PLoS ONE: Sema3E /plexin-D1 medieret Epithelial-til-Mesenchymale Transition i æggestokkene endometrioide Cancer

Abstrakt

Kræftceller ofte ansætter udviklingsmæssige stikord til fordelagtige vækst og metastase. Her rapporterer vi, at en Axon vejledning molekyle, Sema3E, er stærkt udtrykt i human høj kvalitet æggestokkene endometrioide karcinom, men ikke lav kvalitet eller andre ovarieepitelceller tumorer, og letter tumor progression. I modsætning til sin kendte angiogene aktivitet, Sema3E handlet gennem plexin-D1-receptorer til at øge celle vandrende evne og samtidig epitel-til-mesenkymale overgang (EMT). Sema3E-induceret EMT i æggestokkene endometrioide kræftceller var afhængig af nukleare lokalisering af Snail1 gennem aktivering af phosphatidylinositol-3-kinase og ERK /MAPK. RNAi-medieret knockdown af Sema3E, plexin-D1 eller Snail1 i Sema3E-udtrykkende tumorceller resulterede i kompromitteret celle motilitet, samtidig reversion af EMT og formindsket nukleare lokalisering af Snail1. Derimod tvungen tilbageholdelse af Snail1 i kernen af ​​Sema3E-negative tumorceller induceret EMT og forbedret cellemotilitet. Disse resultater viser, at der ud over de angiogene virkninger af Sema3E på tumor vaskulært endotel, kan en EMT strategi udnyttes af Sema3E /plexin-D1-signalering i tumorceller til fremme af cellulær invasion /migration

Henvisning:. Tseng CH , Murray KD, Jou MF, Hsu SM, Cheng HJ, Huang PH (2011) Sema3E /plexin-D1 medieret Epithelial-til-Mesenchymale Transition i æggestokkene endometrioide kræft. PLoS ONE 6 (4): e19396. doi: 10,1371 /journal.pone.0019396

Redaktør: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique fonctionnelle de Lyon, Frankrig

Modtaget: December 31, 2010; Accepteret: 29 2011; Udgivet: 29 April, 2011

Copyright: © 2011 Tseng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en fond fra National Taiwan University Hospital (NTUH98-P26-2 og NTUH99-P21) givet til PH Huang. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

malignt progression af en tumor ofte indebærer erhvervelse af et forstærket vandrende evne i kræftceller til lokal invasion og fjernmetastaser, som begge er de vigtigste determinanter for klinisk sygelighed og dødelighed. Lignende biologiske processer forekomme i hele normal embryonisk udvikling, såvel som i visse fysiologiske tilstande, såsom sårheling [1], [2]. Indsigt fra udviklingsmæssige biologi kunne derfor hjælpe os med at forstå den invasive karakter af ondartet progression af en tumor.

Semaphorins (Sema) er en stor familie af udskilte og membran-associerede proteiner, der giver miljømæssige stikord til at mægle diverse udviklingsprocesser, herunder neuronal cellemigrering, axon vejledning, vaskulogenese, forgrening morfogenese, og kardial organogenese [3] – [8]. Semaphorins binder plexin og /eller neuropilin receptorer til at transducere intracellulære signaler. På nuværende tidspunkt er fem klasser af semaphorins, to neuropilins og fire familier af plexins identificeret i pattedyr [6]. Seneste tyder også semaphorin /plexin signalering er involveret i tumorigenese [9] – [11]. Men deres roller er ret forskellige og afhænger af den konkrete tumor sammenhæng og sammensætningen af ​​semaphorins, plexins, og deres intracellulære signal responsive elementer. Semaphorin /plexin signalering kan enten fremme eller hæmme tumorvækst ved direkte at regulere celle migration eller celle apoptose. Semaphorin /plexin signalering kan også indirekte kontrollerer tumor invasiv vækst gennem regulering af angiogenese eller tumor immunitet [10], [12] – [16].

