PLoS ONE: siRNA Knockdown af ribosomprotein Gene RPL19 ophæver den Aggressiv Fænotype for Human prostatakræft

abstrakt

Vi tilvejebringe nye funktionelle data, posttranskriptionel lyddæmpning af gen

RPL19

bruge RNAi ikke alene ophæver den maligne fænotype af PC-3M prostatacancerceller men er selektiv med hensyn til transskription og oversættelse af andre gener. Reduktion

RPL19

transkription modulerer en delmængde af gener, fremgår af genekspression array analyse og Western blotting, men ikke bringer celleproliferation eller apoptose

in vitro

. Men væksten i xenotransplanterede tumorer indeholder det bankede ned

RPL19 in vivo

reduceres væsentligt. Analyse af de modulerede gener afslører induktion af ikke-maligne fænotype hovedsagelig at involvere forstyrrelse af netværk af transkriptionsfaktorer og cellulær adhæsion gener. Dataene dokumentere, at ekstra-ribosomale regulatoriske funktioner af

RPL19

, ud over proteinsyntese, er kritiske regulatorer af cellulære fænotype. Målretning centrale medlemmer af berørte netværk identificeret ved genekspression analyse hæver muligheden for terapeutisk stabilisere en godartet fænotype genereret ved at modulere ekspressionen af ​​en individuel gen og derefter begrænse en malign fænotype mens ikke-maligne væv upåvirket.

Henvisning : Bee A, Brewer D, Beesley C, Dodson A, Forootan S, Dickinson T, et al. (2011) siRNA Knockdown af ribosomprotein Gene

RPL19

ophæver den Aggressiv Fænotype for Human prostatakræft. PLoS ONE 6 (7): e22672. doi: 10,1371 /journal.pone.0022672

Redaktør: Steven R. Ellis, University of Louisville, USA

Modtaget: Januar 18, 2011; Accepteret: 4 Juli 2011; Udgivet: Juli 22, 2011

Copyright: © 2011 Bee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af North West Cancer Research Fund (UK), Cancer Research-UK, National Cancer Research Institute (MRC-UK), et specialiseret program for forskning Excellence (SPORE) bevilling fra US National Cancer Institute (USA), Grand Velgørenhed af Freemasons, Rosetrees Trust, Bob Champion Cancer Trust, The Orchid Appeal og David Koch Foundation. Finansieringsorganer havde nogen andel i udformningen og gennemførelse af undersøgelsen, i indsamling, analyse og fortolkning af data, eller forberedelse, gennemgang og godkendelse af papiret

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at ingen eksisterer konkurrerende interesser.

Indledning

Ribosomale proteiner (RPS) omfatter en kompleks super-familien af ​​proteiner [1] højt konserverede hele evolutionen, hvilket indikerer deres funktionelle betydning levende organismer [2]. Denne påstand understøttes af antallet af RP pseudogener og genduplikationer sammen med delte områder af identitet mellem homologe proteiner i prokaryoter og eukaryoter [3]. Eukaryote ribosomer indeholder cirka 80 RP’er sammen med fire ribosomale RNA (rRNA) og kræver omkring 150 ikke-ribosomale faktorer til at blive organiseret i deres konstituerende lille (40S) og store (60S) underenheder [4]. I første omgang anset for at være involveret kun i proteinsyntese er visse RP’er anerkendt som pleiotropisk og at mægle en række ekstra-ribosomale regulerende funktioner [5], [6]. Sådanne RP’er, indbefatter L5 [7], L11 [8], L13 [9] og S7 [10]. I zebrafisk (

Danio rerio

) en stor rolle for RP’er som tumor-suppressorer er blevet demonstreret, hvorved mutation eller undertrykkelse i en af ​​flere RP gener svækker kontrol af p53, hvilket vil fremme malignitet [11], [12]. For nylig har begrebet “ribosomopathy” er blevet etableret, hvorved mutation af en særlig RP er patogen for en specifik sygdom [13]. Ca. 25% af tilfældene af Diamond-Blackfan anæmi er forårsaget af mutation af ribosomal proteingen

RPS19

mens i en anden 20%, forekommer mutationer i andre ribosomale protein-gener [14]. Øjeblikket, nogle 77 individuelle

RPS19

mutationer er blevet beskrevet [15]. Derudover har haploinsufficiency for ribosomale proteiner blevet vist i nogle tilfælde, at være en underliggende årsag til Diamond Blackfan anæmi [16].

