PLoS ONE: RhoC regulerer Cancer Stamceller i hoved og hals pladecellecarcinom ved overekspression IL-6 og Phosphorylering af STAT3

Abstrakt

I dette studie undersøgte vi sammenhængen mellem RhoC udtryk og cancer stamceller (CSCS ) dannelse i hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC). Inhiberingen af ​​RhoC funktion blev opnået under anvendelse shRNA. Ekspressionen af ​​stamceller celleoverflademarkører, ALDH og CD44 var signifikant lav i to RhoC forarmet HNSCC celle carcinom-cellelinier. Desuden blev en slående reduktion tumorsphere dannelse opnået i RhoC Knockdown linjer. MRNA ekspression af RhoC i RhoC knockdown vedhængende og tumorspheres dramatisk nedreguleret i sammenligning med scrambled kontrol. MRNA ekspression af stamcelle transkriptionsfaktorer; Nanog, oct3 /4 (Pouf1), og Sox2 signifikant udtømt i RhoC Knockdown kloner. Endvidere phosphorylering af STAT3

ser727, og STAT3

tyr705 var signifikant nedreguleret i RhoC knockdown kloner. Overekspressionen af ​​STAT3 i RhoC knockdown viste ikke nogen ændring i ekspressionsmønstre for enten-STAT3

tyr705 eller stamcelletransplantation transkriptionsfaktorer, der betyder rolle RhoC i STAT3-aktivering og dermed ekspressionen af ​​Nanog, oct3 /4 og Sox2 i HNSCC. Ekspressionen af ​​Inter leukin-6 (IL-6) i RhoC knockdown HNSCC cellelinjer var dramatisk lav i forhold til den krypterede kontrol. Endvidere har vi vist en redning i STAT3 fosforylering af IL-6-stimulering i RhoC Knockdown linjer. Denne undersøgelse er den første af sin art til at etablere inddragelse af RhoC i STAT3 phosphorylering og dermed at fremme aktiveringen af ​​kernen cancer stamceller (CSCS) transkriptionsfaktorer. Disse resultater tyder på, at RhoC kan være en roman mål for HNSCC terapi

Citation:. Islam M, Sharma S, Teknos TN (2014) RhoC regulerer Cancer Stamceller i hoved og hals pladecellecarcinom ved overekspression IL-6 og Phosphorylering af STAT3. PLoS ONE 9 (2): e88527. doi: 10,1371 /journal.pone.0088527

Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA

Modtaget: 14 oktober, 2013; Accepteret: 7 jan 2014; Udgivet: 12 februar 2014

Copyright: © 2014 Islam et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Ohio State University Comprehensive Cancer center og Slomin Family Foundation (Florida, USA) til Ted Teknos. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) er blandt de ti fatale kræft på verdensplan [1], [2]. Som rapporteret af American Cancer Society, cirka 41.380 nye tilfælde vil blive diagnosticeret i år 2013, hvoraf omkring 19% af patienterne kan forventes at dø på grund af sygdom i samme år [3]. De overlevende står sekundære manifestationer af sygdommen resulterer i en langvarig og omfattende behandling. Dette forværres af den kendsgerning, at sygdommen viser en høj frekvens af gentagelse. Som et resultat, HNSCC patienter står over for en lang kamp mod sygdommen forårsager stor økonomisk og følelsesmæssig belastning [4]. Derfor er en rapport fra Brown

et al Hotel (2002) citerer HNSCC blandt de otte dyreste kræftformer i Medicare-programmet [5].

Den usædvanligt høje sygelighed og dødelighed skyldes ondartet natur HNSCC og dens udbredte forekomst i de fleste hoved og hals kræft. Derfor er det ikke ualmindeligt at finde metastase til lymfeknuder i halsregionen fører til lokalregional svigt (hyppigste) efterfulgt af pulmonal og knoglemetastaser [6], [7]. Som et resultat, patienter med HNSCC viser dårlig prognose og en fem års overlevelse på kun 50-60% [3]. Således er der et stort behov for at forstå de genetiske mekanismer, der regulerer den malignitet af HNSCC og bruge dem til at designe bedre behandlingsstrategier, der kan forhindre metastase og gentagelse.