I en skærm af klasse 3 semaphorins i tumorvæv arrays (nogle eksempler er vist i fig. S1c) identificerede vi Sema3E som specifikt udtrykkes i høj kvalitet ovarie endometrioide carcinom, en undertype af epitelial ovariecancer (fig. 1). Klinisk fleste diagnoser af høj kvalitet ovariecancer har dårlig prognose med tumormetastase og er resistente over for kemoterapi understreger behovet for fuldt ud at forstå patogenesen af ​​epitelial ovariecancer og deres progression [17]. Anvendelse af et humant ovarie endometrioide carcinom cellelinie og afledte underlinjer med forskellige invasive /vandrende kapaciteter [18], undersøgte vi den indbyrdes forbindelse mellem Sema3E molekylære og cellulære signalveje mekanismer og tumorindtrængen. Vi rapporterer her, at Sema3E fra tumorceller kan handle på sig selv gennem plexin-D1 til at fremkalde EMT og samtidig lette celle migration og ondartet progression.

A, B. RNA

in situ

hybridisering med antisense

Sema3E Salg probe og immunhistokemi med et polyklonalt antistof mod Sema3E show differentiel ekspression af mRNA og protein henholdsvis i celler i hele vævssnit fra høj og lav kvalitet humane ovarieepitelceller cancere. Hematoxylin og eosin-farvning (H 10-fold) i høj-invasiv /vandrende P4-celler sammenlignet med P0 celler. Derimod Sema3F generelt betragtes en tumor suppressor blev nedreguleret i P4-celler [10], [19]. Selv om der blev observeret variabel plexin og neuropilin ekspression blev plexin-D1 og NPN 1 ligeligt udtrykt i lav-invasiv P0 og høj-invasive P4-celler (fig. 1 E og S2B). RNA

situ

hybridiseringsanalyse på dyrkede enkelt æggestokkene endometrioide cancerceller i bekræftede disse resultater (fig. S2a). Dette tyder Sema3E udtryk i æggestokkene endometrioide kræftceller kan inddrages i erhvervelsen af ​​cellulære invasive /vandrende evne.

Den P61-Sema3E isoform er tilbøjelige til at handle på en autokrin måde gennem plexin-D1 til at forbedre invasive /vandrende evne æggestokkene endometrioide kræftceller

in vitro

i en koncentrationsafhængig måde

for at undersøge betydningen af ​​Sema3E i mediering invasiv og /eller migrerende evne under tumorprogression, vi udførte gevinst og tab af funktion studier i OEC celler. Først, vi overudtrykt Sema3E i forældrenes Sema3E-negativ, lav invasive P0 celler. Disse stabile cellelinjer (betegnet P0-3E-

1, P0-3E-

3 og P0-3E-

10) udviste variable grader af Sema3E ekspression som målt ved semikvantitativ RT-PCR, immunoblotting , og RNA

in situ

hybridisering (fig. 2A). For det andet, Sema3E udtryk i stærkt invasive P4 celler blev stabilt slået ned af RNAi-medieret udtynding. Vi opnåede to kloner, betegnet P4 /si3E-

1 og P4 /si3E-

2 mål for forskellige RNAi-sekvenser, der viste 75% -90% fald i Sema3E forhold til forældrenes P4-celler (fig. 2B, højre paneler ). Kontrol OEC kloner blev transficeret enten med tom-vektor (-mock) eller krypterede RNAi sekvenser (-styring). Flowcytometrianalyse og trypanblåteksklusion eksperimenter indikerede, at cellelevedygtighed og proliferation blev ikke ændret i P0-3E og P4 /si3E kloner (fig. S2C og D).