I øjeblikket mekanismer vedrørende mutationer i RP gener til cancer forbliver ukendt [17]. For det proksimale lange arm af kromosom 17, hvor

RPL19

gen er placeret (17q), store cancer-specifikke ændringer er blevet beskrevet. Disse omfatter amplifikationer og kopiere nummer ændringer, især dem i regionen, der omfatter onkogen

ERBB2

, dannelse af isokromosom 17q, dobbeltarbejde, sletninger, mutationer og andre genomiske omlejringer. Tidligere [18], identificerede vi forbedret udtryk for

RPL19

mRNA i prostata cellelinier og væv til at korrelere med en aggressiv maligne fænotype. Da forhøjede

RPL19

mRNA forekom som en af ​​en relativt lille antal sekvenser over-udtrykt i prostatacancer, vi hypotese, at dets effekt var sandsynligvis at være selektiv snarere end en del af en global non-specifik forhøjelse i genekspression . Ribosomprotein L19E (RPL19) tilhører L19E super-familien af ​​proteiner og, i eukaryoter, er en bestanddel af det ribosomale store 60S underenhed. Genet udtrykkes i store dele af evolution, især i eukaryoter og archaea men er fraværende fra bakterier [19], [20] selv om der er homologi mellem sekvenser i rotte L19 og

E.coli

ribosomale proteiner L18, L30 og S2 [21] overraskende for sådan en tilsyneladende vigtigt gen,

RPL19

har hidtil fået lidt opmærksomhed. Hos mennesker,

RPL19

kort på kromosom 17 ved 17q11.2-Q12, hvor det koder 9 potentielle splejsningsvarianter. I en række menneskelige brystkræft biopsier,

RPL19

er blevet rapporteret som værende udtryk og co-forstærket sammen med

ERBB2

og gener

PNMT

,

PSMB3

og

NR1D1

[22]. Dette kompleks region, der indeholder flere gener er blevet foreslået som en mulig amplikon [23], [24], der strækker sig for nogle ~547 kb fra

RPL19

gennem

STRAD3

ERBB2

til

GRB7

i regionen 17q11.2-Q12. I øjeblikket er der ikke data dokumenteret denne spekulation. I prostatacancer, amplifikation af erbB2 er sjældne, der rapporteres i kun 0,04% [25] til 2% [26] af tilfældene, og derfor ikke en fælles mekanisme for RPL19 overekspression. Da vores indledende identifikation af RPL19 i prostatacancer [18], er dets ekspression blevet vist at definere dårlig prognose colorectal cancer [27], og som et hidtil ukendt tumorantigen i lunge adenocarcinom [28].

globale ændringer i gener moduleret i human prostatacancer er tidligere blevet profileret under anvendelse af DNA-ekspression array analyse [29], der har påvist ændringer i genekspression efter selektiv opregulering af individuelle målgener [30], [31] eller efter gen-knockdown anvendelse af antisense [32 ] eller RNAi [33] teknologi med efterfølgende omdannelse af den maligne fænotype. De differentielt udtrykte gener og deres tilknyttede netværk er blevet vurderet som biomarkører for adskillelse af forskellige prostatakræft fænotyper efter adfærd og respons på behandling [34]. Dog, et ændret niveau af genekspression ikke,

ipso facto

, bekræfter en primær rolle i den maligne proces. Genomisk ustabilitet er kendetegnende for malign transformation [35] og virkningerne af gevinst eller tab af et enkelt gen vil sandsynligvis blive transmitteret i hele genomet med den konsekvens, at ekspressionen af ​​andre gener bliver sekundært moduleret [36]. Sådanne ændringer enten kan have umiddelbar og aktiv relevans til den resulterende cellulære fænotype eller deres ændrede udtryk er passiv og ligegyldig. For at vurdere den funktionelle relevans af et bestemt gen, undertrykkelse af dens transkription tillader analyse af dens umiddelbare virkninger på hele genomet ekspression. Tidligere har vi transficerede maligne prostata-epitel PC-3M celler med et 436 bp lange antisense-oligonukleotid til knock-down ekspression af

FABP5

der lindres den maligne tumor fænotype både

in vitro

in vivo

[37]. heri, har vi ansat den mere kirurgiske teknik af RNA-interferens (RNAi) med potentielt større specificitet og effektivitet, afhængigt af den særlige gen bliver målrettet [38].