RhoC er medlem af den velkarakteriserede Rho familie af GTPaser, der er involveret i en lang række af cellulære aktiviteter, herunder intracellulær signalering, cytoskeletorganisation, celledeling og reguleringen af ​​genekspression [8]. Interessant, Rho gener tilhører Ras superfamilien, hvoraf mange er blevet identificeret som onkogener [9], [10]. Selvom meget få genetiske mutationer observeres i RhoC genet, er det rapporteret at være overudtrykt i mange former for invasive karcinomer herunder HNSCC [11], [12]. Konkret studier i alle typer af kræft, hvor RhoC ekspression blev analyseret afslørede en meget stærk sammenhæng mellem stærkt forøget udtryk og metastase. Desuden, når RhoC funktion inhiberes

in vitro

, resulterer det i en kraftig reduktion af celleinvasion og motilitet [13]. Interessant,

in vivo

undersøgelser af tumorigenese i RhoC knockout-mus viser tumorer med en stærkt reduceret evne til at metastaserer til lungerne [10]. Tilsammen disse undersøgelser tyder stærkt RhoC er en pro-metastase onkogen, der spiller en væsentlig rolle i at omdanne ikke-invasive tumorceller i en invasiv fænotype.

Studiet af RhoC funktion primært fokuserer på sin rolle i omlægningen af cytoskelettet ved at inducere dannelsen af ​​stress fibre og fokal vedhæftning, som er kritiske skridt mod at ændre celler i bevægelige og invasive former [14]. Men processen med metastase af cancerceller er en kompleks og flertrinsproces som er ledsaget med den øgede ekspression af gener der forøger motilitet og invasionsevne og en selektiv nedregulering af gener, der inhiberer denne proces. Forekomsten af ​​RhoC i en bred vifte af invasive karcinomer og dens funktion som en signalering GTPase foreslår det kan regulere andre veje, som er involveret i omdannelsen af ​​tumorceller i et metastatisk fænotype.

Kræft stamceller (CSCS) er en subpopulation af udifferentierede tumorceller i en tumormasse som er i stand selvfornyelse. De udviser også stor modstandsdygtighed mod kemo-strålebehandling. Desuden kan CSCS fortsætte i tumorer som en diskret sub-population, som kan tilbagefald og metastaserer ved at danne nye tumorer [15], [16]. Disse unikke egenskaber spiller en væsentlig rolle i cancer celleoverlevelse fører til tilbagefald. Vigtigt er det, kan de også være en kilde til celler med en invasiv fænotype, spiller således en central rolle i metastaser.

Der er gennemført en anselig række undersøgelser af tilstedeværelse og rolle CSCS i hoved- og halscancer, som er blevet gennemgået grundigt af Minnelli og Gallo (2012) [17]. En undersøgelse af primære tumorer i hoved og hals kræft ved hjælp af markører CD44 og ALDH identificeret en delmængde af tumorceller, som unikke CSCS egenskaber, herunder selvfornyelse, evne til at danne nye tumorer hos mus og udviste høj metastatisk potentiale (Prince

et al

2007 Davis

et al

2010, Clay

et al

2010) [16], [18], [19]. Interessant, ALDH-positive tumorceller udviste mere tumorigent potentiale sammenlignet med CD44-positive celler [19]. Desuden Chen

et al Hotel (2010) [20] rapporterede primære tumorer med en højere udtryk for CD44 og ALDH, hvilke attributter godt med dårlig prognose i HNSCC patienter. Baseret på disse undersøgelser, kan det konkluderes, at CSCS kan spille en væsentlig rolle i metastaser af HNSCC; hvilket tyder et behov for at forstå de molekylære mekanismer, der regulerer dem.

CSCS er også identificeret og karakteriseret i HNSCC cellelinjer, hvor de har vist sig at spille en vigtig rolle i epitel-mesenkymale overgang (EMT) [ ,,,0],21]. I vores undersøgelse har vi analyseret effekten af ​​RhoC hæmning på funktionelle egenskaber kræftceller, der udviser CSC-lignende funktioner i HNSCC cellelinjer. Vi viser, at hæmme RhoC aktivitet i HNSCC cellelinjer resulterer i en betydelig reduktion i cellen befolkning udtrykker CD44 og ALDH, markører for CSCS i hoved og hals tumorer.