A. Modificerede P0 cellelinier (P0-3E-

x) udtrykker variable niveauer for Sema3E som målt ved semikvantitativ RT-PCR-analyse (til venstre øverst) og Western blotting (venstre nederst). Expression værdier blev normaliseret til

GAPDH

œ-tubulin til mRNA og protein. RNA

in situ

hybridiseringsprober ved Sema3E i P0-3E-

1 sammenlignet med P0 celler (til højre). B. Western blotting af Sema3E og plexin-D1 i P4 /si3E kloner (RNAi-1, -2 til målretning to forskellige sekvenser af Sema3E) og P0-3E-

1 /siD1 kloner (RNAi-1, -2 for målretning to forskellige sekvenser af plexin-D1). C, D, E, F. Lysfelt mikrofotografier fra sårhelende migration assays af forskellige P0-3E (C), P0-3E-

1 /siD1 (D), og P4 /si3E (E) cellelinier ved begynder (0 h) og 16 timer efter overfladen bunden. Sårkanterne blev markeret med hvide linier (0 h) eller sorte streger (16 h). Scale bar, 0,5 mm. Et resumé af den gennemsnitlige migrerende hastighed (um /h) for hver klon er plottet (F) med standardafvigelse (n≥12). *,

P

0,05, parret

t

-test. G, H. Repræsentative billeder (G) og resumé graf (H) i transwell kammerets invasion assay (n≥6). Scale bar, 30 um. I. furin hæmmer, decanoyl-RVKR-chlormethylketon, ændrer vandrende evne P0-3E-

1 celler i sårheling og Transwell kammer migration assays. DMSO blev anvendt som kontrol. Hvid linje, 0 h i sårheling proces; sort linje, 16 timer efter overfladen bunden. **,

P

0,005, *,

P

0,05, parret

t

-test, n = 5. Scale bar, 0,5 mm. J. Transwell kammer invasion assay for P0 celler stabilt udtrykker P61-Sema3E isoform (P0-3Ep61-

1 og P0-3Ep61-

2) i forhold til P0-3E-

1 celler og P0 celler. **,

P

0,005, parret

t

-test, n = 4. Scale bar, 0,3 mm

invasive /vandrende evner. OEC kloner blev evalueret af

in vitro

sårheling, 3-dimensional (3D) -matrigel migration, og Transwell kammer invasion assays. I sårhelende assay, P4-mock og P0-3E-

1 celler begyndte at fylde såret så tidligt som 4 timer efter bunden, hvorimod P0-mock celler udviste langsom motilitet selv efter 16 timer. De P0-3E kloner migrerede i en Sema3E dosisafhængig måde, således at P0-3E-

1 og P0-3E-

9 celler, relativt høje mængder af Sema3E udtrykke, flyttede hurtigere og længere end P0- 3E-

3 og P0-3E-

10 celler, som udtrykte lavere mængder af Sema3E (fig. 2C og F). Omvendt, udtynding af Sema3E i P4 celler bremset vandrende hastighed og afstand (fig. 2E og F). blev observeret Lignende ændringer i matrigel migration analysen og transwell kammer invasion assay: P4 og P0-3E-

1 celler udviste en signifikant større invasiv potentiale i forhold til P0-3E-

10, P4 /si3E eller forældreorlov P0 celler, hvor Sema3E niveauer er reduceret eller fraværende (fig. 2G, H og S2E). Derfor overekspression af Sema3E i lav-invasiv OEC celler øger cellulære vandrende og invasive evner

in vitro

i en gør-afhængig måde, og knockdown af Sema3E formindsker vandrende /invasive evner i høj invasive OEC celler .

Sema3E binder direkte med plexin-D1 til transducere intracellulære signal under embryonal eller tumor angiogenese [20]. Vi afgjort, om plexin-D1 i OEC celler er nødvendig for Sema3E medieret vandrende /invasiv evne, der er relateret til angiogenese. To stabile Knockdown kloner, P0-3E /siD1-

1 og P0-3E /siD1-

2 blev genereret ved RNAi målretning af separate plexin-D1 sekvenser, som reducerede plexin-D1-niveauer med 85% -95% som bestemt ved Western blotting (fig. 2B, venstre paneler). Knockdown af plexin-D1 påvirkede hverken ekspressionen af ​​Sema3E eller levedygtighed eller proliferation af celler (fig. 2B, S2C og S2D). Imidlertid blev den invasive /vandrende fænotype ved overekspression af Sema3E vendes ved tab af plexin-D1 (fig. 2D, F, G, H). Disse resultater antyder, at Sema3E bibringer en migreringsevnen til OEC celler gennem plexin-D1 på en autokrin måde.