Vores tidligere data [18] viste, at ekspression af

RPL19

kunne være funktionelt vigtigt at fremme prostata malignitet. Vi har nu testet denne hypotese ved selektivt at reducere

RPL19

udtryk ved hjælp RNAi. De resulterende PC-3M celler udviser en ophævede maligne fænotype både

in vitro

in vivo

når indsendt til fænotypisk vurdering og genekspression analyse. Dataene understøtter muligheden for en funktionel rolle for

RPL19

, der handler inden et spektrum af ændret genekspression, i at bevare den maligne fænotype af humane prostatacancerceller. Bekræftelse af et sådant scenario ville tillade selektiv terapeutiske målretning af RPL19 enten immunologisk [28] eller ved hjælp af små molekyler, at modulere diskrete delmængder af cellulære proteiner, der er vigtige initiativtagerne til den maligne fænotype.

Resultater

siRNA knockdown af RPL19 i forældrenes PC-3M celler

Forbigående transfektion.

qPCR analyse af de parentale PC-3M celler med primere, der er defineret i tabel 1 viste stærk

RPL19

mRNA-ekspression, bekræftet ved nukleotidsekventering.

Derefter forbigående transfektion af siRNA-sekvenser til

RPL19

exon 1 (tabel 2) afslørede Target # 1 for at være den mest effektive sekvens for RNA silencing, reducere dets ekspression til kun 7% af det oprindelige niveau (figur 1A). Mens de andre sekvenser var effektive, kun kombinationen af ​​alle tre samtidigt var bedre end Target # 1, alene. Derefter blev Target # 1 anvendes til alle efterfølgende forsøg.

A. qPCR-analyse af

RPL19

ekspressionsniveauerne efter forbigående lyddæmpning af forskellige mål i PC-3M

forældrenes celler. Target # 1 (T1) var den mest effektive med kun 7% resterende niveau detekteres. Denne reduktion blev kun overgået af den samtidige kombination af T1 + T2 + T3. B. qPCR-analyse af

RPL19

ekspressionsniveauerne efter stabil lyddæmpning af Target 1 #. Disse data er indsamlet fra eksperimenter udført i triplikat. Målinger er relative til udtryk RPL19 i si-PC-3M

kapløbet celler. Komparative niveauer i benigne PNT2 celler er også vist. C. Morfologiske optrædener af (i) PC-3M

forældrenes celler og forskellige af de kolonier (ii-iv) efter stabil knockdown af

RPL19

. Nogle kolonier (II) var dårligt vedhæftende med størstedelen af ​​celler, der vokser i suspension. Andre (iii) indeholdt overvejende multinucleate former. De fleste (iv) omfattede celler, der var mindre end den parentale. Klon ST-3-celler, der anvendes i alle efterfølgende eksperimenter er vist i dette panel. (Forstørrelse x 200)

Stabil transfektion.

Niveauer af

RPL19

mRNA blev målt i PNT2, PC-3M

forældre-, PC -3

scramble og si-

RPL19-

PC-3M

target # 1 forbigående transfektantcellerne (Figur 1B). I overensstemmelse med den tidligere undersøgelse [33], til udtryk i PC-3M

kapløbet celler blev fastsat til enhed og relative udtryk i de andre cellelinier blev sammenlignet som fold-forskelle.

RPL19

ekspression i PC-3M var 4,9 gange større end for de PNT2 celler og i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser bekræftet ved Northern blot-analyse [18]. I si-

RPL19-

PC-3M

klon ST-3 transfektantcellerne, udtryk for

RPL19

blev reduceret til kun 1,3 gange større end de PNT2 celler. PC-3M

kapløbet celler viste en 2,3 gange reduktion i

RPL19

i forhold til PC-3M

forældre-, selv om denne værdi ikke var statistisk signifikant. Enkelt celle kloning [33] efterfulgt af qPCR og Western blotting bekræftede si-

RPL19-

PC-3M

klon ST-3 udtrykte det laveste niveau af

RPL19

mRNA og protein. Denne klon af celler derefter ansat til detaljeret fænotypisk analyse.

