerne, er de to celler anses for at være ikke-tilstødende. Den gennemsnitlige diameter af cellerne blev bestemt ved tabulerer den “MajorAxisLength” og “MinorAxisLength” værdier, som blev beregnet ved CellProfiler for et sæt af referencebilleder.

nukleare afstand, og CDw75-farvning eller CD44-farvning blev derefter anvendes til at bestemme, hvilke HUVEC-celler var i kontakt med en LNCaP cellen gennem den følgende proces. Det første trin omfatter identificering alle celler i den samlede cokultur befolkning ved hjælp af den nukleare pletten DAPI. Det andet skridt er at opdele befolkningen i alle celler i to subpopulationer, de celler, pletten med CD44 (HUVEC) og dem, der pletten med CDw75 (LNCaP). Endelig er den tredje trin er yderligere at underinddele epitel befolkning i to subpopulationer, disse LNCaP-celler der støder op til en HUVEC celle og de ikke-tilstødende til en HUVEC celle. En liste over alle LNCaP celler (CDw75 positive eller CD44 negativ) og HUVEC celler (CDw75 negativ eller CD44 positiv) blev konstrueret. Pythagoras afstand for hver LNCaP-forhold til hver HUVEC celle blev beregnet. Afstandene mindre end den gennemsnitlige diameter af et LNCaP-blev markeret som LNCaP-celler tilstødende til HUVEC-celler.

KS statistik

Tilstødende og ikke-tilgrænsende subpopulationer af celler blev identificeret ved anvendelse af den tidligere beskrevne nærhed algoritme. Intensiteten af ​​et antigen af ​​interesse blev sammenlignet på tværs af disse to populationer ved hjælp af ks.test funktion i programmeringssproget R (www.r-project.org). En to-sidet ks.test p-værdi på mindre end 0,05 blev anvendt til at udlede, at de to delpopulation distributioner ikke kom fra samme forælder distribution.

Mosaik analyse af tilstødende og ikke-tilstødende LNCaP celler

for dataene vist i figuren, blev to brønde i betragtning. Ud fra disse to brønde, 3428 LNCaP-celler var til rådighed, og kategoriseres som enten tilstødende (655) eller ikke-tilgrænsende (2773). Fra disse celler, blev alle mulige 655 tilstødende celler valgt, og 1000 ikke-tilstødende celler blev tilfældigt udtaget. For at gøre en kvadratisk mosaik, blev de første 625 celler fra hver af disse prøver vises i en 25 x 25 matrix af billeder. Hver celle billede var en 10 x 10 pixel firkant, centreret på (x, y) koordinater for en celle. Channel 3 billeder (P73) blev vist ved hjælp af standard HSV farvekort, med faste 12-bit farve grænser (intensiteter fra 0-4096), således at intensitet skalaer var den samme for alle billeder.

Resultater

Udvikling af et billede-metode til undersøgelse af endotelceller i direkte kontakt med kræftceller

Gennem indirekte immunofluorescens af celle typespecifikke antigener, har vi været i stand til at identificere forhold, der tillader cellerne i forskellige oprindelser skal mærkes for HCS. Betingelser for specifikt mærkning HUVEC-celler er allerede blevet beskrevet, ved anvendelse af antistoffer specifikke for PECAM eller CD31 [14]. En sådan mærkning bruges til flowcytometri-baserede undersøgelser, og som sådan var der en stor sandsynlighed for, at en sådan opdagelse ville være muligt i en Tilhænger kultur-system. Antistoffer blev opnået fra kommercielle kilder og med minimale screening fiksering og farvning betingelser blev bestemt. En bred vifte af kandidat markører er tilgængelige til påvisning af prostatacarcinomceller, især prostata-specifikt antigen (PSA) og prostata-specifikt membran-antigen, som begge er klinisk relevant for prostatacancer (selvom PSA selv er et udskilt protein, dets produktion kan påvises inden for prostata kræftceller) [15]. Yderligere kandidat markører indbefatter tumorantigener, der normalt viser stærkt begrænsede ekspression (typisk til føtale eller begrænsede typer voksent væv). Et eksempel fra denne sidste kategori er CDw75, en celle-overflade markør for B-celle-lymfocytter frembragt af en beta-galactosid alfa-2,6-sialyl-transferase [16]. Ekspression af CDw75-antigener er blevet observeret i mange epiteliale cancere, såsom maven, og colon [17], [18]. I en skærm af kandidat markører til påvisning af prostatacarcinomceller i cokultur med endotelceller, fandt vi, at CDw75 var en specifik markør for alle tre prostata-cellelinier, der undersøges. Cokultur eksperimenter viste, at de celletyper kunne være let og endelig identificeret ved hjælp af antistoffer mod disse markører.

