PLoS ONE: Non-Toxic Metabolic Forvaltning af metastatisk kræft i VM Mus: Novel Kombination af ketogen diæt, keton Supplering og Hyperbaric Oxygen Therapy

Abstrakt

Warburg effekten og tumor hypoxi ligger til grund for en unik kræft metaboliske fænotype kendetegnet ved glucose afhængighed og aerob fermentering. Vi har tidligere vist, at to ikke-toksiske metaboliske terapier – ketogenic diæt med sideløbende hyperbar oxygen (KD + HBOT) og kosten keton tilskud – kunne øge overlevelsestiden i VM-M3 musemodel af metastatisk cancer. Vi antager, at kombinere disse terapier kunne give en endnu større terapeutisk fordel i denne model. Mus, der modtog kombinationsterapien viste en markant reduktion i tumor vækst og metastatisk spredning, og levede dobbelt så lang som kontroldyr. For yderligere at forstå virkningerne af disse metaboliske behandlinger, vi karakteriseret virkningerne af høj glukose (kontrol), lav glukose (LG), keton tilskud (βHB), hyperbar oxygen (HBOT) eller kombinationsbehandling (LG + βHB + HBOT) på VM-M3-celler. Individuelt og kombineret, disse metaboliske behandlinger faldt betydeligt VM-M3 celleproliferation og levedygtighed. HBOT, alene eller i kombination med LG og βHB, forøget ROS-produktion i VM-M3-celler. Denne undersøgelse støtter kraftigt yderligere undersøgelse af denne metaboliske terapi som en potentiel giftfri behandling for sene metastatisk kræft

Henvisning:. Poff AM, Ward N, Seyfried TN, Arnold P, D’Agostino DP (2015 ) Non-Toxic Metabolic forvaltning af metastatisk kræft i VM Mus: Novel Kombination af ketogen diæt, keton Supplering og hyperbar oxygenbehandling. PLoS ONE 10 (6): e0127407. doi: 10,1371 /journal.pone.0127407

Academic Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: Juni 4, 2014, Accepteret: 14. april, 2015; Udgivet: 10 juni 2015

Copyright: © 2015 Poff et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. patent 12B152PRWO; University of South Florida; DP D’Agostino, A. Poff, P. Arnold, “Målretning kræft med metabolisk terapi og hyperbar ilt.” P. Arnold (Savind Inc.) har modtaget økonomisk støtte (ONR N000140910244) fra D. D’Agostino (USF) til syntetisere ketonestere. de øvrige forfattere har ingen interessekonflikter. Midler til dette projekt blev støttet delvist af en velgørende bidrag fra Scivation, Inc .; dog havde virksomheden ingen indflydelse studiedesign, dataindsamling, analyse, eller fortolkning af resultater . de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. patent 12B152PRWO, University of South Florida, DP D’Agostino, A. Poff P. Arnold, “Målretning kræft med metabolisk terapi og hyperbar ilt.” P. Arnold (Savind Inc.) har modtaget økonomisk støtte (ONR N000140910244) fra D. D’Agostino (USF) til at syntetisere ketonestere. De øvrige forfattere har ingen interessekonflikter. Forfatter (P. Arnold) tilhørsforhold med Savind Inc. og finansiering støtte fra Scivation, betyder Inc. ikke ændre forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft udviser en dysreguleret metabolisk fænotype karakteriseret ved lactat fermentering i nærvær af oxygen, et fænomen kendt som Warburg virkning [1]. Interessen for kræft stofskifte er steget i det seneste årti, med forskere tyder mange årsager og konsekvenser af Warburg effekten, og undersøge nye terapeutiske strategier for at udnytte det [1-5]. Glucose afhængighed og laktat produktion, to centrale funktioner i Warburg effekten, korrelerer stærkt med aggressiv kapacitet og invasive potentiale [3, 4, 6, 7]. Metastase eller spredning af tumorceller fra en primær websted til distale væv, er ansvarlig for over 90 procent af cancer-relaterede dødsfald. Der er ingen behandlinger mod kræft øjeblikket er til rådighed, der effektivt kan håndtere systemiske metastaser. Da Warburg effekten er en fremtrædende fænotype i metastatiske celler, metaboliske behandlinger, som udnytter dette fænomen kan tilbyde nye behandlingsmuligheder for patienter med aggressive eller sene stadier kræftformer.