Desuden har vi også præget den molekylære mekanisme, hvormed RhoC regulerer vækst og selv-fornyelse af CSCS. Vores resultater viser, at RhoC signifikant kan sænke ekspressionsniveauerne af kernen stamceller transkriptionsfaktorer, Nanog, Sox2 og oct3 /4. Vi viser desuden, at dette opnås ved at reducere niveauerne af phosphoryleret STAT3 via IL-6 /JAK signalvej. Denne undersøgelse er den første af sin slags, der forsøger at dissekere rolle RhoC GTPase signalvejen i reguleringen og aktivering af stamceller celle transkriptionsfaktorer. (Disse faktorer fremme og opretholde tumorceller med stamceller celle-lignende egenskaber i hoved og hals kræft).

Derfor baseret på vores resultater vi konkludere, at RhoC er en vigtig onkogen, der er nødvendig for vedligeholdelse og udbredelse af CSCS i HNSCC.

Materialer og Metoder

Cell kultur

hoved og hals pladecellekræft cellelinjer UM-SCC-1 og -47 (University of Michigan pladecellecarcinom ) blev indkøbt fra University of Michigan. Disse er velkarakteriserede linier afledt fra patienter med T2N0 af gulvet i munden og T3N1 af tungens basis henholdsvis [22], [23]. Cellelinjer blev dyrket som tidligere beskrevet [13].

lentivirus transduktion, infektion og udvælgelse af positive RhoC knockdown kloner

For at få stabile RhoC knockdown kloner fra de førnævnte anvendte cellelinjer vi RhoC knockdown og forvrænget sekvens kontrol konstruktioner med GFP tagged og puromycin resistens sites som beskrevet i vor tidligere offentliggjorte arbejde [13]. Udvælgelse af RhoC knockdown stabile kloner blev opnået under anvendelse af 2,0 og 1,6 ug /ml puromycin til UM-SCC-1 og -47 hhv. Disse kloner blev yderligere sorteret ved flowcytometri for at få det maksimale antal af GFP-positive celler, som også blev anvendt i efterfølgende studier.

Transient transfektion af RhoC-siRNA

Fordi emissionsspektret af GFP opmærket med RhoC shRNA var den samme som emissionsspektret af fluorescensen antistof anvendes til at identificere ALDH positive celler, kan de transficerede RhoC-shRNA /GFP knockdown kloner dannet fra UM-SCC-1 og -47 cellelinier ikke anvendes til at identificere og sortere CSC delpopulation. I stedet knockdown af RhoC blev opnået forbigående i både UM-SCC-1 og -47 hjælp RhoC-siRNA (Ambion /Life technologies, USA) og lipofactAMIN 2000 som transportøren. Vellykket transfektion og hæmning af RhoC blev påvist ved den manglende sit udtryk med Western blot analyse ved hjælp af anti RhoC antistof.

Kvantitative reverse transkriptase polymerasekædereaktioner (QRT-PCR)

Total RNA blev isoleret af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kvantitative reverse transkriptase polymerasekædereaktioner (QRT-PCR) blev udført af Taqman sonde systemet fra Applied Bio Systems (Foster City, Californien) ved hjælp af følgende produkter RhoC: Hs00733980_m1, Sox2: Hs01053049_s1, Nanog: Hs02387400_g1 og Oct3 /4 (POUF1 ) Hs01895061_u1. OZ1 og G3PDH blev brugt som data normalizers. Relative ændringer i gen-udtryk blev beregnet ved anvendelse af 2

– (- Δ). Metode C

T [24]

Western blot-analyse

Western blot analyser blev udført i overensstemmelse med standardprotokollen. De primære anvendte antistoffer var polyklonale RhoC, og p-STAT3

ser 727, p-STAT3

tyr705 (1:1000 fortyndinger) og αβ tubulin (som en belastning kontrol) (1:2000 fortyndinger). Disse antistoffer var produktet fra Cell Signaling (cellesignalering Technologies, Inc., Boston, USA). Efter inkubation med primære antistoffer blev membranerne blottet i en time med sekundære HRP-konjugat-anti-kanin-antistof (1:2500) (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA). ECL-super signalsystem (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) blev anvendt til protein visualisering.

