PLoS ONE: Påvisning af Atomic Scale Ændringer i den gratis Volume Void størrelse af tre-dimensionelle Kolorektal Cancer Cell Culture Brug Positron Annihilation Lifetime Spectroscopy

Abstrakt

Positron udslettelse levetid spektroskopi (PALS) giver en direkte måling af frie volumen void størrelser i polymerer og biologiske systemer. Denne fri volumen er kritisk i at forklare og forstå de fysiske og mekaniske egenskaber af polymerer. Endvidere er PALS nylig blevet foreslået som et potentielt redskab til at opdage kræft i tidlige stadier, sondering forskellene i subnanometer skala fri volumen hulrum mellem kræft /sund hud prøver af den samme patient. Trods flere undersøgelser om fri volumen i komplekse ondartede væv, er blevet rapporteret nogen positron annihilation studier af levende kræft cellekulturer. Vi viser, at PALS kan anvendes til studiet i human levende 3D cellekulturer. Teknikken er også i stand til at detektere ændringer atomar skala i størrelsen af ​​de frie volumen hulrum på grund af de biologiske responser på TGF-β. kan udvikles PALS at karakterisere effekten af ​​forskellige dyrkningsbetingelser i fri volumen hulrum af celler dyrket

in vitro

Henvisning:. Axpe E, Lopez-Euba T, Castellanos-Rubio A, Merida D, Garcia JA, Plaza-Izurieta L, et al. (2014) Påvisning af Atomic Scale Ændringer i Free Volume Void størrelse af tre-dimensionelle Kolorektal Cancer Cell Culture Brug Positron Annihilation Lifetime spektroskopi. PLoS ONE 9 (1): e83838. doi: 10,1371 /journal.pone.0083838

Redaktør: Varda Rotter, Weizmann Institute of Science, Israel

Modtaget: Juli 12, 2013; Accepteret: November 17, 2013; Udgivet: 2 januar 2014

Copyright: © 2014 Axpe et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Basque Department for Industri give no. SAI11 /263 – PRODETEC og baskisk Institut for Uddannelse, universiteter og forskning giver ingen. IT /443/10. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

fri volumen hulrum spiller en central rolle i en lang række mekaniske egenskaber i polymerer [1] og dynamiske processer i biologiske systemer, herunder permeabilitet af små molekyler og diffusion af lægemidler gennem cellemembraner [2]. Positron annihilation levetid spektroskopi (PALS) giver en direkte måling af de frie volumen ugyldige størrelser i polymerer og biologiske systemer på det molekylære niveau, og dette frie volumen er afgørende for at forstå de fysiske og mekaniske egenskaber af komplekse biomolekylære systemer som kollagen [3], svin eye lens [4], rotte hjernesnit [5] og menneskehud [6].

det er for nylig blevet vist, at PALS er følsom over for ændringer i den frie volumen hulrum størrelse, der er forbundet med visse typer tumorer og er i stand til at skelne mellem raske og cancerøse hudprøver fra den samme patient. Således har PALS blevet foreslået som et potentielt værktøj til at detektere cancer dannelse i de tidlige stadier af tumorudvikling [6], [7]. Men cellulære sammensætning af vævsprøver varierer fra den samme organisme og kan involvere ændringer i ugyldige størrelser [8].

Vores hypotese er, at biologiske reaktioner på miljømæssige faktorer, såsom cellulær differentiering og ændringer i celle koloni struktur er ledsaget af ændringer atomare skala i det frie volumen ugyldig størrelse af cellerne, og at disse ændringer kan være præget af PALS. For at teste denne idé, vi brugte en T84 human coloncancer 3D cellekultur model under to forskellige forhold, der resulterer i særskilte

in vitro

flercellede organisering af kolonier. Celler blev dyrket i et type I collagen gelmatrix med eller uden transformerende vækstfaktor β (TGF-p), en fibroblast-afledte faktor, der påvirker epitelcelleproliferation, differentiering, motilitet, og T84-celledifferentiering. Celler i kollagen danner uorganiserede 3D celleklynger i gelerne, men ved dyrkning i nærvær af TGF-β, T84 epitelceller kan tilrettelægge og differentiere til en distinkt fænotype, der ligner intestinale krypter [9]. Vi viser, at PALS målinger er i stand til at påvise ændringer atomare skala af hulrum størrelse i human colon adenocarcinom 3D cellekulturer udvikler sig over tid og når de behandles med TGF-β.