Efter identifikationen af ​​specifikke celletyper i cokultur, søgte vi at identificere celler, der er i heterotypisk kontakt. Vores tilgang til at gøre dette var at identificere alle celler efter type og placering, og derefter udvikle en metode til parsing celler i grupper af tilstødende og ikke-tilstødende celler med hensyn cellerne der målrette befolkning er i co-dyrkning med. HCS er meget multiparametric, fanger mellem et dusin og mere end 100 funktioner per celle [10], [11], [19]. Grundlæggende funktioner omfatter DNA-indhold, størrelse og form af kernen. Yderligere funktioner er afhængige af de anvendte metoder til at mærke cellerne, og kan indbefatte målinger af cytoskelettet, organeller, eller specifikke proteiner og deres lokalisering og phosphorylering status [20]. Inden for rammerne af den aktuelle undersøgelse, har vi udviklet betingelser til påvisning individuelle celler og deres ekspression af enten CD31 eller CDw75 antigener og deres placering i marken. Den sidste funktion tillader os at bestemme nærhed af to celler til hinanden. Identifikationen af ​​en celle som tilstødende kan nøje defineret af afstanden af ​​kernerne i en cancercelle til en endotelcelle. Som sådan kan celler adskilt ind i tilstødende og ikke-tilstødende, og forskelle mellem kan bestemmes disse to grupper.

Algoritmen er blevet anvendt til at identificere tilgrænsende og ikke-tilgrænsende LNCaP-celler, i forhold til HUVEC-celler, som vist i figur 1. i figur 1A, LNCaP-celler, mærket med et anti-CDw75-antistof i rød, podes med HUVEC’er, farvet med et anti-CD44-antistof i grøn. Intensiteten af ​​CDw75-baserede fluorescens registreres for hver celle i området. Hver celle er nummereret, og intensiteten for hver celle er vist i figur 1B. Fra denne måling kan celler kategoriseres som enten cancer eller endotelceller. Ud over det CDw75-farvning, kan andre egenskaber knyttet til cancerceller anvendes på dette trin, herunder DNA-indhold (mange cancercellelinier, herunder LNCaP er aneuploid og har signifikant højere DNA-indhold end primære celler). Disse data kan være indbefattet med antigenet intensitet at score celler som kræft eller ej, eller i nogle tilfælde kan anvendes som en enkelt parameter for denne bestemmelse (data ikke vist). Når cellerne er blevet identificeret, er deres geografisk information bruges til at kortlægge hver celle til dens placering. Have identificeret hver celle som LNCaP eller HUVEC, hver celle er derefter scorede for de celler, der er i nærheden af ​​det, idet grænsen afstand fastsat af den gennemsnitlige diameter af cellerne. Celler af en type, LNCaP i dette eksempel, er derfor yderligere defineres som støder op til HUVEC eller ej. Celler identificeres som tilstødende, er vist skematisk i figur 1C i gul, eller ikke-tilgrænsende, med rødt. HUVEC-celler er vist som grøn. Fra dette punkt fremad, kan de kvantitative data ekstraheres og analyseres for de to undergrupper af LNCaP-celler. Forskelle mellem disse delmængder er indikative for en reaktion på direkte kontakt med HUVEC-celler.

cokultur ifølge LNCaP-celler og HUVEC’er, er LNCaP-celler mærket med anti-CDw75-antistoffer og vist med rødt, HUVEC’er er mærket med anti-CD44 antistoffer, i grønt. A. Et eksempel billedfeltet. B. Kvantificering af CDw75 fluorescens anvendes til at karakterisere celler som enten LNCaP (høj intensitet, rød) eller HUVEC (lav intensitet, grøn). C. Kortlægning LNCaP-celler og HUVEC’er. Steder kan sammenlignes med celler i panel A. Celler identificeret som tilstødende LNCaP i gul, ikke-tilstødende LNCaP celler i rødt og HUVEC’er grønt.