Bestemmelse af aktiv RhoC eller [RhoC-GTP]

[RhoC- GTP] i UM -Scc-1 og -47 scrambled kontrol og RhoC knockdown kloner blev bestemt ved G-LISA som tidligere beskrevet [25], under anvendelse af G-LISA kit (Cytoskeleton Inc., Denver, CO, USA) og ifølge fabrikantens protokol under anvendelse RhoC primært antistof fra Cell Signaling Inc.

enzymmaerket (ELISA)

Serum gratis supernatanter fra scrambled kontrol og RhoC knockdown cellelinier opnået efter 48 timers inkubation blev sendt til ELISA til cytokinet Core Lab University of Maryland, Baltimore, MD. Gennemsnitlige værdier af IL-6 (efter normalisering med antallet af celler, hvorfra supernatanterne blev opsamlet) i form af pg /ml blev afbildet i et søjlediagram.

Flowcytometri analyser

Flow cytometri analyse for sortering af GFP, blev ALDH og CD44 positive celler udført under anvendelse af BD FACS Aria IIU flowcytometer udstyret med en 488 nm, 15 mW, luftkølet Argon laser. En ALDEFLOUR kit (Stamceller Technologies, Vancouver, BC, Canada) blev anvendt til ALDH farvning. FACS-analyse blev udført ved flow lab core facilitet på The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

Tumorspheres dannelse

For tumorsphere dannelse analyser vi sorteret ud GFP-positive celler og brugte dem til alle efterfølgende eksperimenter . Tumorspheres fra scrambled kontrol og RhoC Knockdown linjer blev opnået ved dyrkning af et tilsvarende antal celler (1 x 10

6) på ultralav fastgørelsesplader i keratinocyt serumfrit medie supplement med EGF 20 ng /ml, bFGF 20 ng /ml , insulin 100 ng /ml, og hydrocortison 400 ng /ml. Til formering i områder til den næste generation, blev kugler frafiltreret på en 40 uM cellefilter og kortvarigt trypsineret i et vandbad ved 37 ° C. Efter centrifugering ved 300 × g celle paller blev re-suspenderet i tumorsphere medier og udplades på friske lave vedhæftede plader. For at bestemme effektiviteten af ​​tumorsphere dannelse, blev 500 celler fra den scramblede kontrol og RhoC knockdown udpladet i 96 brønd lave montagepladerne. Antallet af kugler blev talt efter to ugers podning. I ultralav fastgørelsesplader var produktet af Corning Incorporated, Corning, NY, USA.

Statistical Analysis

Statistiske analyser (t-test) blev udført under anvendelse Sigma graf pad prisme 4 software . Den gennemsnitlige blev rapporteret med Standardafvigelse (± SD). Forskelle blev anset for at være statistisk signifikant, når

s

værdier var mindre end 0,05.

Resultater

RhoC udtryk er reduceret betydeligt i RhoC knockdown HNSCC cellelinjer

inhiberingen af ​​RhoC ekspression blev udført under anvendelse lille hårnåle-RNA (shRNA), og den lentivirale transduktion og infektion metode som beskrevet i metodeafsnittet. Efter lentiviral infektion blev RhoC knockdown kloner selekteret ved anvendelse puromycin (1,6 ug /ml) antibiotikum. Antallet af celler, som var inficeret med succes blev analyseret ved flowcytometri. Dette afslørede et bemærkelsesværdigt lavt antal ikke-inficerede celler (Fig. 1A-C top panel). Desuden fluorescensmikroskopi af de stabile kloner viser en stærk grøn fluorescens i hovedparten af ​​cellerne, der betyder en høj effektivitet af lentivirus transduktion og infektion (fig. 1A-C bundpanel). Disse GFP-positive celler blev yderligere sorteret og re-dyrket i efterfølgende eksperimenter. Figur 1C er den negative kontrol viser den parentale linje uden lentivirus-infektion. Dette repræsenterer forskellen mellem GFP udtrykkende (inficeret) og ikke-GFP-udtrykkende celler.

lentivirus inficerede celler viser GFP-ekspression i UM-SCC-47. (A) Histogrammer af det krypterede kontrol (sr kontrol) og (B) RhoC knockdown (RhoC kd) opnået ved flowcytometri. (C) Negativ kontrol. Repræsentation af GFP-ekspression i fluorescens og klart lys er vist i bundpanelerne. Ca. 90% af cellerne var GFP positive tilkendegiver vellykket transduktion af shRNA anvendelse af rekombinant lentivirus.