glycolytiske-afhængighed forbundet med Warburg effekten har ført forskere at undersøge diætetiske behandlinger, der mindsker glucosetilgængelighed til tumoren. Ketogenic diæt (KD) er et højt fedtindhold, passende protein, meget lav kulhydrat kost, som er blevet anvendt i prækliniske og kliniske undersøgelser til at bremse udviklingen af ​​kræft [8-21]. KD tvinger en fysiologisk skift til fedtstofskiftet, gende blodsukkeret, undertrykke insulin, og opløftende blod keton niveauer ved at stimulere ketogenese fra kosten og lagrede fedt. Selvom de anti-cancer effekter af KD stort set tilskrives en reduktion i den glycolytiske substrater og insulin signalering som kræft brændstof metabolisme, ny dokumentation tyder på, at ketoner har en terapeutisk potentiale i deres egen [17, 22, 23]. Mens raske celler let tilpasse sig ketoner som en effektiv energi substrat, mange kræftformer er ikke i stand til at gøre denne tilpasning [24, 25].

udtryk for keton udnyttelse enzymer er ofte reduceret i maligne kræftformer i forhold til deres normale væv modstykker [26, 27]. I modsætning til raske neuroner, ketoner undlader at redde gliomceller fra glucose deprivation-induceret død [28]. Vi har for nylig beskrevet dette fænomen og undersøgt den potentielle anvendelse af kosten keton tilskud i en musemodel af metastatisk kræft [22]. Vores undersøgelse viste, at eksogen keton tilskud udøver potente anti-cancer effekter

in vivo

, selv når det administreres med en høj kulhydrat diæt, med lignende virkninger på kræftceller i tilstedeværelsen af ​​høje glucose medier

in vitro

[22].

Cellular energi metabolisme er uløseligt knyttet til iltning status af vævet [29, 30]. Når oxygen er let tilgængelige, normale celler producere op til 90 procent af deres ATP ved mitochondrial respiration. Når oxygen tilgængelighed bliver begrænset, såsom i udøvelsen muskel, celler konvertere til gennem anaerob fermentering at bevare ATP-produktion. Denne metaboliske switch opretholder cellulær funktion og fremmer overlevelse i lyset af forbigående hypoxi, og dens mekanisme er i vid udstrækning drevet af HIF-1 transkriptionsfaktor [30, 31]. HIF-1 øger ekspressionen af ​​over 60 gener, hvoraf mange involveret i glycolyse og gæring, angiogenese, vækst og overlevelse [30, 32]. Den afvigende signalering, der driver tumorangiogenese skaber umodne og utætte blodkar, som er ude af stand til på passende perfusion hele tumoren [33]. Dette fører til dannelsen af ​​hypoksiske områder inde i tumoren som øger Warburg effekten og fremme udviklingen af ​​kræft, invasion og metastase [33-35]. Tumor hypoxi og HIF-1-signalering er begge stærkt korrelere med aggressiv kapacitet og dårlig prognose [36]. Tumor hypoxi er også kendt for at mægle nogle kemo- og radio-resistens [37-40]. Fordi disse terapier arbejde i stor del ved at stimulere overproduktion af reaktive oxygenarter (ROS) i tumoren, begrænset tilgængelighed oxygen mindsker deres effektivitet [41, 42].

hyperbar oxygenbehandling (HBOT) er administrationen af 100% oxygen ved forhøjet tryk.

In vivo

, HBOT mætter blodplasma med ilt, som gør det muligt at diffundere længere ind i væv og oxygenat hypoxiske tumor regioner [43-45]. Tilsvarende HBOT øger ilt diffusion i celler i kultur og dermed dens virkninger kan let evalueres i

in vitro

miljø. HBOT er blevet vist at inhibere angiogenese og tumorvækst og øge overlevelsestiden som en stand-alone eller adjuvans terapi til standardbehandling i en række forskellige celle, dyr, og humane undersøgelser [46-52]. Vi har tidligere vist, at det ketogen diæt med sideløbende hyperbar iltbehandling var en effektiv kombinationsbehandling mod metastatisk cancer [9].

ketogen diæt, keton tilskud, og HBOT mål overlappende metaboliske veje, som er særligt fremtrædende i metastatiske celler . Vi antager, at kombinere disse tre metaboliske behandlinger kunne give en sikker, omkostningseffektiv adjuverende behandling for metastatisk cancer. Vi testede denne hypotese

in vivo

in vitro

hjælp af VM-M3 musemodel af metastatisk cancer [9, 22, 53].