fuld længde klasse 3 semaphorin proteiner er underlagt konvertase-medieret spaltning, hvorved der genereres flere isoformer med differentialtælling aktiviteter [ ,,,0],15], [21]. I brystkræftceller, er P87-Sema3E protein spaltes af furin i P61 og P26 isoformer, og det er P61-Sema3E som inducerer angiogenese for invasiv vækst [15]. Når der udføres Sema3E immunoblotting i Sema3E-udtrykkende OEC celler, bemærkede vi, at en P61-sized band stedet for fuldlængde p87-Sema3E blev påvist, selv om alle P0-3E kloner blev transficeret med en fuld-længde Sema3E cDNA konstruere ( fig. 2A). Vi undersøgte, om dette P61-protein svarede til furin-forarbejdede Sema3E. Immunoblotting viste, at furin var til stede i alle OEC celler (Fig. S3A). Når furin aktivitet blev hæmmet af decanoyl-RVKR-chlormethylketon, udtryk for P61-Sema3E var signifikant reduceret, mens fuld størrelse P87-Sema3E blev klart (fig. S3B). Desuden var Sema3E-medieret migrerende /invasive aktiviteter kompromitteres i nærværelse af furin-inhibitor (fig. 2i). For at undersøge muligheden for, at P61-Sema3E alene er tilstrækkeligt til at fremme den vandrende /invasive evne OEC celler knyttet Sema3E, vi etableret P0-3Ep61 kloner, der udtrykte kun P61-Sema3E isoform. Begge

in vitro

(fig. 2J, S3C og S3D) og

in vivo

(fig. 3C) undersøgelser viste, at ekspressionen af ​​P61-Sema3E alene var tilstrækkelige til at fremme vandrende /invasiv evne i OEC celler. RNAi-medieret knockdown af plexin-D1 i OEC celler stabilt udtrykt P61-Sema3E mindsket vandrende evne tillagt ved P61-Sema3E (data ikke vist). Af ukendte årsager kunne vi ikke generere OEC celler stabilt udtrykker mutant P87-Sema3E resistent over for furin spaltning. Derfor har vi testet konditionerede medier fra COS celler forbigående transficeret med enten P61-Sema3E eller P87-Sema3E på cellulær motilitet Sema3E-negative /plexin-D1-positive P0 celler. Faktisk eksogen P61-Sema3E-medium dosisafhængigt fremmet celle migration og denne virkning blev svækket, da Sema3E blev udtømt fra mediet ved præ-inkubering med anti-Sema3E antistof (fig. S3E og F). Når uforarbejdet P87-Sema3E-konditionerede medium blev påført, blev ingen forøgelse i cellemigrering observeret (data ikke vist). Tilsammen indikerer disse data, at P61-Sema3E, men ikke fuld længde P87-Sema3E, fremmer en plexin-D1 afhængige migreringsevnen i OEC celler.

A. Gross og mikroskopiske ændringer i lungerne efter intravenøs (i.v.) injektion i NOD /SCID-mus af OEC cellelinjer, der udtrykker forskellige Sema3E /plexin-D1 aktiviteter. Pilespids angiver mikroskopiske tumor reder nær den vaskulære træ. Scale bar, 50 um. B. Immunhistokemi af Sema3E, cytokeratin og TTF1 i pulmonale metastatiske tumorer i NOD /SCID-mus i.v. injiceret med P0-3E-

1-celler. C. Oversigt over

in vivo

metastatisk eksperimentelle resultater. Antallet af mus med mikro-metastatisk tumorform læsion af lungen (venstre til skråstregen) versus det samlede antal mus undersøgte (ret til skråstregen) er vist. Gennemsnitlig lunge vægt afveg mellem grupperne (*,

P

0,05, Students

t

-test).

