PLoS ONE: Protein Expression Profil af HT-29 Humane Colon Cancer Cells efter behandling med et cytotoksisk Daunorubicin-GnRH-III Afledte Bioconjugate

Abstrakt

Målrettet levering af kemoterapeutiske midler er en ny tilgang til behandling af cancer, hvilket giver øget selektivitet og nedsat systemisk toksicitet. Vi har for nylig udviklet en lovende lægemiddelafgivelsessystem, i hvilket anticancerlægemidlet daunorubicin (Dau) blev fastgjort

via

oxim binding til et gonadotropin-frigivende hormon-III (GnRH-III) derivat anvendes som en målsøgende del ( GlP-His-Trp-Lys (Ac) -His-Asp-Trp-Lys (Dau = AOA) -Pro-Gly-NH

2; GLP = pyroglutaminsyre, Ae = acetyl; AOA = aminooxyacetyl). Denne biokonjugat udøvet

in vitro

cytostatisk /cytotoksisk virkning på menneskers bryst, prostata og tyktarmskræft celler, samt betydelig

in vivo

tumorvækst hæmmende effekt på coloncarcinom bærer mus. I vores tidligere undersøgelser blev H-Lys (Dau = AOA) -OH identificeret som den mindste metabolit, der produceres i nærvær af rottelever lysosomale homogenat, som var i stand til at binde til DNA

in vitro

. For at få en dybere indsigt i virkningsmekanismen af ​​biokonjugatet, blev ændringer i proteinekspression profil HT-29 humane coloncancer-celler efter behandling med biokonjugatet eller frit daunorubicin undersøgt ved massespektrometri-baserede proteomics. Vores resultater viser, at flere stofskifte-relaterede proteiner, molekylære chaperons og proteiner involveret i signalering er forskelligt udtrykt efter målrettede kemoterapeutiske behandling, hvilket fører til den konklusion, at biokonjugatet udøver sin cytotoksiske virkning ved at gribe ind med flere intracellulære processer.

Henvisning : Schreier VN, Pethő L, Orbán E, Marquardt A, Petre BA, Mezo G, et al. (2014) Protein Expression Profil af HT-29 Humane Colon Cancer Cells efter behandling med et cytotoksisk Daunorubicin-GnRH-III Derivative Bioconjugate. PLoS ONE 9 (4): e94041. doi: 10,1371 /journal.pone.0094041

Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italien

Modtaget: November 9, 2013; Accepteret: 10 marts 2014; Udgivet: April 9, 2014

Copyright: © 2014 Schreier et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra universitetet i Konstanz (Zukunftskolleg, Projekt 879/08 og Young Scholar Fund, Project 462/12), den ungarske National Science Fund (OTKA NK 77.485 og K 104.045) og af rumænske nationale myndighed for videnskabelig forskning, CNCS -UEFISCDI (PN-II-RU-TE-2011-3-0038). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Receptor-medieret lægemiddelafgivelse er en lovende fremgangsmåde til behandling af cancer, som kan give øget selektivitet og nedsat systemisk toksicitet sammenlignet med klassisk kemoterapi (dvs. administration af frie anticancerlægemidler) [1] – [3] . I betragtning af at receptorer for visse regulatoriske peptider, såsom gonadotropin-frigivende hormon (GnRH, også kendt som luteiniserende hormon-frigivende hormon, LHRH), er stærkt udtrykt på en række forskellige cancerceller med relativt begrænset ekspression i normale væv, de repræsenterer vigtige molekylære mål i kræftbehandling [4]. Således kunne GnRH afledte peptider anvendes som målsøgningsdele til fastgørelse og efterfølgende specifikke afgivelse af kemoterapeutiske midler til GnRH-receptoren (GnRH-R) positive cancerceller. Efter deres internalisering af receptor-medieret endocytose er biokonjugateme generelt forarbejdes i lysosomer, hvilket fører til frigivelse af det frie lægemiddel eller til dannelsen af ​​lægemiddelholdige metabolitter [5], [6].