Materialer og metoder

Cell kultur

VM-M3 /Fluc celler (VM-M3) blev erhvervet som en gave fra T. Seyfried af Boston College, hvor de blev indhentet fra en spontan hjernetumor i en VM /Dk indavlede mus, tilpasset cellekultur og transduceret med et lentivirus vektor indeholdende ildflueluciferase under kontrol af cytomegalovirus-promotoren som tidligere beskrevet [53]. VM-M3 celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (Gibco, Life Technologies) med 5 mM L-glutamin (ATCC), 10% føtalt bovint serum (Invitrogen), 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen), 10 mM HEPES puffer (Gibco, Life Technologies), og high glucose (25 mM D-glucose; Fisher Scientific). Celler blev holdt i en fugtig inkubator ved 37 ° C i 95% luft og 5% CO

2.

modtog Mus Salg

ynglende par af VM /Dk indavlede stamme af mus som en gave fra T. Seyfried af Boston College, og blev brugt til at etablere og udbrede en mus koloni i University of South Florida Morsani College of Medicine Vivarium henhold til standard dyrehold protokol. Hanmus (8-20 uger gamle) blev anvendt i den beskrevne undersøgelse. Alle procedurer blev godkendt af University of South Florida Institutional Animal Care og brug Udvalg (USF IACUC; Protokol nummer R4137) og udføres under streng overholdelse af NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr

VM-. M3 Cell Implantation

Ca. 1 million VM-M3-celler i 300 pi sterilt PBS blev implanteret subkutant i den laterale abdominale flanke af VM /Dk-mus under anvendelse af en 27 g nål som beskrevet tidligere [9]. VM-M3 celle podning fra dette websted resulterer i hurtig og systemisk metastaser [9].

Dietary Administration

Dyr blev randomiseret til en studiegruppe og begyndte at modtage deres respektive kostvaner på dagen for tumorinokulation for at maksimere det terapeutiske vindue i det stærkt aggressive VM-M3 model. Forud for den første dag i undersøgelsen blev alle mus fastet natten over for at fremme en hurtig overholdelse af protokollen kosten. Kontroldyr fik standard-gnaverfoder (2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet, Harlan)

ad libitum

for varigheden af ​​undersøgelsen. KD + HBOT mus modtog KD-USF, en brugerdefineret ketogen diæt designet af forfatterne og produceret af Harlan Laboratories, fodres

ad libitum

. KD + KE og KD + KE + HBOT mus fik KD-USF blandet med KE til 10% efter volumen med 1% saccharin for velsmag. KE blev syntetiseret i samarbejde med Patrick Arnold (Savind Inc., Seymour, IL) som tidligere beskrevet [54]. Den makronæringsstoffer profil og kalorietæthed af SD, KD-USF, og KE er vist i tabel 1. Alle blandinger blev monitoreret kontinuerligt og erstattet to gange om ugen eller efter behov for at bevare friskheden for varigheden af ​​undersøgelsen.

hyperbar oxygenbehandling

KD + KE + HBOT mus modtog 90 minutters oxygenovertrykskramper sessioner af 100% O

2 på 2,5 ATA (1,5 ATM gauge) tre gange om ugen (M, W, F) i en standard trykkammer (model 1300B, Sechrist Industries) under hele undersøgelsen. KD + KE + HBOT modtaget deres første HBOT session 24 timer efter tumorcelleinokulering.