Vækst karakteristika af si-RPL19cells

in vitro

Kloner af transficeret si-

RPL19

-PC-3M celler dyrket under standardbetingelser udstillet forskelle i morfologi (figur 1C). Sammenlignet med PC-3M

forældrenes celler, Si-

RPL19

-PC-3M celler generelt mindre klæbende til underlaget. Disse celler opretholdt, en evne til at proliferere og kunne være succesfuldt sub-dyrket, selv om en stor del af cellerne forblev i suspension. Andre si-

RPL19

-PC-3M celler viste en stigning i multinucleate former, hvilket tyder på nedsat færdiggørelse af mitose. Proliferationsassays (figur 2A) viste, at i løbet af den logaritmiske vækstfase, satsen for celledeling ved si-

RPL19-

PC-3M

klon ST-3 transfektantcellerne blev ikke signifikant påvirket (

s

≥0.05) sammenlignet med PC-3M

forældre- og si-PC-3M

scramble. Evnen af ​​Si-

RPL19-

PC-3M

klon ST-3-celler at invadere en ekstracellulær collagenmatrix (ECM) blev sammenlignet med den for PNT2, PC-3M

forældre- og PC -3

scramble cellelinier (figur 2B). Antallet af celler, der invaderede gennem ECM var: (PNT2) 0,6 ± 0,6, (PC-3M

parental) 279 ± 33,7 og (PC-3M

scramble) 317 ± 28,3 (

s

0,001). Det si-

RPL19

-PC-3M celler udviste en relativt dårlige invasive potentiale på kun 60 ± 10,7 transmigrating celler (

s

0,001). Således tavshed

RPL19

reducerede den invasive potentiale PC-3M celler cirka 5 gange. Endogene (basale) niveauer af apoptose i PC-3M

forældre- og PC-3M

kapløbet celler (tabel 3 og figur 2C) var lig dem opnået under sammenlignelige studier af

PRKCZ

gen [33]. Basale niveauer af apoptose i de fire cellelinjer var ikke statistisk forskellige (

s

0,05). Selvom følsomheder af PC-3M

forældre- og si-

RPL19-

PC-3M

klon ST-3 celler til camptothecin blev ikke ændret, denne agent øget apoptose i PNT2 og PC-3M

kapløbet celler (

s

0,0001)

A.. Relativ vækst i celle-linjer i monolagskultur afslører ingen statistisk forskel i forekomsten af ​​spredning mellem de Knockdown celler (si-

RPL19

-PC-3M

klon ST-3), og at PC-3M

forældrenes celler. B. Invasion assay

in vitro

sammenligner de samme populationer af celler som dem der er vist i (A) og afslørende en 83% nedgang i den invasive kapacitet

RPL19

knockdown celler i forhold til PC -3

kapløbet celler. C. Resting niveauer af apoptotiske indeks var ikke signifikant forskellig i godartede (PNT2), forældrenes (PC-3M) eller knockdown celler. Efter udfordring ved camptothecin blev ingen ændring identificeret i PC-3M

forældrenes eller lyddæmpere

RPL19

-PC-3M

klon ST-3 celler. Mens en stigning i apoptose blev fundet i benigne celler og i kapløbet-transficerede celler, var disse ikke signifikant. D. Vækst af tumorceller

in vivo

af estimeret volumen afslørede en stærkt signifikant (

s

0,005) undertrykkelse af vækst ved to af de stabile transfektantkolonier kloner, i forhold til PC -3

forældre- og PC-3M

kapløbet celler. Vækst af PNT2 celler er ikke medtaget, da vi allerede har vist [33] væksten af ​​tumorer til at være sjældne, især over tidsrum af disse eksperimenter. E. Analyse af tumor vægte

in vivo

bekræftede kloner ST-1 og ST-3 for at generere tumorer signifikant (

s

0,005) mindre end PC-3M

forældrenes eller si-PC-3M

kapløbet celler. F. immunhistokemisk analyse af tumorer vokser som xenografter

in vivo

støttede mRNA niveauer data (figur 1B), at mens den oprindelige PC-3M

forældrekontrol (i) og si-PC-3M

scramble (ii) celler udtrykte RPL19 protein på højt niveau. Det si-

RPL19

-PC-3M

klon ST-3 celler (iii) udtrykte RPL19 heterogent og på kun et meget lavt niveau. (Forstørrelse x 350)