Sema3E /plexin-D1 signalering fremmer metastase af æggestokkene endometrioide kræft

in vivo

Vi næste evaluerede

in vivo

metastatisk kapacitet OEC celler med forskellig Sema3E /plexin-D1-aktivitet i NOD /SCID-mus. Intravenøs injektion af Sema3E-negative P0 celler på intet tidspunkt resulteret i tumormetastase i alle organer undersøgt på 8 uger efter celle intravenøs injektion. Derimod injektion af Sema3E-udtrykkende OES kloner forårsaget metastatisk tumorvækst i lungen som påvist ved en stigning af total lungevægt (fig. 3C), brutto intrapulmonær blødning (fig. 3A, toppaneler), og tilstedeværelsen af ​​mikroskopisk tumor reder nær de vaskulære træer (fig. 3A, bundpaneler). De pulmonale tumorer stammede fra de injicerede OEC celler som påvist ved positiv immunreaktivitet for humane Sema3E og cytokeratin (markører for humane celler), men ikke TTF-1, en markør for pneumocytter (fig. 3B). Desuden blev en Sema3E dosisafhængig og plexin-D1-afhængig metastatisk effekt observeret. En højere procentdel af pulmonale mikro-metastaser udviklet i mus injiceret med OEC celler, der udtrykker høje niveauer af Sema3E (P0-3E-

1, P0-3Ep61, P4-celler), mens celler med lav Sema3E /plexin-D1-aktivitet (P0 -3E-

10, P4 /si3E, P0-3E-

1 /siD1) havde en lavere procentdel af tumorer (fig. 3C). Også P61-Sema3E alene var i stand til at give pulmonal mikro-metastaser på forældrenes P0 celler

in vivo

(fig. 3C). Alle sammen, disse resultater viser, at P61-Sema3E gennem plexin-D1 signalering er ansvarlig for tildeling en dosisafhængig stimulation af pulmonal metastatisk vækst OEC celler.

Sema3E /plexin-D1 signalering ændrer dynamikken i single OEC cellemorfologi, i overensstemmelse med en ændring i cellemotilitet

Vi observerede ændringer i OEC cellulær morfologi, der korrelerede med aktiviteten af ​​Sema3E /plexin-D1 signalering. Celler med høj Sema3E ekspression og hurtig cellemotilitet såsom P0-3E-

1 og P4-celler var normalt spindel-formet med en bi-polar eller multi-vinkel fibroblastoid udseende (fig. 4A og B), medens P0, P0 -3E-

10, P4 /si3E, og P0-3E-

1 /siD1 celler, som var lavt Sema3E /plexin-D1 aktivitet og lav migreringsevnen, opretholdt en højere procentdel af runde former med en brosten-lignende udseende (fig. 4A og B). Vi undersøgte denne sammenhæng i detaljer, ved at spore de enkelte OEC ruter celle migration og udføre time-lapse fotografering under sårheling assay. I modsætning til indtryk genereret fra steady-state billeder, time-lapse fotografering afslørede et dynamisk mønster af cytomorphological cykle mellem runde, bipolar og multiangular figurer, der blev observeret for undersøgte alle OEC-celler (Fig. 4C). Vi fandt, at Sema3E /plexin-D1-aktivitet væsentligt påvirket tidspunktet OES-celler blev observeret i en rund form. Således P0 og P0-3E- fastholdt

1 /siD1 en runde morfologi længere end P4 og P0-3E-1 celler, som hurtigt skiftet gennem runde form og skred hurtigt ind i en polariseret spindel form (fig. 4C og E) . Desuden enkelt celle sporing afslørede, at OEC celler med Sema3E /plexin-D1 signalering tendens til at bevæge sig i en retning for en lang afstand, men celler med lav Sema3E /plexin-D1-aktivitet ofte standsede og ændret deres vandrende sti (fig. 4D ). Som en konsekvens, P4 og P0-3E-