Blod og Vægt Målinger

Blod (ca. 10 pi) er indsamlet én gang ugentligt fra halen ved hjælp IACUC-godkendt metoder. Blood glucose og β-hydroxybutyrat (βHB) blev målt ved hjælp af Precision Xtra Blood Glucose Keton Monitoring System (Abbott Laboratories). Mus blev vejet i midten af ​​eftermiddagen, to gange om ugen for varigheden af ​​undersøgelsen ved hjælp af AWS-1KG Portable Digital Scale (AWS).

selvlysende Imaging og Tumor Growth Analysis

Bioluminescens af luciferase-mærket VM-M3 celler

in vivo

blev erhvervet ved hjælp af IVIS Lumina afkølede CCD-kamera-system og Living Billede software (Caliper LS). Femten minutter før billeddannelse, mus modtog en i.p. injektion af 50 mg /kg D-Luciferin (Caliper LS). Hele dyret bioluminescerende signal (fotoner /sek) blev målt én gang om ugen som en indikator for metastatisk tumor størrelse og spredning. Tumor tage og metastatisk spredning blev bekræftet i alle dyr inden for 14 dage efter VM-M3 celleinokulering af selvlysende billeddannelse.

In vivo

bioluminiscerende signal (fotoner /sek) af vigtige metastatisk regioner (hjerne, lunger, og lever) blev målt som en indikator for metastatisk tumor byrde og spredt på 21 dage efter inokulering i overlevelse undersøgelse dyr [43 , 55]. Omfanget af metastatisk spredning blev yderligere analyseret i en separat gruppe af kontrol- og kombinationsterapi behandlede dyr med

ex vivo

orgel bioluminiscerende billeddannelse. Dyr blev inokuleret med VM-M3-celler, behandlet i 21 dage, og humant aflivet. Væv blev høstet og placeret i en petriskål indeholdende 300 ug /ml luciferin i steril PBS i 5 minutter forud for erhvervelse af selvlysende signal.

Survival Analysis

Fysisk og adfærdsmæssige sundhed musene var vurderet dagligt igennem studiet. Musene blev humant aflivet ved CO

2 kvælning efter godkendte IACUC retningslinjer upon præsentation af definerede kriterier forbundet med sygdomsprogression (unormal fodring adfærd, tumor-associerede ascites, nedsat respons på stimuli, manglende trivsel).

Immunohistokemisk analyse af tumorvaskularisering

Efter 21 dages behandling, dyr i den førnævnte 3-ugers behandling studiet blev humant aflivet og levere blev høstet og konserveret i 10% neutral, phosphatpufret formalin. Leveren væv blev paraffinindlejrede, skåret i 5 mikron sektioner, og monteret på objektglas på USF Morsani College of Medicine Histologi Core. Et sæt dias blev farvet med hæmatoxylin og eosin og monteres med dækglas til morfologisk analyse. Et andet sæt objektglas blev probet for endotelcelle markør CD31 at visualisere blodkar. Objektglas blev rehydreret gennem en række xylen og ethanol vaske, og antigen blev hentet af en standard varme-medieret citratpuffer metode. Slides blev inkuberet i 0,3% H

2O

2 i dH

2O at inhibere endogen peroxid aktivitet. Immunohistokemisk analyse af objektglassene blev udført under anvendelse af Vectastain Elite ABC kit. Objektglas blev blokeret i 30 minutter i normal blokering serum og derefter inkuberet i anti-CD31-antistof (1:25; ab28364, Abcam) i en time ved stuetemperatur. Objektglas blev derefter inkuberet i biotinyleret anti-kanin sekundært antistof i normalt blokeringsserum i 30 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af Vectastain ABC reagens indeholdende avidin og biotinyleret peberrodsperoxidase opløsningen i 30 minutter ved stuetemperatur. Objektglas blev udviklet under anvendelse af vektoren NovaRED peroxidase (HRP) Substrate Kit. Objektglas blev modfarvet med hematoxylin, vasket, monteret med dækglas, og visualiseret med lysmikroskopi. Mindst 3 rammer indeholdende tumorvæv per prøve blev analyseret. Antallet af CD31

+ blodkar forbundet med tumorer i hver ramme blev optalt og sammenlignet mellem kontrol og behandlede grupper som et mål for tumor vaskularisering.