En lovende nativt GnRH-analog, der skal anvendes som en målsøgende del er lampret GnRH-III (GLP-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH

2), som binder til GnRH-R’er, har en ubetydelig endokrin virkning i pattedyr og udøver en direkte antiproliferativ virkning på både hormon-afhængige og -uafhængige cancerceller [7] – [9]. I vores tidligere arbejde, har forskellige antracyklin-GnRH-III afledte biokonjugater blevet designet, syntetiseret og biokemisk karakteriseret [10] – [12]. Et af de mest lovende lægemiddeladministrationssystemer udviklet til dato i vores laboratorier består af anticancerlægemidlet daunorubicin (Dau) fastgjort

via

en oxim binding til en GnRH-III-derivat, hvori Ser i stilling 4 blev erstattet af Lys (Ac) [13]. Daunorubicin (figur 1A) er et kemoterapeutisk middel, der interfererer med celleproliferation og division med mekanismer, såsom DNA indlejring, inhibering af topoisomerase II, dannelse af frie radikaler, lipidperoxidation, etc. Trods sine kliniske fordele, er administrationen af ​​fri Dau efterfulgt af toksiske bivirkninger, den mest alvorlige ene er kardiotoksicitet [14], [15]. Derfor bør fastgørelsen af ​​Dau til GnRH-baserede dele målretning tilvejebringe forøget selektivitet og nedsat systemisk toksicitet [12]. Vi har for nylig vist, at biokonjugat GnRH-III [

4Lys (AC),

8Lys (Dau = AoA)] (figur 1B) udøves

in vitro

cytostatisk /cytotoksisk virkning på human, prostata og tyktarmskræft celler med IC

50 værdier i lav uM rækkevidde. Det er vigtigt at nævne, at på HT-29 coloncancer-celler, biokonjugatet udøvede højere cytostatiske virkning (IC

50 = 7,4 ± 2,6 uM) end den forælder biokonjugat hvori Dau var knyttet til det native peptid hormon (IC

50 = 27,8 ± 4,2 pM). Desuden på coloncarcinom bærende mus, GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] udøvet et betydeligt

in vivo

tumorvækst hæmmende effekt (49,3% tumorvækst hæmning i forhold til den ubehandlede kontrolgruppe) [13]. Endvidere H-Lys (Dau = AOA) -OH blev identificeret som den mindste lægemiddelholdige metabolit produceret i nærvær af rottelever lysosomale homogenat, som var i stand til at binde til DNA

in vitro

[10], [13], resulterer der kunne bidrage til forståelsen af ​​den cytotoksiske effekt af biokonjugat.

(A) daunorubicin og (B) oxim bond-linked daunorubicin-GnRH-III derivat biokonjugat, GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)].

for at få en dybere indsigt i virkningsmekanismen af ​​GnRH-III [

4Lys (Ac ),

8Lys (Dau = AOA)] biokonjugat blev ændringer i proteinekspression profil HT-29 humane coloncancer-celler efter behandling med biokonjugatet eller frit Dau undersøgt ved massespektrometri-baserede proteomics. Vores resultater viser, at flere stofskifte-relaterede proteiner, molekylære chaperons og proteiner involveret i signalering er forskelligt udtrykt efter målrettede kemoterapeutiske behandling, hvilket fører til den konklusion, at biokonjugatet udøver sin cytotoksiske virkning ved at gribe ind med flere intracellulære processer.