1 celler kunne bevæge sig hurtigt i en retning for en lang afstand, mens P0 og P0-3E-

1 /siD1 celler gået i stå, konstant ændrede retninger, og var ude af stand til at flytte langt i den ene retning (fig. 4D). Dette hænger godt sammen med de samlede migrerende evner forskellige Seam3E-udtrykkende OEC celler i sårheling assay. Flere interessante, det cytomorphological overgang fra runde til spindel form, der er stærkt forbundet med købet af celle motilitet ligner fænomenet såkaldt epitelial-til-mesenkymale overgang (EMT) [22], hvilket tyder på, at Sema3E /plexin-D1 signalering i OEC celler kunne inddrages i EMT-processen.

A. Repræsentative billeder af tre forskellige celle figurer af OEC celler som runde, bi-polar og multi-kantet. B. Kvantificering af den procentdel af hver morfologi i en samlet population (n≥400) af OEC kloner med variabel aktivitet Sema3E /plexin-D1. C, D, E. Time-lapse sporing (op til 200 minutter med 20-min tracing intervaller) af de morfologiske dynamik enkelt OEC celler i en sårhelende proces (C). Single OEC vandrende stier blev plottet (D). Pile viser begyndelsen af ​​hvert sporing, og farvede punkter angiver positionen af ​​det spores celle på hvert tidspunkt. Hvert trin i vandrende sekvens var mærket med tallene samme som dem i (C). Søjlediagrammet i (E) sammenfattet gennemsnitlige tidsinterval brugt af hver OEC celle i hvert enkelt celle form. *,

P

. 0,05, parret

t

-test

Sema3E /plexin-D1 signaler gennem PI3K og MAPK at fremkalde nukleare Snail1 translokation og epitelial -til-mesenkymale overgang

Under EMT, celler ofte mister deres epitelial molekylære markører og erhverve markører for mesenkymale celler [23] – [26]. Vi undersøgte således den molekylære profil forskellige OEC kloner at bestemme, om Sema3E-induceret morfologiske ændringer blev associeret med en EMT begivenhed. E-cadherin, en epithelial markering, blev nedreguleret i Sema3E-udtrykkende OES celler i en Sema3E-koncentrationsafhængig måde, medens mesenchymale markører vimentin og fibronectin blev opreguleret (fig. 5A, B, og data ikke vist). Derimod RNAi-knockdown af plexin-D1 i Sema3E-udtrykkende celler afskaffet Sema3E-inducerede molekylære ændringer er karakteristiske for EMT (fig. 5A og C). Der blev observeret lignende Sema3E-associerede ændringer i EMT-markører, når celler blev undersøgt ved konfokal immuno-fluorescerende mikroskopi (fig. 5C og S4A). Desuden immunfarvning for filamentøs actin i Sema3E-udtrykkende celler identificeret filopodia og lamellipodia dannelse typisk for EMT-inducerede cytoskeletændringer, men dette blev ikke observeret i celler med lav Sema3E /plexin-D1-ekspression (fig. 5C, toppaneler).

A, B. Ekspression af cellulære markører for EMT korrelerer med niveauerne af Sema3E /plexin-D1-aktivitet i modificerede OEC celler som målt ved semikvantitativ RT-PCR (A) og Western blotting (B). Derimod er medlemmer af sneglen familie transkriptionsfaktorer, der regulerer udviklingsmæssige EMT ensartet udtryk i modificerede OEC cellelinjer. Signal intensiteter blev normaliseret til