Tumorigenicitet og RPL19 proteinekspression

in vivo

I alle grupper af dyr, tumorer blev klart på dag 2 efter inokulering (tabel 4). Men mere dukkede op, før i PC-3M

forældrekontrol (3/8) og PC-3M

scramble (4/8) grupper. I de to transfektante klon grupper, tumorer tog længere tid at komme frem (2/8 tumorer hos dyr bærer si-

RPL19-

PC-3M

klon ST-3 celler og 1/8 tumorer i dyr transporterer den si-

RPL19-

PC-3M

klon # 2 celler). Oprindeligt alle tumorer var ens i størrelse. Efter 7 dage PC-3M

forældre- og PC-3M

kapløbet grupper udviklet større tumorer end to transfektante grupper (Figur 2D). Ved obduktion, 15 dage efter podning, en signifikant forskel (

s

0,001) var tydelig i de gennemsnitlige vægt af kontrol og

RPL19-

Knockdown tumorer (Figur 2E). PC-3M

forældrenes udstillet en lang række i tumor vægt, et dyr der producerer en tumor på 810 mg i 15 dage, den maksimalt tilladte af Project License. Omvendt andet dyr udviklede en tumor på kun 10 mg. Et lignende fænomen forekom inden for PC-3M

scramble gruppe med tumorer spænder fra 10 til 140 mg. De endelige vægte af PC-3M

forældrenes tumorer var ikke signifikant forskellige fra dem af PC-3M

scramble gruppe (Mann-Whitney U-test,

s

0,05). Således si-RNA undertrykkelse af

RPL19

påvirket størrelsen af ​​tumorerne genererede

in vivo Hotel (

s

0,05), men ikke på deres ventetid. Ingen mikrometastaser blev identificeret ved obduktion eller på efterfølgende histopatologiske undersøgelse af de udskårne væv.

Immunhistokemi af tumorxenografter opdaget stærkt udtryk for RPL19 protein i både PC-3M

forældre- og si-PC 3M

kapløbet celler (figur 2F). Knockdown cellelinjer lyddæmpere

RPL19-

PC-3M

klon ST-3 og si-

RPL19-

PC-3M

klon ST-1 udviste forholdsvis lille farvning, hvilket indikerer fortsatte undertrykkelse af

RPL19

gen i de fleste tumorceller. Påvisning af små mængder RPL19 protein i visse tumorceller anses for at repræsentere klonal variation som følge af fortsat lav-niveau ekspression af genet, snarere end dens samlede inhibering som identificeret ved qPCR af cellerne

in vitro

og resultaterne af de Western blotting studier. Mens ekspressionen af ​​mRNA og tilsvarende protein i prostata epitel er ikke altid samstemmende [39], tilsyneladende uoverensstemmelser mellem

in vitro

in vivo

undersøgelser kan skyldes til

i -vivo Salg virkninger af en omgivende stromale matrix påvirker tumorcelleadhæsion eller andre påvirkninger, herunder vækstfaktorer modulerende individuel lavt niveau genekspression [40] -. [42]

Sammenlignende genekspression profilering af si- RPL19-PC-3M

klon ST-3 celler

genom-dækkende udtryk profiler opnået fra DNA oligonukleotid microarrays (umodificeret Agilent human Genome 44K) blev anvendt til at identificere gener moduleret efter