Materialer og Methods

Materialer

RPMI-1640 medium, føtalt kalveserum (FCS) og 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev opnået fra Sigma-Aldrich (Budapest, Ungarn). Nonlinear immobiliseret pH-gradient strimler (IPG strimler, pH 3-10 NL, 17 cm) blev erhvervet fra Bio-Rad Laboratories (München, Tyskland), medens bicinchoninsyre (BCA) assaykit var en Pierce produkt (Rockford, USA). Lysepuffer (0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton-X100, 10 mM Tris-HCl pH = 7,4, 5 mM DTT og proteaseinhibitorer), rehydrering buffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% CHAPS, 40 mM Tris, 2% Servalyt 3-10), ækvilibreringspuffer (6 M urinstof, 2% SDS, 30% glycerol, 2,5 mM Tris-HCI) og løbebuffer (25 mM Tris, 192 mM glycin og 0,1% SDS) blev fremstillet i vores laboratorier.

Syntese og kemisk karakterisering af GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] Bioconjugate

biokonjugat GnRH-III [ ,,,0],

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] blev fremstillet ved en kombination af fastfase-peptidsyntese og kemoselektiv ligering i opløsning som tidligere beskrevet [13]. Kort fortalt blev aminooxyacetylated derivat af GnRH-III (GLP-His-Trp-Lys (Ac) -His-Asp-Trp-Lys (AOA) -Pro-Gly-NH

2) syntetiseret på en Rink amid MBHA resin ifølge Fmoc /tBu-strategi under anvendelse af en ortogonal beskyttelsesgruppe ordning for lysinresterne i positionerne 4 og 8 (protokol S1). Daunorubicin blev fæstnet

via

oxim binding til aminooxyacetylated GnRH-III-derivat, reaktion, som blev udført i opløsning (0,2 M natriumacetat, pH 5) (fig S1). Efter dens oprensning ved semipræparativ HPLC, biokonjugatet (GLP-His-Trp-Lys (Ac) -His-Asp-Trp-Lys (Dau = AOA) -Pro-Gly-NH

2) blev karakteriseret ved analytisk HPLC og massespektrometri (protokol S2 og S3 og figur S2)

Cells Salg

HT-29. (ATCC: HTB-38) human colon carcinoma celler blev holdt i RPMI-1640 medium indeholdende 10% FCS , L-glutamin (2 mM) og gentamicin (160 ug /ml). De cellekulturer blev opretholdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2.

In vitro

cytotoksiske effekt

in vitro

cytotoksisk virkning af GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] biokonjugat og gratis Dau blev bestemt ved MTT-assay. Et antal på 3 × 10

3-celler pr brønd blev udpladet på plader med 96 brønde. Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C blev celler behandlet i 6, 24, 48 og 72 timer med biokonjugatet eller frit Dau opløst i serumfrit medium (koncentrationsområde: 2,6 × 10

-4-10

2 uM). Celler behandlet med serum-frit medium for de samme tidsperioder blev anvendt som kontrol. Derefter blev MTT-opløsning tilsat til hver brønd. Efter 3,5 timers inkubation blev lilla krystaller dannet ved mitochondrial dehydrogenase enzym af levende celler. Celler blev centrifugeret i 5 min ved 1000 g, og supernatanten blev fjernet. Krystaller blev opløst i dimethylsulfoxid og den optiske densitet (OD) blev målt ved λ = 540 og 620 nm med en ELISA-læser (Labsystems MS læser, Finland). OD

620 blev trukket fra OD

540 og procentdelen af ​​cytotoksicitet blev beregnet ved hjælp af følgende ligning: hvor OD

behandlet og OD

kontrol svarede til de optiske tætheder af behandlede og kontrol celler. Cytotoksicitet% blev plottet som funktion af koncentration, monteret på en S-formet kurve og IC

50 værdi blev fastlagt på grundlag af denne kurve. IC

50 repræsenterede koncentrationen af ​​biokonjugat eller Dau kræves for at opnå 50% hæmning

in vitro

.