En stor udfordring at udvikle en nærhed algoritme til HUVEC’er kan ses i figur 1C. Heterogeniteten i både størrelse og form af cellerne gør det vanskeligt at tildele en afstand mellem to celler baseret på placeringen af ​​kernen. Tildele en afstand fra en kerne, der repræsenterer en gennemsnitlig radius for cellelegemet misrepresents samspillet mellem mange celler. Celler, der varierer i størrelse, eller væsentligt aflange, ikke kan behandles i de fleste nuværende billede analyse algoritmer. To praktiske spørgsmål (a) hvilke foranstaltninger der kan iværksættes for at minimere virkningerne af variation i cellestørrelse, og (b) hvor meget fejl kan algoritmen tåle, før en effekt kan ikke observeres? Virkningerne af at ændre den måde, hvorpå cellerne forgyldt blev undersøgt næste, blev den samlede virkning af variabiliteten af ​​cokultur plating forhold på robustheden af ​​tilgangen generelt vurderes i analysen afsnittet senere i denne undersøgelse.

Kandidat gener i endotelceller, der viser ændringer i ekspressionsniveauerne, når de dyrkes med kræftceller

Flere undersøgelser er blevet offentliggjort, der beskriver ændringer i genekspression niveauer i kræft cellelinjer dyrket i cokultur [21] – [25]. Hvert system har identificeret specifikke signalvej begivenheder, både cancerceller og stromaceller, der er udløst af celle-celle-kontakt. Vi søgte at identificere ændringer i cellelinjer, vi bruger i disse undersøgelser som den mest robuste kilde af kandidat proteiner, der skal anvendes til at validere det system, vi har beskrevet. Vi anvendte seeded LNCaP prostatacarcinomceller og HUVEC endotelceller som cokultur system til at udarbejde en liste med kandidatgener for valideringsundersøgelser. Dette blev udført ved hjælp af traditionelle metoder til direkte cokultur, væksten af ​​celler for en bestemt tidsperiode, efterfulgt af en mekanisk adskillelse af de to celletyper. Konkret har vi brugt CD31-konjugeret perler til hurtigt og kvantitativt adskille de endotelceller fra prostatacarcinomceller, efter trypsinisering af den blandede kultur. Evnen af ​​perlerne for at adskille de to celletyper blev karakteriseret ved immunofluorescens og ved RT-PCR. De to prøver af celler blev kontrolleret ved indirekte immunofluorescens ved anvendelse af CD31-antistoffer, og det blev vist, at cellerne adskilt af perlerne var faktisk CD31 positive, hvorimod cellerne ikke er bundet af perlerne var CD31 negative. Disse resultater viste, at fremgangsmåden var i stand til kvantitativt at adskille de to celletyper efter cokultur.

Transkriptionelle forandringer, der sker i LNCaP-celler efter cokultur med HUVEC-celler blev identificeret under anvendelse oligonucleotid-arrays, sammenligne vækst af cellerne i co-dyrkning med HUVEC-celler og efter vækst som en mock cokultur; monokultur celler blev behandlet med vulsten-baserede separation protokol på en måde identisk med den faktiske cokultur prøver. Forud for fuld transskriptionsprofilering af oligonukleotid mikroanalyse, vi kontrolleret adskillelse af celletyper ved RT-PCR af tre gener udtrykt i endotelceller. Dataene er vist i figur 2. Her er resultaterne for tre gener vist for cokultur og mock prøver. De tre gener, PECAM /CD31, KDR /MET og VE Cadherin udtrykkes godt i HUVEC-celler, men dårligt i LNCaP-celler, som vist i monokultur (mock) -forsøg i figur 2. Af data fra de cokultur prøver viser elimineringen af ​​HUVEC celler fra LNCaP-celler i supernatanterne at være i det væsentlige fuldstændig. Derfor har vi kunnet kultur LNCaP-celler med HUVEC-celler, og derefter adskille de celletyper for transskriptionsprofilering analyse.