GAPDH Hotel (A) eller œ-tubulin (B), henholdsvis, og er angivet som nøgletal. C, D. konfokal mikroskopi af OEC celler viser et skift fra epitel (E-cadherin) til mesenchymale (Vimentin) markør udtryk og en tydelig nuklear translokation af Snail1 i modificerede OEC celler udviser større Sema3E /plexin-D1-aktivitet. Immunoreaktivitet for filamentøs actin, og nuklear DAPI-farvning blev anvendt som generelle markører for cellemorfologi. Scale bar, 20 pm. E. Nuklear lokalisering af Snail1 er forbundet med høj kvalitet af humant OEC væv, men ikke lav kvalitet humane OEC væv. Snail1 blev ikke påvist i æggestokkene endometriose. Scale bar, 10 um. F. E-cadherin promotoraktivitet, målt ved normaliseret luciferaseekspression i modificerede OEC linjer, nedreguleres i celler med høj Sema3E /plexin-D1 signalering. Dette er afhængig af Snail1 translokation siden knockdown af Snail1 eller en muteret E-box forhindrer transkriptionel repression. Fejl søjler viser s.e.m., n = 9. **,

P

0,01, *,

P

0,05, parret

t

-test. G. Western blots illustrerer RNAi-medieret knockdown af Snail1 i Sema-3E udtrykker P0-3E-

1-celler via Lenti-virusinfektion. H. Knockdown af Snail1 ekspression i P0-3E-

1 celler reducerer migration i sårheling assay. I. Knockdown af Snail1 i P0-3E-

1 celler inducerer et skift fra spindel formet, vimentin positivt at en afrundet, E-cadherin positive cellulære morfologi. Scale bar, 10 um. J, K. Farmakologisk-induceret tilbageholdelse af nuklear Snail1 ved leptomycin B (20 ng /ml) forøger migreringsevnen og inducerer en spindel formet cellulær morfologi i P0 celler. Scale bar, 10 um.

En væsentlig regulator af EMT under fosterudviklingen og tumorprogression er sneglen familie af zink finger transkriptionsfaktorer, hvoraf Snail (Snail1) og Slug (Snail2) er de mest intensivt undersøgt [27] – [29]. Mange epitelial kræftceller fremkalde EMT via opregulering af Snail1 medieret transkription [22]. Men Sema3E ekspression i OEC celler ikke ændre mRNA eller proteinniveauer af Snail1 (eller Snail2 og Twist) (fig. 5A og B). Funktionen af ​​Snail1 kunne alternativt være moduleret ved sin subcellulære lokalisering så nuklear translokation af cytosolisk Snail1 er nødvendig for tilgængeligheden af ​​target initiativtagere [30], [31]. Vi undersøgte, om Sema3E /plexin-D1 moduleret den subcellulære lokalisering af Snail1 i OES celler. Immuno-fluorescerende mikroskopi afslørede en blandet population af OEC celler med Snail1 enten overvejende placeret i kernen, eller i cytoplasmaet. Imidlertid kernelokalisering af Snail1 korrelerede positivt med Sema3E /plexin-D1-aktivitet. I celler med høj Sema3E /plexin-D1-aktivitet såsom P0-3E-

1-celler, mest udviste fremherskende kernelokalisering af Snail1 (64% ± 8% [middelværdi ± standardafvigelse for tre eksperimenter]), mens de fleste celler med lav Sema3E /plexin-D1-aktivitet viste et overvejende cytosolisk fordeling af Snail1 (for eksempel: P0, 78% ± 6% cytosolisk Snail1 lokalisering) (fig 5D.). Desuden immunhistokemi af Snail1 i humane ovarie endometrioide carcinomer viste, at high-grade tumorer havde en højere procentdel af cancerceller med nukleare Snail1 og lav kvalitet tumorer havde overvejende cytosolisk Snail1 lokalisering (fig. 5E). Derimod blev der ikke Snail1 ekspression observeret i endometriose cyste-foring celler (Fig. 5E). Disse observationer tyder på, at Sema3E /plexin-D1 signalering i æggestokkene endometrioide kræftceller kan fremkalde EMT gennem nuklear translokation af Snail1.