Udarbejdelse af cellelysater

For at forberede cellelysaterne , 5 × 10

5 HT-29 humane coloncancer-celler per brønd blev udpladet på plader med 6 brønde. Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C blev cellerne behandlet i 72 timer med biokonjugatet (ved en koncentration på 3 uM) eller frit Dau (ved en koncentration på 0,15 uM). Celler behandlet med celledyrkningsmedium for samme periode blev anvendt som kontrol. Efter inkubation blev cellerne centrifugeret i 5 min ved 1000 rpm, vasket med phosphatbufret saltvand, pH = 7,3 og derefter et volumen på 300 pi lysepuffer blev sat til hver brønd. Prøver blev inkuberet i 30 minutter på is og derefter de isolerede proteinblandinger blev centrifugeret ved 16000 g i 20 minutter ved 4 ° C. Indholdet af den opløselige fraktion protein blev bestemt ved BCA-assay ifølge producentens anvisninger.

Protein Separation ved todimensional-natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (2D-SDS-PAGE)

Fra cellelysaterne, proteinerne (500 ug /prøve) blev først udfældet ved fem volumener iskold acetone ved -28 ° C i 4 timer. Efter deres solubilisering i rehydrering buffer indeholdende 0,6% dithiothreitol (DTT), passivt rehydrering på 17 cm ulineære IPG strips (pH 3-10) blev udført i 14 timer ved stuetemperatur. Det isoelektriske fokusering (IEF) udførtes under anvendelse af en Bio-Rad Protean IEF celle instrument og følgende parametre: (i) 0-150 V i 3 min, (ii) 150 V i 30 minutter, (iii) 150-300 V i 15 min, (iv) 300 V i 30 minutter, (v) 300-3500 V i 150 min, (vi) 3500 V i 12 timer. For den anden dimension blev hver IPG strimmel først inkuberet i 20 min i ækvilibreringspuffer indeholdende 1% DTT og i yderligere 20 minutter i ækvilibreringsbuffer indeholdende 2,5% iodacetamid (IAA). Strimlerne blev derefter anbragt på en 12% SDS-gel og elektroforese blev udført i to trin: den strøm blev først indstillet til 25 mA /gel til -30 minutter og derefter til 40 mA /gel, indtil sporing farvestof nåede den anodiske del af gelen. Efter dette separationstrin blev proteinerne foranstillet i 1 time med 12% trichloreddikesyre og farvet natten over med Coomassie Brillant Blå G-250 opløsning. Efter affarvning baggrunden med 25% methanol i vand (v /v), gelerne blev scannet med en GS-800 kalibreret imaging densitometer (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munchen, Tyskland) ved anvendelse af QuantityOne software. For hver prøve blev tre replikat 2D-geler forholdsvis analyseret ved hjælp af PDQuest 8.0 software (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Tyskland), som tillod automatisk detektion med manuelle rettelser og kvantificering af protein pletter. Betydningen af ​​forskelle mellem proteinpletter blev bedømt ved t-test og en p-værdi på under 0,05 blev betragtet som signifikant. Supplerende udvælgelseskriterium var en fold ændring højere end to.

In-gel tryptisk fordøjelse

Valgte proteinpletter blev manuelt udskåret og udsat for in-gel tryptisk fordøjelse som tidligere rapporteret [16]. Kort fortalt, affarvning af proteinpletterne blev opnået ved at udføre følgende trin, som blev gentaget indtil gelstykkerne var gennemsigtige: (i) inkubation af gelen stykker med acetonitril-Milli-Q (/v 3:02 v) Opløsningsmiddelblanding for 30 min; (Ii) tørring under anvendelse af et SpeedVac (Eppendorf AG, Tyskland) og (iii) rehydrering med 20 mM ammoniumbicarbonat (pH 8,0) i 15 min. Efter dette, en frisk fremstillet trypsin-opløsning (12,5 ng /pi sekventeringskvalitet modificeret trypsin (Promega, Madison, WI, USA) i 20 mM ammoniumbicarbonat, pH 8,0) blev tilsat til den tørrede gel stykker og inkuberet ved 4 ° C i 45 min. Derefter blev trypsin opløsning erstattet med 20 mM ammoniumbicarbonat (pH 8,0) og inkuberet ved 37 ° C i 12 timer. De tryptiske peptider blev ekstraheret fra gelen med en blanding af acetonitril-0,1% TFA i Milli-Q-vand (03:02, vol /vol) ved stuetemperatur (3 x 60 min).