RT-PCR-analyse af entothelial gener i prøver af mono- og cokultur efter en separation af cellen typer. Celler dyrket som monokulturer, enten endotelceller eller prostataceller, blev behandlet på en måde identisk med den, der anvendes til at adskille celler efter cokultur. Celler inddrevet ved binding til ant-CD31-konjugerede perler og pelleteret. Ekspressionssystemer data for hvert gen /tilstand rapporteres som dets ekspression niveau i forhold til kontrollen genet (β-2-makroglobulin) for hver prøve. Cirkler: pellet; Trekanter: supernatant [afhængigt af Journal, kan de ønsker denne info i en legende; Det oprindelige tal har en legende]

transskriptionsprofilering identificeret 44 gener, der blev opreguleres ved cokultur med HUVEC-celler, og 4 gener, der blev nedreguleret, vist i tabel 1. Fire gener blev identificeret ved to kvalifikatorer hver på oligonucleotid arrays, MOBK1B, SASH1, TGOLN2 og WIPI49; redundante kvalifikationskampe blev fjernet fra listen. Fra kandidatgener på denne liste, vi screenet kommercielle leverandører for antistoffer, der specifikt vil identificere mål ved Western blotting og indirekte immunofluorescens. I mange tilfælde, kommercielle antistoffer ikke var tilstrækkeligt specifikke, som bestemt af både Western blotting og HCS. Generelt antistofferne enten gav en signifikant krydsreagerende bånd i Western-blots eller viste ikke en titrerbar farvning i et cellulært mønster forventes for antigenet. Dette var tilfældet for TNFRSF19, som havde den mest dramatiske ændring i mRNA-ekspressionsniveauer. Men i tilfælde af WWOX, identificeret som nedreguleres ved celle-celle-kontakt i LNCaP-celler, var vi i stand til at identificere og validere passende reagenser. WWOX er blevet godt karakteriseret som en tumor suppressor, efter undersøgelser, sit udtryk ofte er gået tabt som følge af translokationer inden den skrøbelige sted FRA16D [26], [27], herunder prostatakræft [28]. Selvom ekspression er tabt i mange cancere, kan dets ekspression ofte observeres i mange cancercellelinier [29]. WWOX er phosphoryleret i Thr-33 resten i respons på behandling med TNF-α og hyaluranidase [30]. Phosphoryleret WWOX vil derefter aktivere p53, men denne induktion af apoptose undertrykkes af JNK1, dels gennem en direkte sammenhæng med WWOX [31]. Som sådan ville reduceret WWOX udtryk også dæmpe apoptose som følge af eksponering til udenlandske miljøer, såsom pre-metastatiske steder forud for etableringen af ​​nye tumorvækst. Identifikationen af ​​væsentligt reduceret ekspression af WWOX i LNCaP celler ved kontakt med HUVEC’er præsenterer en biologisk relevant proces, der kunne analyseres i det system, vi beskriver.

Påvisning af ændringer i signaltransduktionsveje i prostata karcinom celler på grund af kontakt celle-celle

for at teste responset af WWOX niveauer for at cokultur, den metode, der skulle ændres. Specifikt er fremgangsmåden er i øjeblikket ikke robust i fire kanaler, som følge af spektral overlapning i det blå til orange vifte af spektrene og nogle svaghed i intensiteten i det røde område. Som sådan, at mærkning af et antigen behov udelades at omfatte WWOX. Vi forsøgte udelade CD31 antigenet og teste, om CDw75 farvning var tilstrækkelig til at skelne mellem LNCaP celler og HUVEC’er. Monokulturer og cokulturer blev evalueret for at bestemme fordelingen af ​​CDw75 farvning niveauer i hver celletype og til at bestemme det punkt, hvor HUVEC’er begyndte at blive kaldt som LNCaPs. Rækken af ​​niveauer for de to celletyper svarede til, hvad der blev observeret i den indledende fase af undersøgelsen (figur 1), hvor LNCaP-celler viste en bred vifte af farvning, men kun nogle få celler pr blev farvet let nok, at de kunne klassificeres som HUVEC’er, og derfor er denne metode til at adskille to celletyper syntes robust nok til at tillade farvning af WWOX eller phospho-WWOX så godt. Identifikationen af ​​celletyper og kvantificering af WWOX niveauer er vist i figur 3. associering af signalsystemet intensiteter med den korrekte celletype blev forbedret i forhold til indledende undersøgelser (beskrevet ovenfor) ved at begrænse antallet af udpladede celler, især til HUVEC’er.

LNCaP-celler og HUVEC’er i cokultur blev mærket under anvendelse af (panel A) DAPI, at identificere kerner, (panel B) anti-CDw75-antistoffer, at identificere LNCaP-celler, og (panel C) anti-WWOX antistoffer. I panel D celler klassificeret som HUVEC vist som røde firkanter, der støder op LNCaP celler som gule pladser og ikke-tilstødende LNCaP celler som blå firkanter.