For at bestemme om Snail1 er en downstream lydhør element for Sema3E /plexin-D1 signalering i OEC celler inden forbindelse med EMT og cellemotilitet, testede vi, om det transkriptionelle nedregulering af epitelcelle markør E-cadherin som respons på Sema3E /plexin-D1 signalering afhænger Snail1. Som vist i fig. 5F viste luciferase-promotor aktivitetsassay at celler med høj Sema3E /plexin-D1 aktivitet udvist undertrykte promotoraktivitet af E-cadherin (f.eks sammenlign P0-3E-

1 celler med P03E /siD1 eller P0 celler). Derimod mutation i E-boks (et mål anerkendt af Snail1) eller RNAi-knockdown af Snail1 resulterede i tab af undertrykkelse i E-cadherin promotor-aktivitet tillagt ved Sema3E /plexin-D1. Desuden kunne knockdown af Snail2 i P0-3E-

1 celler ikke disinhibit den undertrykte promotoraktivitet af E-cadherin (fig. 5F). Vi fandt også, at RNAi-knockdown af Snail1 i Sema3E-udtrykkende celler forårsaget spindel-formede celler tansformed i rundere form og udtryk for E-cadherin og vimentin samtidig gendannes (fig. 5G og jeg), hvilket indikerer, at Snail1 er nødvendig for Sema3E -induceret EMT. Hertil kommer, at forbedrede vandrende evne tillagt ved Sema3E i P0-3E-

1 celler blev formindsket, da Snail1 var RNAi-forarmet, men uændret ved RNAi-udtømning af Snail2 (fig. 5H). Tværtimod tvungen tilbageholdelse af Snail1 i kernen ved leptomycin B behandling i Sema3E-negative P0 celler forøget celle migreringsevnen og resulterede i omdannelse til spindelformede celler (Fig. 5J og K). Dette antyder, at Snail1 translokation i nucleus funktioner nedstrøms for Sema3E signalering at mægle cellemorfologi og motilitet. Time-lapse sporing af Snail1 subcellulære lokalisering versus cellemorfologi og vandrende hastighed afslørede en korrelation mellem Snail1 kernelokalisering og spindel celleform samt med øget vandrende hastighed (fig. S4b, C og D). Tilsammen tyder disse undersøgelser, at Sema3E /plexin-D1 signalering i æggestokkene endometrioide cancerceller kunne regulere Snail1 translokation til kernen for at inducere EMT og samtidig øge cellemotilitet.

intracellulær signalvej (er), der kan regulere Sema3E /plexin-D1 medieret translokation af Snail1 og efterfølgende EMT i OEC celler blev undersøgt ved at teste virkningen af ​​flere kendte kinaseinhibitorer på cellemotilitet og Snail1 subcellulære lokalisering. Inhibering af p38 mitogenaktiveret proteinkinase (SB203580), proteinkinase C (GF109203X), og Jun N-terminal kinase (SP600125) i Sema3E-udtrykkende OEC celler havde ingen virkning på Sema3E-augmented cellemigrering eller på Snail1 kernelokalisering. Derimod inhibering af phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) (LY294002 og wortmannin) eller ekstracellulært signal-reguleret kinase (ERK) /mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) (PD98059) aktivitet resulterede i cytosolisk tilbageholdelse af Snail1 og et ledsagende fald i migreringsevnen tillagt ved Sema3E (fig. 6A, B og C). Immunblotting viste også, at Sema3E ekspression korrelerede med phosphoryleret ERK1 /ERK2 udtryk, som mindskes ved PD98059 behandling (fig. 6D). Disse undersøgelser tyder på, at PI3K og ERK /MAPK er de vigtigste intracellulære signalsystemer komponenter transducerende Sema3E /plexin-D1 medieret Snail1 nukleare translokation.

A, Cell transwell invasion assay af P0-3E-

1 celler afslører et signifikant fald i vandrende celleaktivitet efter farmakologisk inhibering af PI3-kinase (LY294002, eller wortmannin) og ERK /MAPK (PD98059), men ikke p38 mitogenaktiveret proteinkinase (SB203580), PKC (GF109203X), eller Jun N-terminal kinase ( SP600125). Scale bar, 30 um. **,

P

0,01, *,

P

0,05, parret

t

-test.