massespektrometrianalyse og protein Identification

Tryptiske peptidblandinger blev analyseret ved omvendt fase væskekromatografi-nanospray tandem-massespektrometri (LC-MS /MS) under anvendelse af en LTQ-Orbitrap massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Tyskland) og en Eksigent nanoHPLC (CA, USA). Egenskaberne ved omvendt fase LC-søjle var 5 um, 200 Å porestørrelse C18 harpiks i en 75 um i.d. x 10 cm langt stykke af kvartsglas kapillar (Hypersil Gold C18, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Tyskland). Efter injektion af prøven blev søjlen vasket i 5 minutter med 90% eluent A (0,1% myresyre i vand) og 10% eluent B (0,1% myresyre i acetonitril). Peptiderne blev elueret under anvendelse af en lineær gradient af 10-50% eluent B i 25 minutter og derefter 50-80% eluent B i 5 min, ved en strømningshastighed på 300 nL /min. Den LTQ-Orbitrap massespektrometer blev drevet i et data-afhængig tilstand, hvor hver fulde MS scanning blev efterfulgt af fem MS /MS scanninger, hvor de fem mest rigelige molekylære ioner blev dynamisk udvalgt og fragmenteret ved kollision-induceret dissociation (CID) ved hjælp af en normaliseret kollisionsenergi på 35% i LTQ ionfælde. Dynamisk udelukkelse var tilladt. Tandem massespektre blev søgt mod SwissProt-protein databasen ved hjælp Mascot (Matrix Science) med følgende parametre:. “Trypsin” spaltning med én savnede spaltning, cystein alkylering af iodacetamid som en konstant ændring og methionin oxidation som en variabel modifikation

Resultater og diskussion

Optimering af Cell behandling betingelser med Bioconjugate og gratis Daunorubicin

de celle behandling betingelser (dvs. inkubationstid og koncentration) med GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] biokonjugat og gratis Dau blev valgt på baggrund af

in vitro

cytotoksicitetsdata. HT-29 human coloncancer-celler blev behandlet enten med biokonjugatet eller frit Dau i forskellige koncentrationer til 6, 24, 48 og 72 t. Gratis Dau udøvede en cytotoksisk effekt selv efter 6 timer, hvilket var mere udtalt med tiden. Den laveste IC

50 værdi (0,26 uM) blev bestemt efter 72 timers inkubation. I modsætning hertil biokonjugat var cytotoksiske først efter 72 timer (IC

50 = 11,5 uM); derfor blev behandlingen på 72 t benyttes ved senere proteomics undersøgelser. De valgte celle behandling koncentrationerne var under IC

50-værdier, nemlig 0,15 uM gratis Dau og 3 uM til biokonjugat. Det er vigtigt at bemærke de forskellige IC

50-værdier og dermed forskellige cytotoksiske egenskaber af fri og konjugeret Dau, der kunne forklares ved deres mekanismer cellulær optagelse, nemlig passiv diffusion i tilfælde af gratis Dau

vs.

receptormedieret endocytose, som efterfølges af intracellulær forarbejdning af GnRH-III [

4Lys (AC),

8Lys (Dau = AOA)] biokonjugat.

Ændringer i Protein Expression Profile af humane HT-29 coloncancer-celler efter kemoterapeutiske behandling

efter optimering af behandlingsbetingelser, HT-29 human coloncancer-celler blev behandlet i 72 timer med GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] biokonjugat eller gratis Dau. Cellelysater blev fremstillet ifølge protokollen beskrevet i Materialer og metoder sektion. Indholdet af supernatantfraktionerne protein blev bestemt ved BCA-assay og det var i gennemsnit 2,34 mg /ml i de ubehandlede celler, der anvendes som kontrol, 2,94 mg /ml for Dau-behandlede og 3,18 mg /ml i Bioconjugate-behandlede celler.