Vi derefter testet effektiviteten af ​​shRNA i depletterende RhoC mRNA-ekspression af real time kvantitativ PCR (QRT-PCR) i vores udvalgte cellelinjer. Som vist i figur 2 mRNA ekspressionsniveauer af det RhoC genet i knockdown kloner var særlig lavt (Fig 2A . D), mens proteinekspression ikke var påviselig i Western blot (Fig 2B . E). I modsætning hertil var tilstrækkeligt RhoC udtryk observeret i kloner med shRNA-scrambled sekvens kontrol. Den relative RhoC mRNA-ekspression i shRNA-scrambled kontrol og de RhoC knockdown kloner blev evalueret ved kvantitativ RT-PCR og C

T opnåede værdier blev normaliseret under anvendelse af to housekeeping-gener som beskrevet i materialer og fremgangsmåder afsnittet. Et fald på omkring 80% af RhoC mRNA-ekspression blev observeret i UM-SCC-1 og- 47 Knockdown kloner sammenlignet med scrambled kontrol (Fig 2A . D). I vores tidligere undersøgelse, bekræftede vi, at kun RhoC mRNA-ekspression blev inhiberet når vi bruges RhoC shRNA konstruktioner fremstillet med specifikke sekvenser af RhoC mRNA; Endvidere blev ekspressionsniveauerne af andre Rho-proteiner ikke påvirket i UM-SCC cellelinier [13]. Brugte vi således den samme RhoC shRNA konstruktioner til vores aktuelle undersøgelse

(A og D) mRNA ekspressionen af ​​RhoC opnået ved real time RT-PCR.; (B og E). Western blot-analyse, der viser RhoC ekspression i den krypterede kontrol og RhoC knockdown kloner (C og F). Søjlediagram, som viser ekspressionen af ​​aktiv RhoC [RhoC-GTP] i scrambled kontrol og RhoC knockdown UM-SCC-1 og-47 hhv. Et signifikant fald i RhoC mRNA, protein og [RhoC-GTP] niveauer blev opnået i RhoC knockdown cellelinjer.

Næste, vi analyserede RhoC proteinekspression ved hjælp af Western blot og observerede en dramatisk udtynding af den RhoC protein i RhoC knockdown kloner (fig 2B . E). Endvidere blev ekspressionen af ​​aktiv RhoC [RhoC-GTP] blev bestemt ved G-LISA og en tilsvarende lav ekspression af aktiv RhoC påvist i RhoC knockdown kloner af UM-SCC-1 og-47 (Fig 2C . F). Disse undersøgelser givet klare indsigt om “slukke” for RhoC signalering aktivitet ved at reducere de samlede niveauer af RhoC mRNA-ekspression. Yderligere detaljerede undersøgelser af dets funktionelle roller i kræft metastase kunne forfølges i fremtidig forskning. Et af de mest basale kliniske spørgsmål, som vi behandles på dette punkt er, hvordan banker ned af RhoC funktion påvirker tumorceller med stamceller celle-lignende egenskaber i hoved- og halscancer. For at løse dette spørgsmål, undersøgte vi flere biologiske funktioner i CSCS som omfatter stamcelle biomarkør analyse og evnen til at danne tumorspheres. Dernæst undersøgte vi de signalmolekyler, der opretholder de selv-fornyelse egenskaber CSCS.

Hæmning af RhoC udtryk medfører reduceret befolkning ALDH og CD44 positive celler i HNSCC cellelinjer

For at identificere CSC befolkning i UM-SCC cellelinier, brugte vi stamcelle markører CD44 og ALDH sammen med fluorescens-aktivator celle (FACS) for at adskille og tælle antallet af celler, der udtrykker dem. Desuden er det vigtigt at bemærke, at RhoC-siRNA kloner af UM-SCC-1 og -47 blev anvendt til FACS-analyse for at bestemme ALDH positive cellepopulationer stedet for lentivirus inficeret GFP-RhoC-shRNA kloner. Dette var for at undgå overlejring af GFP fluorescens over det fluorescensmærkede ALDH antistof, da deres emissionsspektre overlap.