RPL19

slå ned. Sammenligning af gener udtrykt af PC-3M

forældre- og PC-3M

kapløbet cellelinier viste ingen statistisk signifikante forskelle (

s

≥0.05), hvilket indikerer, at transfektion teknik ikke var ansvarlig for mærkbar off-target effekter, der kan skævhed de eksperimentelle data. I alt 916 DNA-sekvenser, der repræsenterer 768 gener, blev identificeret som differentielt udtrykt (

s

≤0.05, anvendes Benjamini og Hochberg korrektion multiple test). Af disse 404 blev forbedret og 364 nedreguleres. Inden for denne datasæt, blev 184 forskellige gener moduleret mindst fire gange, 62 er opreguleret og 122 nedreguleres. De 50 bedste differentielt udtrykte gener i disse to kategorier er sammenfattet i Støtte Information Borde S1 og S2 og grafisk (Figur 3). Expression data fra de arrays blev valideret af qPCR yde uafhængig kvantificerbare beviser for størrelse og retning af forandring af enkelte gener. Den iagttagelse, at kun 768 gener blev moduleret følgende

RPL19

knockdown, med niveauerne af mRNA for en bred vifte af proteiner enten opretholdes eller forhøjet, antyder, at ribosomale protein RPL19 differentielt er involveret i proteinsyntese i stedet påvirker alle cellulære proteinsyntese i en ikke-specifik måde.

Heat kort over top 50 gener opreguleret og Top50 gener nedreguleret følgende udtryk-profilering af mRNA udtrykt af si-

RPL19

-PC- 3M

klon ST-3 celler, når sammenlignet med PC-3M

forældrenes celler ved hjælp af PC-3M

kapløbet celler som fællesnævner. Hierarkisk klyngedannelse vises. Grøn angiver gener over-udtrykt i en prøve i forhold til at kode-transfekterede celler. Rød indikerer gener nedreguleret i prøven sammenlignet med scramble-transfekterede celler. Tilsvarende numeriske data er præsenteret i Støtte Information Borde S1 S2

Funktionel berigelse analyse identificerer nogle 20 Gene ontologi (GO) biologiske proces vilkår og tre molekylære funktion vilkår (underbyggende oplysninger S3), der skal signifikant associeret (

s

0,001) med knockdown (

s

0,001). Derudover 13 Kegg veje havde en signifikant overrepræsentation af gener udtrykkes forskelligt mellem

RPL19-

PC-3M

klon ST-3 og PC-3M

scramble (underbyggende oplysninger S4). Opfindsomhed vej analyse blev anvendt til at identificere væsentlige biologiske netværk og veje, hvor gener udtrykt forskelligt som følge af

PRKC-ζ

knockdown var involveret. Den øverste fem rangeret indbyrdes forbundne veje (Støtte Information Table S5) og de tre Gene ontologi (GO) molekylære funktion vilkår (underbyggende oplysninger S6) er meget signifikant (

s

≤10

-27) med hensyn til gener udtrykkes forskelligt efter

RPL19

knockdown.

ribosomprotein gener.

hypotese, at siRNA-induceret nedregulering af

RPL19

kan kompenseres ved modulering af andre ribosomale proteiner blev behandlet af vurdering af den relative ekspression af de mitochondriale store ribosomale protein gensekvenser (n = 71) og de cytoplasmiske store ribosomale protein gensekvenser (n = 136) for at opdage, om opregulering af et gen allerede udtrykt eller neoexpression af en tidligere tavs ribosomalt protein genet var indtruffet. Af sidstnævnte kohorte, 44 gener kodet kendte RP’er, 7 var RP-lignende og 5 var RP pseudogener. Antallet af sekvenser, der repræsenterer hvert gen varierede fra én (19 gener) til 14 (

RPL21

). RPL19 blev identificeret ved en enkelt sekvens. Ifølge SCOP (Structural Classification of Proteins, seneste udgivelse 9

th November 2010, https://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop) RPL19 er medlem af proteinet superfamilien af ​​oversættelse proteiner indeholdende den SH3-lignende tønde strukturelle område i klasse omfatter alle beta proteiner. Familien indeholder også ribosomale proteiner RPL14e, RPL21e og RPL24p og den C-terminale domæne af RPL2 (https://supfam.org/SUPERFAMILY/cgi-bin/scop.cgi?sunid=50104). Alternativt kunne RPL19 protein erstattes af RPL29 eller RPL39e, er strukturelt lignende medlemmer af α-helical gruppe af kugleformede RP’er med udvidede haler kan binde mRNA [43]. Selvom udsving skete i niveauerne af udtryk for individuelle RPL gensekvenser efter