Proteiner blev derefter adskilt ved 2D-gelelektroforese under anvendelse af 3-10 ulineære IPG strips og 12% geler. Efter Coomassie farvning blev gelen mønstre sammenlignet ved anvendelse af PDQuest 8.0 software. Forskelligt udtrykte proteiner blev udsat for i-gel tryptisk fordøjelse, efterfulgt af nanoLC-tandem massespektrometrisk analyse af de tryptiske peptidblandinger og databasesøgning. I figur 2 er de analyserede proteiner betegnet med en pil og vist kun om kontrol gel. De proteiner, der findes at være anderledes udtrykt efter målrettet kemoterapeutiske behandling (fold forandring 2; p 0,05; tabel 1 og tabel S1) kan klassificeres i følgende funktionelle kategorier: (i) molekylære chaperons, (ii) stofskifte-relaterede proteiner og (iii) proteiner involveret i signalering.

(A) ubehandlede, (B) Bioconjugate-behandlede og (C) daunorubicin-behandlede cancerceller. Vises kun om kontrol gel, pile og spot angiver de væsentligt forskellige protein pletter.

Blandt molekylære chaperoner, udtryk for varme chok 70 kDa protein 1A /1B (Hsp70) blev fundet at være signifikant nedsat efter behandling med GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] biokonjugat, mens gratis Dau havde nogen mærkbar virkning på dens udtryk i HT-29 humane colon cancerceller sammenlignet med ubehandlede celler (proteinplet P1). Tidligere rapporter har indikeret, at stress-induceret Hsp70 er en molekylær chaperone marginalt udtrykt i tryksvage normale celler, men overudtrykt i forskellige typer af kræftceller. Desuden har forhøjet ekspression af Hsp70 i cancerceller blevet forbundet med sygdomsprogression, metastase, modstandsdygtighed over for kemoterapi og generelt dårlig patient prognose. Disse funktioner kan forklares ved dets anti-apoptotiske egenskaber, hjælper cellerne til at overleve stressende forhold, såsom virkningen af ​​kemoterapeutiske midler [17] – [19]. Nedreguleringen af ​​HSP70 har vist sig at inhibere celleproliferation og inducere apoptose. Således Hsp70 er blevet foreslået som en vigtig molekylære mål i kræftbehandlingen og der gøres en indsats for at udvikle Hsp70 modulatorer (fx små molekyler hæmmere) [20] – [22]. I vores arbejde, har behandlingen af ​​HT-29 humane coloncancer-celler med en enkelt dosis af frit Dau ikke påvirker ekspressionen af ​​Hsp70-protein. Interessant fastgørelsen af ​​Dau til en GnRH-III-derivat anvendes som en målsøgende del resulterede i en biokonjugat med inhibitoriske egenskaber på Hsp70 (tabel 1).

Et andet protein med chaperonaktivitet, som viste sig at være anderledes udtrykt i HT-29 celler efter deres behandling med GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] biokonjugat, var Calreticulin (protein spot P2). Konsekvenserne af dette protein i kræft er for nylig blevet revideret af Zamanian

et al.

[23]. Dets overekspression er blevet rapporteret i forskellige typer af cancerceller (fx bryst, blære, esophageal, pancreascancer, coloncancer, gastrisk cancer, etc.) og fundet at være associeret med øget invasion, metastase og dårlig prognose [23]. I betragtning af disse tidligere resultater, kunne Calreticulin også repræsentere en kræft terapeutisk target, hvis reduceret udtryk kan give en terapeutisk fordel. I den foreliggende undersøgelse, i modsætning til behandling med frit Dau, som ikke havde nogen signifikant virkning på Calreticulin ekspression biokonjugatet udøvede en inhiberende virkning (dvs. i forhold til de ubehandlede celler, i biokonjugatet behandlede dem niveauet af Calreticulin var i gennemsnit fire gange lavere; se tabel 1)