Vi sammenlignede antallet af ALDH positive celler i den krypterede kontrol- og tilsvarende RhoC Knockdown linjer. I kontrol cellelinjer, vi observeret 18% og 10% ALDH positive celler i den samlede befolkning i UM-SCC-1 og UM-SCC-47 hhv. I modsætning hertil påvistes kun 13% (UM-SCC-1) og 4% (UM-SCC-47) ALDH positive celler i de tilsvarende RhoC Knockdown linjer (fig. 3A). Et lignende mønster blev observeret ved anvendelse af CD44, men procentdelen af ​​CD44 positive celler var meget høj. Interessant kloner med den krypterede sekvensstyring af UM-SCC-1 og -47 viste omkring 98% CD44-positive celler. I de tilsvarende RhoC knockdown kloner, der var 60% og 41% CD44-positive celler (figur S1). Det er værd at bemærke, at dette var et unormalt højt antal CD44 positive celler i begge UM-SCC-1 og-47 cellelinjer ( 95%), og derfor CD44 ikke kunne anvendes som en stamcelle markør for disse cellelinier. Derudover vores resultater ligner tidligere rapporterede studier, som fandt CD44 skal rigeligt udtrykt i tumorceller af HNSCC [26].

FACS-analyse, der viser ekspressionen af ​​(A) ALDH i scrambled kontrol og RhoC knockdown kloner. (B) Den tumorspheres dannelse i scrambled kontrol og RhoC knockdown UM-SCC-1 og -47cell linjer. (C) Repræsentationen af ​​tumorspheres dannelse effektivitet i scrambled kontrol og RhoC knockdown UM-SCC-1 opnået i 96 brønds plader. Et signifikant fald i ALDH ekspression blev set. Tumorsphere formation var dramatisk lav i RhoC knockdown UM-SCC-1 og -47 hhv. (D) Et signifikant fald i RhoC mRNA-ekspression blev opnået på RhoC knockdown adhærerende celle og i tumorspheres. (E) Stamcelle transkriptionsfaktorer, Sox2, oct3 /4, og Nanog viser signifikant nedregulering i deres mRNA som afsløret af real time RT-PCR i scrambled kontrol og RhoC Knockdown sfærer opnået fra UM-SCC-1.

RhoC knockdown HNSCC linjer er stærkt reduceret i deres evne til at danne tumorspheres

Tumor celler med stamcelle-lignende egenskaber er i stand til at danne flydende kugler, når de dyrkes under ikke klæbende serum frie medier. For yderligere at etablere rolle RhoC i CSC vækst og vedligeholdelse, vi undersøgte tumorsphere dannelse kapaciteter i disse cellelinier. Første, et lige stort antal celler (1 x 10

6) fra scrambled kontrol og RhoC Knockdown cellelinier blev podet på ultralave fastgørelsesplader til observation. Vi valgte fem forskellige felter for at visualisere det antal tumorspheres der havde dannet. I scrambled kontrol, der var et stort antal tumorspheres med et færre antal celleaggregater. I modsætning hertil blev et klart fald i tumorsphere dannelse detekteres i RhoC knockdown kloner dannet fra både UM-SCC-1 og-47-cellelinjer. Desuden skal det bemærkes, at veldefinerede grænser, et karakteristisk træk ved tumorspheres, er kun til stede i sådanne afledt af de krypterede kontrolceller men tydeligvis fraværende, når afledt af RhoC knockdown celler (fig. 3B). I stedet hvad der ses er små celleklynger eller aggregater, der er blottet for enhver veldefineret ydre grænse. Desuden har disse celle klynger ikke udbrede eller danner kugler efter de blev trypsiniseret og re-belagt. I modsætning hertil blev der sfærer nemt genereret fra kontrol- cellelinier (scrambled sekvens), selv efter re-plating dem op til den femte generation. Vi analyserede også tumorsphere dannelse effektivitet i en plade med 96 brønde under anvendelse af 500 celler per brønd og pladen observeres for sfærer efter to uger. En bemærkelsesværdig nedgang i antallet af kugler (85%) blev observeret for RhoC knockdown celler sammenlignet med kontrolcellerne (fig. 3C). I lighed med den foregående tumorsphere assayet blev celleaggregater observeret fra celler afledt fra RhoC Knockdown cellelinier, som var ganske ulig de veldefinerede sfærer afledt fra kontrol kloner. Vi opnåede en lignende mønster af tumorsphere dannelse effektivitet, når den UM-SCC-47 scrambled kontrol og dens tilsvarende RhoC Knockdown linjer blev testet (data ikke vist). Disse data antyder, at RhoC er vigtigt for vækst og opretholdelse af cancerceller med stamcellelignende funktioner i hoved og halscancer.