VM-M3 Cell Proliferation

50.000 VM-M3-celler blev udpladet i 35 mm plader med 6 brønde i 1 ml høj glucose medier (kontrol; 25 mM) eller lav glucose medier (LG; 3 mM) med eller uden daglig HBO behandlinger (HBOT; 100% O

2 , 90 min, 2,5 ATA). En kombinationsbehandling gruppe fik lav glukose, keton tilskud (5 mM βHB), og daglige HBO-behandlinger (LG + βHB + HBOT). Disse undersøgelser blev udført i tandem med arbejde undersøge virkningen af ​​keton tilskud på VM-M3-celleproliferation; derfor, 25mm og 3 mM glucose spredning kurver præsenteret er de samme som tidligere rapporteret [22]. Celler blev dyrket i 24, 48, 72 og 96 timer for at bestemme en vækstkurve. Medier blev udskiftet i alle behandlinger efter 48 timer, og hvert tidspunkt og behandlingsgruppe blev kørt tredobbelt. Celler blev skrabet og talt under anvendelse af standard trypanblåt hæmocytometriske. Plader blev visuelt inspiceres for at sikre, at alle celler blev høstet før tælling.

VM-M3 Cell levedygtighed

Levedygtighed blev vurderet med LIVE /DEAD Levedygtighed /cytotoksicitet Kit (Invitrogen). 50.000 VM-M3-celler blev udpladet i 22 mm plader med 12 brønde indeholdende Poly-D-lysin overtrukne dækglas (BrainBits) i 1 ml kontrolmedium og lodes vokse i 24 timer. På 24 timer blev celler administreret behandling: høj glukose medier (kontrol 25 mM), lav glukose medier (LG, 3 mM), kontrol medier (25 mM glucose) med en enkelt session af hyperbar oxygen (HBOT; 100% O

2 , 90 min, 2,5 ATA), eller kombinationen terapi af lav glucose, keton kosttilskud (5 mM βHB), og en enkelt session af hyperbar oxygen (LG + βHB + HBOT). Disse undersøgelser blev udført i tandem med arbejde undersøger effekten af ​​keton tilskud på VM-M3 cellelevedygtighed; derfor, levedygtighed data 25 mM og βHB er de samme som tidligere rapporteret og er vist her som reference [22]. Efter 48 timer blev cellerne skyllet med D-PBS og inkuberet i 2 uM calcein AM (Ex /Em: 495/515) og 4 um EthD-1 (Ex /Em: 525/590) i D-PBS i 30 minutter ved 37 ° C. Dækglas blev vendt, monteret og forseglet på et objektglas, og cellerne blev visualiseret med et Nikon TE200E anvendelse af fluorescens konfokal mikroskopi med FIT-C og TRIT-C-filtre for at identificere levende og døde celler. Behandlinger blev kørt tredobbelt. Antallet af levende og døde celler blev talt i 10 billeder pr dækglas under anvendelse af et 10x objektiv til at bestemme procent levedygtighed.

VM-M3 Cell ROS Detection

50.000 VM-M3-celler blev udpladet i 35 mm poly-D-lysin belagt glas FluoroDish vævskulturskåle (World Precision Instruments) i 1 ml kontrolmedium og lodes vokse i 24 timer. På 24 timer blev celle administreret behandling: medier blev erstattet med høj glukose medier (kontrol 25 mM), lav glukose medier (LG, 3 mM), kontrol medier med keton tilskud (βHB, 5 mM βHB), kontrol medier med en enkelt session af hyperbar oxygen (HBOT; 100% O2, 90 min, 2,5 ATA) eller kombinationsbehandling (LG + βHB + HBOT). Efter 48 timer blev cellerne inkuberet i 10 pM DHE (Ex /Em:. I CSF i 30 min ved 37 ° C, og superoxidproduktion blev målt ved anvendelse af fluorescens konfokal mikroskopi med en TRIT-C-filter som tidligere beskrevet [56] Behandlingerne blev kørt i kopiere. Superoxid produktion blev målt ved at beregne gennemsnittet af fluorescensintensiteten (FIU) per celle i 10 billeder pr prøve ved hjælp af en 10x objektiv.

Statistik

Overlevelse blev analyseret med Kaplan -Meier og log-rank Mantel-Cox test for overlevelse distribution. Cellelevedygtighed og tumorvaskularisering blev analyseret ved uparret t-test. Bioluminescent signal blev analyseret ved Wilcoxon Rank Sum. Cellelevedygtighed, celleproliferation, gennemsnitlige overlevelsestid, blodglucose og βHB og procent kropsvægt ændring blev analyseret ved envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligning test post hoc Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 6 software Resultaterne blev betragtet som signifikante, når p … .05 data for dette studie er tilgængelig som supplerende oplysninger (S3 File).