sammenlignet med ubehandlede og Dau-behandlede HT-29 coloncancer-celler, behandling med biokonjugatet resulterede i nedsat ekspression af protein (PDI), et multifunktionelt protein. som spiller en vigtig rolle i proteinfoldning ved at katalysere dannelsen, brydning og omlejring af intramolekylære disulfidbroer (proteinplet P3). PDI er kendt for at fungere som en chaperone, der inhiberer aggregeringen af ​​ukorrekt foldede proteiner. Endvidere har det vist sig, at ekspressionen af ​​PDI er forhøjet i cancerceller, og dette protein er blevet foreslået som en biomarkør for visse typer af kræft, såsom tyktarmskræft eller brystkirtler tumorigenese [24], [25]. Desuden Goplen

et al

. har vist, at PDI var stærkt udtrykt på invasive gliomceller, spiller en vigtig rolle i tumorcellemigration og invasion, handlinger, der kan effektivt inhiberes af en PDI monoklonalt antistof, samt bacitracin [26].

Ud over molekylære chaperoner, blev ekspressionen af ​​stofskifte-relaterede proteiner, såsom UDP-glucose-6-dehydrogenase (UGDH) påvirket af den kemoterapeutiske behandling (protein spot P4). Mens gratis Dau havde en positiv indflydelse på UGDH ekspression, anvendelse af biokonjugatet havde en hæmmende virkning. Sidstnævnte kan bidrage til cancerterapi, eftersom UGDH antagonister er blevet foreslået som nyttige terapeutiske midler [27], [28]. Dette er baseret på den betragtning, at forhøjede glycosaminoglycan formation (f.eks hyaluronan), hvori UGDH spiller en central rolle, er involveret i en række humane sygdomme, herunder tumor progression [29].

Både biokonjugatet og fri Dau påvirkede signifikant ekspression af epidermal fedtsyre-bindende protein (E-FABP) (protein spot P5). De FABPs er multifunktionelle proteiner involveret i lipidmetabolisme, men også i modulering af genekspression, vækst og overlevelse veje samt inflammatoriske og metaboliske reaktioner [30]. Endvidere er blevet omformet FABP ekspressionsmønstre beskrevet for forskellige typer af kræft, hvilket antyder, at FABPs spiller en vigtig rolle i carcinogenese. For eksempel i en nylig undersøgelse fra Junqin Li

et al.

Det er blevet konstateret, at E-FABP, samt Lever-FABP og hjerte- eller Muscle-FABP, der er involveret i udviklingen af ​​invasiv duktalt brystkræft, da deres niveauer blev signifikant forhøjet i duktalt infiltrerende carcinoma i forhold til fibroadenoma [31]. Øget ekspression af E-FABP blev også påvist i endometriecancer og kemoterapi bugspytkirtelkræft cellelinjer [32], [33]. Således kan E-FABP repræsentere en anden molekylære mål i kræftbehandling

Selvom det ikke er væsentligt påvirket af kemoterapeutiske behandling, udtryk for Ran-specifikke GTPase-aktiverende protein. (Også kaldet Ran-bindende protein 1; RanBP1) (protein spot P6) faldt efter behandling med biokonjugatet (2,21 gange ændring, p = 0,05). Ran er en lille GTPase, der fungerer som en molekylær omskifter ved binding til enten GTP eller BNP. Et væsentligt regulator af denne proces er Ran-specifik GTPase-aktiverende protein (RanBP 1), som også katalyserer GTP hydrolyse af Ran. Det har vist sig, at løb og løb bindende proteiner er involveret i en lang række fundamentale cellulære processer (f.eks nucleocytoplasmic transport, mitosespindelen samling, nuklear kappe og kerneporen kompleksdannelse) samt i celledød, celleproliferation, celledifferentiering og malign transformation (se [34] for gennemgang). Desuden er det blevet rapporteret, at ekspressionen af ​​Ran og RanBP1 øges i forskellige typer af kræft, og at ophævelsen af ​​RanBP1 kan føre til celledød. Tilsammen disse resultater er det blevet foreslået, at både løb og løb-specifik GTPase-aktiverende protein er gode kandidater som molekylære mål i cancerterapi [34], [35].