Materialer og metoder

Cell kultur

Menneskelig kolon adenocarcinom T84 cellelinie (CCL 248, ATCC Rockville, MD, USA) blev venligst stillet til rådighed af professor Markku Maki (Cøliaki Study Group, University of Tampere, Finland). Celler blev holdt i kultur i laboratoriet. Dulbeccos Eagles blanding modificeret medium F12 næringsstof (01:01) (DMEM-F12 ref 31330), penicillin-streptomycin (ref 15070) og natriumhydrogencarbonat blev købt hos Life Technologies (Spanien). Varmeinaktiveret føtalt bovint serum (ref F9665), 10 × RPMI-1640 (ref R1145), trypsin /EDTA (ref T4049), Triton X-100 (ref T9284), albumim fra bovin serum (ref B4287) og ribonuclease A (ref R6513) blev opnået fra Sigma-Aldrich (Spanien). Rottehalecollagen I (ref 354.236) blev indkøbt fra Beckton Dickinson (Spanien). Transformerende vækstfaktor beta 1 rekombinant humant (rhTGF-β, ref 240-B) blev købt fra R For normale vækstbetingelser det gennemsnitlige tomme volumen i toppen var 102 ± 1 a

3 på 34 dage, mens den for kultur med TGF-β var 111 ± 1 a

3 ved 20 dage. Som vist i figur 2, når den gennemsnitlige void størrelse nåede et Maksimal, denne værdi begyndte at falde gradvist: middelværdien hulrumsvolumen faldt 7% under normale forhold i 1 uge, og 16% i 3 uger under TGF-β betingelser

den blå kurve repræsenterer kontrolkulturer og den røde kurve repræsenterer kulturer behandlet med TGF-β. |

den gennemsnitlige levetid og distribution

o

PS i tre dimensionale cellekulturer var henholdsvis 2-12% og 20-120% større end i collagen (tabel 1). Afhængig af væksten tidspunkt,

o

PS levetid fordeling for TGF-beta kulturer var mellem 0,11 ± 0,08 ns til 0,26 ± 0,07 ns større end under stimulerede vækstbetingelser.

Diskussion

Vi har vist, at T84 3D kultur model giver mulighed for særlig undersøgelse af frit volumen i levende celler ved PALS. Vi fandt, at PALS registrerer ændringer atomare skala af den gennemsnitlige frie volumen ugyldig størrelse i human colon adenocarcinom 3D cellekulturer over tid. Morfologiske ændringer observeret af immunfluorescensmikroskopi i cellekulturer i forskellige forhold er helt sikkert en konsekvens af molekylære begivenheder, der finder sted i cellerne og er også afspejlet i PALS målinger. Selvom cellekultur udviklingsmæssige begivenheder, som ikke kan korreleres direkte til det frie volumen, resultater antyder, at cellulære ændringer faktisk afspejles i nanostruktur af disse kulturer.

o

PS levetid ændringer formentlig dukke op fra de dynamiske processer i cellekulturer (vækst, division og dødsfald). Endvidere TGF-β inducerer celle differentiering, og dette acompained af en stigning i fordelingen af ​​

o

-PS levetid (og derved af frit volumen størrelse) i 3D-cellekulturer. Dette resultat indebærer en større spredning af hulstørrelse i prøver behandlet med TGF-β sammenlignet med ikke-stimulerede betingelser. Celledød kan inddrages i faldet i

o

PS levetid.