Resultater

Metabolic terapi forsinker tumorvækst, hæmmer metastatisk spredning og tumor vaskularisering, og forlænger overlevelsen tid i mus med metastatisk kræft

selvlysende billedbehandling viste en tendens til nedsat tumorvæksthastighed og metastatisk spredning hos behandlede dyr sammenlignet med kontroller i løbet af undersøgelsen (figur 1 og 2). Tumor bioluminescens var under påviselig tærskel i flere KD + KE + HBOT mus ved 3 uger (Fig 1). Tumor tage og spredning fra stedet for inokulering blev observeret med bioluminescerende billeddannelse i alle mus på dag 14, hvilket indikerer, at disse metaboliske terapier ikke forlænge overlevelsen simpelthen ved at forebygge tumordannelse. Imidlertid blev tumor bioluminescens faldet i de triple-behandlede mus sammenlignet med kontrolgruppen ved uge 1 og 2, hvilket antyder, at det fysiologiske miljø induceret af vores metaboliske terapi var mindre befordrende for tumorvækst og kan have bremset væksten af ​​den primære tumor samt metastatisk sprede. KD + KE + HBOT behandlede mus udviste mindre samlet tumor byrde målt med total selvlysende signal end kontrollen ved alle gældende tidspunkter (uger 1, 2, og 3, fig 1). KD + KE + HBOT behandlede mus udviste også mindre samlet tumorbelastning end KD mus i uge 3 og 5 og KD + KE mus i uge 1, 2, 3, og 5 (figur 1). 3 uger efter VM-M3 celleinokulering, KD + KE + HBOT behandlede mus havde en signifikant mindre samlet tumorbyrde og mindre metastatisk spredning til hjernen, lunger, lever, nyrer, milt og fedtvæv sammenlignet med kontrolmus (** * p 0,001, en-vejs ANOVA, fig 1). KD, KD + KE, og KD + KE + HBOT mus viste signifikant forlænget overlevelse kurver sammenlignet med kontroldyr (p = 0,03, p = 0,009 og p 0,0001, log-rank Mantel-Cox test for overlevelse distributionen, Fig 3A) . KD behandling øgede gennemsnitlige overlevelsestid ved ca. 14 dage (44,6%), KD + KE behandling af cirka 20 dage (65,4%), og KD + KE + HBOT behandling ved ca. 32 dage (103,2%) sammenlignet med kontroller (* p 0,05; envejs ANOVA, fig 3B). Der var ingen signifikante forskelle i overlevelse mellem de tre behandlingsgrupper. Morfologisk og immunhistokemisk analyse af lever fra KD + KE + HBOT behandlede mus afslørede kun mikrometastatiske læsioner med lidt bemærkelsesværdige vaskularisering i forhold til kontrolgruppen (Fig 4). Blodsukker og kropsvægt faldt og blod βHB steg i mus, der modtog KD + KE terapi på dag 7, før igangsættelsen af ​​signifikant sygdomsprogression (figur 5).

(A)

In vivo

bioluminescens billeddannelse af repræsentative dyr fra hver behandlingsgruppe 3 uger efter inokulation af tumorcelle. Behandlede mus udviste reduceret tumorbyrde og metastatisk spredning. (B) Hele dyr bioluminescens (fotoner /sek) blev sporet over tid som et mål for tumor vækst. For at undgå misvisende repræsentation af tumorbelastning, data for behandlingsgrupper hvor ≥50% af dyrene var bukket under for sygdomsprogression ikke længere vist. Tumor bioluminescens var meget varierende, men behandlede dyr viste en bemærkelsesværdig tendens til langsommere tumorvækst i forhold til kontrol i hele undersøgelsen. KD behandlede mus havde mindre bioluminescens end kontrol i uge 2, mens KD + KE + HBOT mus havde mindre bioluminescens end kontroldyr på ugen 1, 2, og 3. KD + KE + HBOT mus havde også mindre bioluminescens end KD + KE mus ved uge 1, 2, 3, og 5 og havde mindre tumor bioluminescens end KD-mus ved uge 3 og 5. Fejlsøjler repræsenterer ± SEM. Resultaterne blev betragtet som signifikante, når p. 0,05

(A)

In vivo

bioluminescens af centrale metastatiske regioner 21 dage efter tumorcelleinokulering viste en markant reduktion i metastatisk tumor byrde og spredning for behandlede dyr. KD + KE + HBOT mus havde betydeligt mindre metastatisk spredning til hjernen, lunger og lever i forhold til kontrollen ved 3 uger. Der var ingen signifikante forskelle i metastatisk spredning mellem de tre behandlingsgrupper. (B-C) at sikre en mere følsom måling af metastatisk spredning i vores multi-kombinationsbehandling, blev en separat gruppe af kontrol og KD + KE + HBOT behandlede dyr behandlet i 21 dage efter tumorcelleinokulering og aflives.