Analyse af RhoC og stamcelletransplantation transkriptionsfaktorer ekspression i vedhængende og tumorspheres i HNSCC

Differential ekspressionen af ​​RhoC mRNA i adhærente celler og tumorspheres

: Dernæst analyserede vi RhoC mRNA ekspression i tumorspheres genereret fra UM-SCC-1 cellelinje og sammenlignet det med deres tilsvarende klæbende celler ved hjælp af real time RT-PCR. Det skal bemærkes, at de adhærente celler anvendt til forsøgene henvises til krypterede kontrol eller RhoC knockdown monolag celler, der er dyrket i standard cellekultur substrat. Vores resultat viser, at der er en forhøjet ekspression af RhoC mRNA i UM-SCC-1 scrambled kontrol sammenlignet med de RhoC knockdown modstykker (fig. 3D). Interessant nok RhoC ekspression er meget højere i de krypterede kontrol tumorspheres sammenlignet med deres adhærente celle modstykker. Dette kan skyldes tilstedeværelsen af ​​en højere koncentration af RhoC i tumorspheres hvor højere antal CSCS er lokaliseret i sammenligning med kontrollen adhærerende cellepopulation, der udviser en blanding af celler med både stamceller og ikke-stamcelle lignende funktioner. Dette understøtter yderligere vores hypotese, at RhoC kræves til vedligeholdelse af CSC lignende funktioner. Vores resultater er i overensstemmelse med en tilsvarende undersøgelse på RhoC udtryk i brystkræft cellelinier, hvor ALDH positive celler udviste en højere RhoC udtryk sammenlignet med ikke-ALDH udtrykkende celler [27].

stamcelle transkriptionsfaktorer er nede reguleret i RhoC knockdown tumorspheres.

væksten og selvfornyelse af stamceller, herunder formering afhænger af korrekt udtryk af kernen stamceller transskription faktorer Nanog, oct3 /4 og Sox2. Derfor analyserede vi ekspressionsniveauerne af disse stamceller transskriptioner faktorer i RhoC knockdown og scrambled kontrol tumorspheres genereret fra UM-SCC-1 cellelinie ved real-time RT-PCR. Interessant nok blev ekspressionsniveauerne af alle tre kerne transkriptionsfaktorer dramatisk reduceret i RhoC Knockdown celler sammenlignet med scrambled kontrol tumorspheres (fig. 3e). Sox2 blev stærkest til udtryk i de scrambled kontrol tumorspheres, mens Nanog og oct3 /4 var begge mindre stærkt udtryk, men havde lignende ekspressionsniveauerne. Men i RhoC knockdown modparter, Sox2 og Nanog viste de største reducerede niveauer efterfulgt af oct3 /4. Desuden har vi også set på deres ekspressionsniveauer i de adhærente HNSCC cellelinjer (krypteret kontrol og RhoC knockdown), hvorfra de tumorspheres blev afledt. I UM-SCC-1 scrambled kontrol- og RhoC knockdown cellelinjer, de tre transkriptionsfaktorer viste lignende niveauer af ekspression som observeret i de tumorspheres der blev afledt af dem (Fig. 4A). I UM-SCC-47 scrambled kontrol, oct3 /4 havde det højeste udtryk efterfulgt af Sox2 og Nanog. Svarende til UM-SCC-1 RhoC knockdown linje viste Nanog den største reduktion, når den RhoC ekspression blev inhiberet efterfulgt af Sox2 (fig. 4B). I begge UM-SCC-1 og -47 RhoC Knockdown linjer, oct3 /4 viste den mindste mængde af reduceret ekspression. Alt i alt, vores resultater viser, at RhoC medierer formering og selv-fornyelse af CSCS ved at regulere ekspressionsniveauet af de centrale stamceller transkriptionsfaktorer.

Real time RT-PCR viser mRNA udtryk for Sox2, oct3 /4 og Nanog i adhærente celler af UM-SCC-1 (A) og-UM-SCC-47 (B). Et signifikant fald i mRNA-ekspression blev observeret i stamcelle-transkriptionelle faktorer i RhoC knockdown HNSCC cellelinjer.