RPL19

knockdown, disse var ikke signifikant, herunder at ribosomale protein genet

RPL23A

også placeret på kromosom 17q11.2. Kun udtryk for mitokondrie

MRPL42

var signifikant nedreguleret (

s

0,05). Nr forøget ekspression af enhver RP-genet blev detekteret. Således hæmning af

RPL19

med tab af RPL19 protein blev ikke opvejet af en anden RP gen. Omvendt virkningerne af reduktion

RPL19

kunne være medieret af kodningen-uafhængig funktion af genet eller dets pseudogendonorer mRNA [44].

glycosyltransferase gener.

Transformation af epitelceller fra en godartet til en malign fænotype er ofte ledsaget af strukturelle ændringer i oligosaccharid domæner af cellulære glycoproteiner og glycolipider [45]. Især ekspression af sialylerede og

β-1,6

forgrenet N-bundne oligosaccharider er nødvendige for cancercelleinvasion og metastase [46]. Det centrale enzym i denne proces er mannosyl (

α-1,6

-) – glycoprotein

β-1,6

N-acetyl-glucosaminyltransferase kodet af genet

MGAT5

og reguleres af signalvej RAS-RAF-MAPK. Sammen med

PTEN

,

MGAT5

regulerer membran dynamik PI3K /Akt signalering at fremme invasive maligne fænotype [47]. I tilfælde af at malignitet er reduceret efter manipulation af cellulær fænotype, er ændringer i celleoverflade-oligosaccharidstrukturer postuleret at forekomme. Sådanne ændringer, medieret af glycosyltransferaser kan godtgøres ved ændret ekspression af de tilsvarende gener. Af de 768 gener differentielt udtrykte, blev kun to glycosyltransferase gener påvirkes betydeligt efter

RPL19

knockdown (underbyggende oplysninger S7). I modsætning til det spektrum af glycosyltransferaser moduleret efter si-RNA knockdown af

PRKC-f-

i PC-3M celler [33], ingen ændring var tydelig i silayl- eller fucosyl-transferase gener. Imidlertid blev en 4 gange reduktion identificeret i niveauet af

MGAT4A

(

s

0,05), som koder for enzymet mannosyl (

α-1,3 -) –

glycoprotein

β-1,4-

Nacetylglucosaminyltransferase og er involveret i at mediere glykosylering af proteinerne kodet af

SLC43A3

(proteoglycan 2), SLC14A1 (urea transporter) og

SLC8A1

(natrium /calcium veksler), derved at styre deres celleoverfladeekspression. Faktisk blev alle tre sidstnævnte gener moduleret efter

RPL19

knockdown. Omvendt blev et 2~3 gange stigning identificeret i niveauet af

GALNACT-2

(

s Restaurant 0,05), som koder for enzymet chondroitinsulfat N-acetylgalactosaminyltransferase 2 og overfører N- acetylgalactosamin (GalNAc-) fra UDP-GaINAc [48] for at chondroitin, chondroitin sulfat, fortrinsvis til komplekse oligosacfocharides indeholder

β1 → 4

bindinger [49], som dem, der genereres af

MGAT4A

.

Ion-kanaler og tilhørende gener

maligne fænotype prostata epitelceller kan moduleres ved differentiel udtryk for ionkanaler [50] -. [52]. Undersøgelser fra dette laboratorium [52] og andre steder [53] har etableret et funktionelt forhold mellem spændingsstyrede ionkanaler og den invasive fænotype af prostatacancerceller [50]. Afhøring af udtrykket arrays afsløret flere ionkanaler og nogle tilhørende gener skal moduleres efter

RPL19

knockdown (Støtte Information Table S3). Kaliumkanaler viste en blandet reaktion. Spændingen-gatede K

+ kanal alfa og beta subunits (

KCNQ2

KCNAB2

) blev nedreguleret 3,5-og 2,25 gange, henholdsvis (

p

0,05 for begge). For aktiv ensretter K

+ kanaler (

KCNJ6

KCNJ12

) viste en blandet reaktion, bliver opreguleret 5,5 gange og nedreguleret 2,5 gange henholdsvis (

s

0,01 for begge). To spændingsstyrede Na

+ kanal gener (

SCN3a

SCN9A

) var begge opreguleret, 9 gange (

s

0,005) og 2,3 gange (

s

0,05), hhv. Endelig to spændingsstyrede Cl

– kanaler /Cl

– H

+ antiport transportører (

CLCN4

og

CLCN5

) var begge opreguleret, 2,1 og 1,8 gange henholdsvis (

s

0,05 for begge).