For at teste billedet tilgang vi har udviklet, vi undersøgt, om ændringerne i WWOX udtryk vi identificeret i de transkriptionelle profilering undersøgelser kunne sammenfattet i LNCaP celler i det system, vi har beskrevet ovenfor. WWOX proteinniveauer i LNCaP-celler i tilstødende og ikke-tilstødende celler blev sammenlignet. Multiple brønde blev anvendt til kultur LNCaP-celler og HUVEC’er og blev efterfølgende fikseret og farvet med DAPI og antistoffer mod CDw75 og enten WWOX eller phospho-WWOX. LNCaP-celler blev bestemt til at være enten tilstødende eller ikke-tilstødende til HUVEC’er og analyseret for target protein niveauer. Gennemsnitlige target protein niveauer og standardafvigelser blev bestemt. Ud fra disse data blev forholdet og p-værdi på target protein niveauer i tilstødende og ikke-tilstødende LNCaP-celler beregnet. Data fra disse sammenligninger er vist i figur 4. Dataene viser, at hosliggende LNCaP-celler ofte har reducerede niveauer af både WWOX og phospho-WWOX og som forskellen bliver større, jo større betydning for målingen. Omvendt brønde ikke udviser en forskel var ikke så statistisk robust. Dette synes at vise, at det ikke altid er muligt at træffe en afgørelse om, hvorvidt direkte kontakt har haft en effekt, men når vi kan træffe en afgørelse, viser resultaterne, at disse antigener er lavere i de LNCaP celler, kontakt HUVEC. Brønde, der undlader at vise en effekt er blevet sammenlignet med dem, der gør, og vi konstatere, at brønde, der undlader at vise en forskel gør det som følge af for få LNCaP celler bliver scoret som tilstødende, typisk gennem en ujævn fordeling af celler under plating .

uafhængige bestemmelser, over flere brønde, af forholdet mellem WWOX (sorte firkanter) og phospho-WWOX (røde firkanter) niveauer i LNCaP-celler, som er tilstødende eller ikke- tilstødende til HUVEC’er er vist. Hvert punkt repræsenterer en individuel brønd, hvor ~350 tilstødende og ~1500 usammenhængende LNCaP-celler blev vurderet.

En separat observation er, at selv om forskellene i mange brønde er statistisk signifikante (idet p-værdier under 1 × 10

-3), størrelsen af ​​effekten dog beskedent. På dette stadium betragtede vi en anden numerisk test af forskellen mellem target-proteinniveauer i LNCaP populationer. Testen brugte vi var den Kolmogorov-Smirnov (eller KS) statistik. Testen sammenligner to befolkninger som fraktioneret bidrag til den samlede mængde antigen. Resultater for WWOX niveauer er vist i figur 5A og for phosphoryleret WWOX, som medieres af Src, som vist i figur 5B. Forskellen i de to kurver viser, at LNCaP-celler tilstødende til HUVEC’er har mindre WWOX protein end LNCaP-celler, som er ikke-tilstødende til HUVEC’er sammenlignet i en prioriteret liste.

Mængden af ​​WWOX protein (i panel A) og phospho-WWOX protein (i panel B), er vist for LNCaP-celler tilstødende til HUVEC’er (i rødt) og de celler ikke-tilgrænsende til HUVEC’er (i sort). Datapunkter repræsenterer (phospho-) proteinniveauer per celle som de bidrager til den totale antigen intensitet for hele marken.

Phosphorylering af WWOX af Src resultater i binding til JNK1, p53 og p73 [31 ] – [33], og disse foreninger er blevet associeret med reduceret apoptose. Reduktion apoptose er et vigtigt skridt i tumorigenese [2], og ville forventes for kræftceller støder ikke-indfødte celletyper under invasion og metastase, og i virkeligheden det er direkte knyttet til JNK1 funktion [34]. Da WWOX og pWWOX niveauer reduceres i tilstødende LNCaP celler, besluttede vi at undersøge niveauet af c-Jun, JNK1 og p73 så godt. Resultater for disse proteiner er vist i tabel 2. De tre proteiner viser forskelligt omfang af følsomhed af nærheden af ​​HUVEC’er. c-Jun og JNK1 udviser kun beskedne virkninger som vist af de fleste tests viser høje p-værdier og nøgletal nær 1. p73 viser en stærkere virkning, der kan sammenlignes med, hvad der blev observeret for WWOX og phospho-WWOX i de tidligere analyser.