Ex vivo

bioluminescerende billeddannelse af høstede organer bekræftet et signifikant fald i metastatisk tumor byrde og spredes i kombination behandlede dyr sammenlignet med kontroller. Alle organer testede-hjerne, nyrer, milt, lunger, fedtvæv og lever-udstillet væsentligt reduceret selvlysende signal i forhold til kontroller. Fejl- søjler repræsenterer ± SEM. Resultaterne blev betragtet som signifikante, når p. 0,05

(A) Kaplan-Meier overlevelse kurve af studiegrupper. KD, KD + KE, og KD + KE + HBOT behandlede mus viste forlænget overlevelse sammenlignet med kontroller (p = 0,03, p = 0,009 og p 0,0001, henholdsvis; log-rank Mantel-Cox test for overlevelse distribution). Der var en stærk tendens til mere langvarig overlevelse i kombinationsbehandlingen mus sammenlignet med KD eller KD + KE, men disse kurver var ikke signifikant forskellige fra hinanden (KD vs. KD + KE + HBOT p = 0,0622; KD + KE vs. KD + KE + HBOT p = 0,1924; log-rank Mantel-Cox test). (B) Cohort størrelse (N), gennemsnitlige overlevelsestid (dage), og procent stigning i den gennemsnitlige overlevelsestid fra kontrol. KD, KD + KE, og KD + KE + HBOT behandlede mus udviste en 44,6%, 65,4%, og 103,2% stigning i den gennemsnitlige overlevelsestid i forhold til kontrolgruppen, henholdsvis (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001; One-Way ANOVA). Svarende til overlevelse kurve analyse, var der en tendens til øget gennemsnitlige overlevelsestid i kombination behandlede mus i forhold til KD og KD + KE, men disse forskelle var ikke signifikante (KD vs. KD + KE + HBOT p = 0,1062; KD + KE vs. KD + KE + HBOT p = 0,2763). Resultaterne blev betragtet som signifikante, når p. 0,05

Morfologi og vaskularisering af KD + KE + HBOT-behandlede mus levertumorer blev analyseret med H 0,05; uparret t-test) . Fejl søjler repræsenterer ± SEM.

(AC) KD + KE behandlede mus havde signifikant nedsat blodsukker og kropsvægt og øget blod βHB forhold til at styre mus ved dag 7. Blodsukker blev signifikant reduceret kun i KD + KE behandlede mus ved dag 7. Både KD + KE og KD + KE + HBOT behandlede mus udviste forhøjet βHB forhold til at styre og KD behandlede mus ved dag 7. Kun KD + KE mus havde en signifikant reduktion i kropsvægt om dagen 7. (D) Kun KD + KE-mus viste en signifikant og ensartet fald i kropsvægt i løbet af undersøgelsen. Resultaterne blev betragtet som signifikante, når p 0,05. Fejl søjler repræsenterer ± SEM.

Metabolic terapi nedsætter spredning og levedygtighed og øge ROS produktion i VM-M3 celler

spredning af VM-M3 celler var signifikant hæmmet ved at nedsætte glukosekoncentrationen af dyrkningsmediet og ved indgivelse HBOT (fig 6A). Vi har tidligere rapporteret en lignende reaktion i VM-M3-celler med βHB tilskud til varieret glucosekoncentration [22]. Kombinere LG, βHB, og HBOT fremkaldte potente anti-proliferative effekter