Vi er på tærsklen til PALS applikationer i komplekse cellesystemer, men vores resultater viser, at 3D cellekulturer (

o

PS levetid måles i en blanding af celler og collagen) kan være et godt udgangspunkt for denne type forskning. I øjeblikket PALS tillader kun bulk-målinger, der ikke giver tilstrækkelig opløsning til at skelne

o

PS levetider i de enkelte celler fra hele kulturen. Ikke desto mindre skal den målte stigning i levetid og udlodninger skyldes molekylære og strukturelle ændringer, der påvirker den frie volumen af ​​cellerne og dermed den for 3D-kultur. Desuden PALS er en ikke-perturbative teknik; det forstyrrer hverken strukturen af ​​3D kultur eller celle dynamik. Vi brugte Tao-Eldrup model for polymerer ved beregningen af ​​størrelserne af gratis volumen hulrum fra

o

PS levetid, som tidligere gjort i mange PALS studier i biologiske systemer [3] -. [7]

Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse af anvendelsen af ​​PALS i 3D levende cellekulturer og faktisk, flere målinger i forskellige cellelinjer og dyrkningsbetingelser, der ændrer forskellige biologiske parametre er nødvendig, før denne metode kan være anses et potentielt nyttigt diagnostisk værktøj i human sygdom. Sammen med den eksperimentelle forskning, at undersøgelser viser, om de lokale elektriske felter forårsaget af transmembran spænding på cellerne påvirker positron signal eller hvilke dele af cellen er foretrukne mål for positron annihilation bør også foretages. Derudover til beregningsmæssige simuleringer evaluere tilpasningen af ​​Tao-Eldrup model (implementeret for frit volumen karakterisering i polymerer) til mere kompleks biologisk materiale vil være nødvendigt.

Som konklusion, dette er den første undersøgelse anvender PALS for karakterisering af levende celler. Vores resultater viser, at 3D cellekulturer er nyttige til måling fri volumen i levende celler ved PALS i en realistisk og kontrolleret måde, og til observation af ændringer i fri volumen void størrelser i cellekulturer skyldes specifikke faktorer (fx vækst tid og TGF-β). Denne undersøgelse er i overensstemmelse med PALS teknik som et gyldigt redskab til karakterisering af biologiske systemer og kunne give nyttige oplysninger i kræftforskning på det atomare og molekylære skala.

Støtte oplysninger

figur S1.

Design og opsætning af indehaveren prøven og positron kilde for anvendelsen af ​​PALS i biologiske prøver og væsker. Vi designede og fremstillede en prøveholder aluminium til måling af biologiske prøver og væsker. Scintillatorerne og fotomultiplikatorer der anvendes i dette arbejde blev anbragt i en lodret stilling. Figuren viser længdesnit af prøveholderen (1). I (2) beskriver vi prøven fylde den nedre side af holderen. I (3), vi placere Kapton-kilden over prøven, sidder på aluminium projektion. Vi kan også se, hvordan

22Na er tidligere deponeret lige i midten af ​​Kapton, så alle positronerne tilintetgøre i prøven, og ikke i holderen. Denne Kapton kilde skal være robust, så vi anvendte en tykkere Kapton folie på 75 um for den del sidder på holderen fremspring (Kapton folie B), sammenlignet med 7,5-um Kapton folie A. I (4) viser vi, hvordan den positron kilde er klemt inde af to identiske flydende /biologiske prøver

doi:. 10,1371 /journal.pone.0083838.s001

(TIFF)

Video S1.

konfokal immunfluorescens af tredimensionelle T84 kolonier efter 7 dage i kultur

doi:. 10,1371 /journal.pone.0083838.s002

(AVI)

Video S2.

konfokal immunfluorescens af tredimensionelle T84 kolonier efter 17 dage i kultur

doi:. 10,1371 /journal.pone.0083838.s003

(AVI)

Video S3.

konfokal immunfluorescens af tredimensionelle T84 kolonier efter 7 dage i kultur med 10 ng /ml TGF-β

doi:. 10,1371 /journal.pone.0083838.s004

(AVI)

Video S4 .

konfokal immunfluorescens af tredimensionelle T84 kolonier efter 17 dage i kultur med 10 ng /ml TGF-β

doi:. 10,1371 /journal.pone.0083838.s005

(AVI)

Tak

Teknisk og menneskelig støtte fra SGIker (UPV /EHU, MICINN, GV /EJ, EFRU og ESF) er taknemmeligt anerkendt.