I forhold til den ubehandlede HT-29 colon cancerceller, ekspressionen af ​​guanin nukleotid-bindende protein subunit beta-2-like 1 (GNB2L1, også kendt som receptor for aktiveret protein kinase C 1, RACK1) (protein spot P7) blev påvirket af behandlingen med biokonjugatet, men ikke signifikant (2,25 gange ændring; p = 0,0773). Imidlertid ekspressionen af ​​dette protein var signifikant forskellig i biokonjugatet

vs.

Dau behandlede celler (p = 0,0113), detekteres en lavere mængde i biokonjugatet behandlede celler. GNB2L1 har vist sig at spille en afgørende rolle i flere intracellulære signaltransduktionsveje. Med hensyn til dens mulige konsekvenser i udviklingen af ​​kræft og progression, er det blevet påvist, at RACK1 fremmer bryst carcinom proliferation og invasion /metastase

in vitro

in vivo

og dens udtryk er forbundet med dårlig prognose. Endvidere reduktion af RACK1 ekspression førte til inhibering af celleproliferation

in vitro

[36]. Lignende resultater er også blevet rapporteret i forbindelse med andre typer cancer, såsom ikke-småcellet og coloncarcinom [37].

Som konklusion behandling med daunorubicin-GnRH-III-derivat biokonjugat medført ændringer i proteinet ekspressionsprofilen af ​​HT-29 coloncancer-celler. Især molekylære chaperons, stofskifte-relaterede proteiner og proteiner involveret i signalering blev påvirket af den målrettede kemoterapeutiske behandling, bliver deres udtryk nedreguleret i Bioconjugate behandlede celler i forhold til de ubehandlede og Dau-behandlede dem. Tidligere undersøgelser har demonstreret konsekvenserne af disse proteiner i cancer, hvilket indikerer, at deres nedregulering kunne være af terapeutisk fordel (fx Hsp70, disulfidisomeraseproteinet osv). Nylige fremskridt i cancerterapi har foreslået vigtigheden af ​​at målrette mere end ét protein eller signaleringsvejen. En mulig fremgangsmåde til at opnå dette kan målrettes cancerkemoterapi. På baggrund af vores resultater, kan det konkluderes, at GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] biokonjugat udøver sin cytotoksiske virkning på HT-29 tyktarmscancerceller ved at gribe ind flere intracellulære processer og repræsenterer en lovende målrettet kemoterapeutisk middel.

Støtte Information

Figur S1.

Syntese af oxim bond-linked daunorubicin-GnRH-III derivat biokonjugat

doi:. 10,1371 /journal.pone.0094041.s001

(TIF)

Figur S2.

Kemisk karakterisering af GnRH-III [

4Lys (AC),

8Lys (Dau = AOA)] biokonjugat. (A) analytisk HPLC profil og (B) ESI-ion trap massespektrum. Opsplitning af glycosidbindinger under massespektrometriske betingelser, der fører til tab af daunosamin, er angivet ved en stjerne

doi:. 10,1371 /journal.pone.0094041.s002

(TIF)

tabel S1. .

Karakteristik af de identificerede proteiner med ændret udtryk på grund af den kemoterapeutiske behandling af HT-29 tyktarmscancerceller

doi: 10,1371 /journal.pone.0094041.s003

(DOC)

protokol S1.

Syntese af aminooxyacetylated-GnRH-III derivat

doi:. 10,1371 /journal.pone.0094041.s004

(DOC)

protokol S2.

Højtryksvæskekromatografi (HPLC)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0094041.s005

(DOC)

protokol S3.

Massespektrometrisk analyse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0094041.s006

(DOC)