Hæmning af RhoC udtryk inducerer nedregulering af STAT3 signalvejen

Dernæst undersøgte vi den mulige mekanisme, ved hvilken RhoC regulerer ekspressionen af ​​de centrale stamcelletransplanterede transkriptionsfaktorer. Aktiveringen af ​​stamceller transkriptionsfaktorer, Nanog, Sox2 og oct3 /4 medieret gennem Signal transducere og aktivatorer af Transcription3 (STAT3) signalvej er veletableret [28], [29]. Imidlertid vides ikke at inddrage RhoC i aktiveringen af ​​disse transkriptionsfaktorer. Derfor analyserede vi ekspressionen af ​​total og phosphoryleret STAT3 (p-STAT3) i krypteret kontrol og RhoC knockdown HNSCC cellelinier. Overraskende, vi observeret, at mens de samlede niveauer af STAT3 næsten var de samme i den scramblede kontrol og RhoC knockdown cellelinier, p-STAT3-niveauer blev stærkt reduceret kun i RhoC knockdown kloner. Specifikt Western blot-analyse afslørede reduceret phosphorylering af STAT3-protein ved Ser-727 og Tyr-705 rester (fig. 5A og B). Det er interessant at bemærke er behov for phosphorylering på dennes rest for STAT3 at diffundere ind i kernen for at binde til promotorelementer af STAT3 responsive gener [30], [31]. Disse resultater støtter stærkt tanken om, at RhoC signalvejen er nødvendig for aktivering af STAT3 i HNSCC linjer.

(A og B) Western blot-analyse viser phosphorylering af STAT3

ser727 og STAT3

tyr705 i scrambled kontroller og RhoC knockdown UM-SCC-1 og -47 hhv. Normaliseret værdi i forhold til den samlede STAT3 gives som den numeriske værdi. Bemærkelsesværdig fald i phosphorylering af STAT3 blev set i RhoC knock-down UM-SCC-1 og -47 cellelinier hhv. (C) Protein analyse viser p-STAT3

tyr705 i ektopisk overudtrykkes (OE) scrambled kontrol og RhoC knockdown UM-SCC-1. Phosphorylerede form blev opdaget kun i scrambled kontrol, når STAT3 blev overudtrykt. En tyk bånd af total STAT3 kan ses i det nederste panel, hvilket bekræfter den succesfulde transfektion af STAT3 i disse kloner. (D) Real time RT-PCR, som viser ekspressionen af ​​STAT3, Sox2, oct3 /4 og Nanog før og efter STAT3 overekspression i RhoC knockdown klon. MRNA ekspressionen af ​​STAT3 var dramatisk høj efter det er overstået udtryk, mens ikke blev observeret nogen signifikant ændring i udtrykket i Sox2, oct3 /4 og Nanog i RhoC knockdown klon.

For at bekræfte, at phosphorylering af STAT3 sker via RhoC signalvejen, vi ektopisk overudtrykt STAT3 i en RhoC knockdown linje (UM-SCC-1). De samlede STAT3 niveauer i scrambled kontrol og RhoC knockdown kloner da STAT3 var over-udtrykte udstillet robuste bands, der betyder en succesfuld transfektion af STAT3. Mærkbart, p-STAT3

tyr705 kan kun ses tydeligt i STAT3 overekspression scrambled kontrol cellelinie. Mere specifikt i RhoC knockdown overudtrykt STAT3 klon, der var en tåler phosphorylering af STAT3 ved Tyr-705, der kunne observeres, og var meget lig de ekspressionsniveauer observeret i de oprindelige RhoC knockdown kloner (fig. 5C).

Desuden har vi analyserede mRNA ekspressionsniveauer for Nanog, Sox2, og oct3 /4 i STAT3 overudtrykt RhoC knockdown klon (UM-SCC-1). Som vist i figur 5D, var en bemærkelsesværdig stigning i STAT3-mRNA-ekspression observeret i denne cellelinje, men ekspressionen af ​​kernen stamceller transkriptionsfaktorer, Nanog, Sox2, og oct3 /4 er-uændrede, og svarende til den observeret i RhoC knockdown linjer.