Andre gener og tilhørende netværk

Ingen af ​​de celle-cyklus kontrol gener, herunder. 31 vi tidligere viste at være forbundet med en høj sandsynlighed for prostatakræft progression [54] blev moduleret i deres ekspression efter knockdown eller

RPL19

. Heller ikke nogen af ​​de gener, der er anerkendt til at mediere apoptose blev moduleret i transfektanterne. Af de 19 sekvenser, der dækker caspasefamilien af ​​apoptose gener,

CASP1

blev nedreguleret -7 gange (

s

0,005) efter

RPL19

knockdown. Ekspressionen af ​​andre medlemmer af familien blev ikke ændret. Til støtte for array data, Western blotting bekræftet, at kløvede caspaser -3 og -9 blev ikke udtrykt enten i PC-3M

forældre- eller i si-

RPL19-

PC-3M

klone ST-3 transfektantcellerne. Disse resultater støtter forslaget om, at ændre udtryk for

RPL19

ikke påvirke hverken celle-cyklus eller de apoptotiske veje. Omvendt påvirkede de store veje efter

RPL19

knockdown inddrage netværk af gener, der regulerer homeostase og samspillet mellem de maligne celler og deres omgivelser (figur 4). Som et eksempel, udtryk af regulatoren genet

AGR2

vi identificeret til at være forhøjet i prostata kræft i aggressiv fænotype [55] blev nedreguleret ~11-fold (

s

0,02) efter

RPL19

knockdown. Produktet af dette gen bindes til receptoren ErbB3 og reguleres af forkhead DNA-bindende transkriptionelle regulatorer Foxa1 og Foxa2. Western blotting bekræftede afskaffelse af dette protein i Knockdown celler (figur 5), der understøtter array-data (Støtte Information Borde S1 S2). I modsætning hertil HOXB13 koder for en transskriptionsfaktor tilhører homeobox-gen familie, som vi viste sig at være en vævsspecifik biomarkør for benigne og maligne prostata epitel [56] var forhøjet -3-fold (

s Restaurant 0,001 ) efter

RPL19

knockdown.

Analyse af gener moduleret efter

RPL19

knockdown identificeret fem indbyrdes forbundne veje hovedsagelig påvirket (underbyggende oplysninger S5). Fire af disse omfatter gener, der koder MMP-enzymer (A); den ICAM1-integrin-kompleks (B); NFKB-komplekset (C) og PI3K regulering (D). Denne analyse bekræftede adskillige gener moduleret af nedreguleret udtryk for

RPL19

at være indbyrdes forbundet, understreger de mange veje for cross-talk mellem tilsyneladende forskellige biologiske processer.

I disse undersøgelser, sammenligningen blev foretaget med si-

PRKC-ζ

-PC-3M

T1-6 [33] og si-

FABP5

-PC-3M

klon 3 [62] RNAi-knockdown celler for at bekræfte, at ændringer i protein niveauer var specifikke for

RPL19

knockdown og ikke en del af en generel reaktion på gen-hæmning ved hjælp si-RNA. Efter farvning med primære antistoffer blev membraner igen farvet for beta-actin. Intensiteten af ​​dette bånd blev anvendt til at normalisere individuelle proteinniveauer. A. RPL19: Følger

RPL19

knockdown, niveauer reduceres til -5% af dem i PC-3M

forældrenes celler mens niveauer blev opretholdt i si-

PRKC-ζ-

PC -3

T1-6 og si-

FABP5

-PC-3M

klon 3 celler. B. S11A4: Niveauer blev opretholdt i alle cellelinjer, som er upåvirket af

RPL19

knockdown.