in vitro

(Fig 6B). Celler modtager denne kombinationsterapi delt meget langsomt, med en markant signifikant fald i celledensitet sammenlignet med kontroller på alle testede tidspunkter (* p 0,05, envejs ANOVA, Fig 6B). Ved 24 og 48 timer, vækstrate var signifikant lavere i LG + HBOT celler end i kontrolgruppen celler. Vækstrate var også betydeligt langsommere i LG + βHB + HBOT celler end i LG celler. Forskellene i proliferationshastighed mellem grupperne blev mere tydelig med tiden, således at ved 72 timer, proliferationshastigheden af ​​alle behandlingsgrupper afveg signifikant fra hinanden med undtagelse af LG versus LG + HBOT, og efter 96 timer, afveg alle grupper med undtagelse af LG versus LG + HBOT. Der var en lignende effekt af metabolisk terapi på VM-M3 cellelevedygtighed. Levedygtighed var 19% mindre i LG-gruppen end i kontrolgruppen ved 24 timer behandling (* p 0,05, envejs ANOVA, fig 7). Vi har tidligere rapporteret en lignende effekt i VM-M3 celler behandlet med βHB tilskud [22]. Selvom HBOT ikke reducerede levedygtigheden af ​​sig selv, når det administreres med LG og βHB, denne kombinationsterapi signifikant nedsat levedygtighed ved ca. 38%. (*** P 0,001, en-vejs ANOVA, fig 7). VM-M3 celle superoxid-produktion blev signifikant forøget med HBOT, både alene og i kombination med LG + βHB (*** p 0,001, en-vejs ANOVA, Fig 8).

VM-M3 celler blev dyrket i forhold efterligner metabolisk terapi, herunder kombinationer af varieret glukose-koncentration (25 mM, 15 mM, eller 3 mm) medier, keton tilskud (5 mM βHB), og daglige HBOT sessioner (100% O

2, 2,5 ATA, 90 min). Celle densitet blev målt med trypanblåt hæmocytometriske at frembringe en vækstkurve over 96 timer. (A) Proliferation af VM-M3-celler blev inhiberet med aftagende glukosekoncentrationen og tilføjelsen af ​​HBOT. Efter 24 timer, celledensitet på 3 mM Glu og 3 mM Glu + HBOT celler var signifikant mindre end kontrol (25 mM) glucose behandlede celler. Efter 48, 72 og 96 timer blev celledensiteten af ​​alle behandlingsgrupper væsentligt reduceret sammenlignet med kontrol (* p 0,05; To-ANOVA). (B) at kombinere lav glukose, keton tilskud, og HBOT resulterede i et markant fald i celledeling som var signifikant fra kontrol på alle testede tidspunkter. (P 0,05; envejs ANOVA). Celler modtog kombinationsbehandling havde et signifikant fald i proliferation sammenlignet med celler behandlet med LG kun på 24, 48 og 72 timer, og sammenlignet med βHB kun ved 48, 72 og 96 timer og udviste en ikke-signifikant tendens til nedsat proliferation i forhold til LG + HBOT behandlede celler for varigheden af ​​vækstkurven. Resultaterne blev betragtet som signifikante, når p 0,05. Fejl søjler repræsenterer ± SEM

VM-M3 celler blev behandlet med høj (kontrol 25 mM). Eller lav (LG, 3 mM) glukose i 24 timer, med eller uden 5 mM βHB eller en session af HBOT . Levedygtighed blev målt med calcein AM og EthD-1 fluorescensmikroskopi. (A-B) βHB, LG, og LG + βHB + HBOT behandling faldt levedygtighed sammenlignet med kontrol og HBOT behandlede celler. LG + βHB + HBOT cellelevedygtighed var signifikant faldet i forhold til βHB men ikke LG behandlede celler. Resultaterne blev betragtet som signifikante, når p 0,05. Fejl søjler repræsenterer ± SEM

(A-B) VM-M3 celler blev behandlet i 24 timer med individuelle eller kombination metaboliske behandlinger:. LG, βHB, HBOT, eller LG + βHB + HBOT. Superoxidproduktion blev målt med DHE fluorescensmikroskopi og var signifikant forøget med HBOT alene eller i kombination med LG + βHB. Resultaterne blev betragtet som signifikante, når p 0,05. Fejl søjler repræsenterer ± SEM.

Diskussion

Metastase er fortsat den største hindring i at identificere effektive behandlinger for den langsigtede forvaltning af kræft. En mangel på dyremodeller, der afspejler den metastatiske fænotype forhindrer store forbedringer i patientpleje.